Dna甲基化的检测探针、检测方法及检测试剂盒的制作方法[0002]随着人类基因组计划的完成，下ー个重要任务之一就是解密遗传系统，即人体细胞在生长过程中是如何运用遗传物质来决定某一特定基因在何时何地得到表达。DNA甲基化因其能影响基因表达的遗传状态，已成为表观遗传系统中的ー个重要部分。哺乳动物的DNA甲基化大多发生在CpG双核苷酸中胞嘧啶上，即在胞嘧啶的嘧啶环上5号碳位置加入甲基。在正常细胞中，甲基化主要发生在重复的基因组区域，包括遗传元件和卫星脱氧核苷酸，然而与基因启动子和外显子相关的CpG岛屿通常是没有甲基化的。但是在这些区域上突变性的DNA甲基化能导致癌症抑制基因的转录沉默，这种突变性的DNA甲基化可以作为各种疾病包括癌症的标志。CpG岛屿上特定区域的甲基化可能与特定类型的癌症相关。因此，人类基因组中任ー给定位置上DNA甲基化的准确定量对于人类癌症的早期治疗是非常重要的。[0003]传统的已有多种用于分析单个CpG位置或短序列中DNA甲基化的检测方法。甲基化特异性的PCR (MSP)开启了将聚合酶链反应(PCR)用于甲基化分析的大门，但由于MSP的分析结果是通过观察凝胶电泳的现象，导致MSP仅能提供实验的定性分析而非定量分析。荧光标记实时监测PCR和甲基化特异性的量子点的荧光共振能量转移(MSq-FRET)等方法都需要精密控温的PCR仪，且一般需要使用荧光染料分子标记的探针，大大加重了实验成本。结合亚硫酸盐的限制性消化分析方法(COBRA)给定量且灵敏的DNA甲基化的检测提供了另ー种选择，但是COBRA的前提条件是分析样品中要有甲基化敏感性的限制性消化酶的酶切位点。基于表面增强拉曼光谱法和单核苷酸扩增方法，由于较低的灵敏度导致应用受限。
[0004]基于此，有必要提供一种灵敏度高、检测成本低的DNA甲基化检测探针及检测方法。[0005]ー种DNA甲基化检测探针，包括其5’端和3’端用干与甲基化DNA互补配对的序列以及中间部分的用于引发超分支滚环扩增反应的特异性序列，其中，检测探针3’端的最后ー个碱基为鸟嘌呤，所述鸟嘌呤与甲基化DNA中部的甲基化胞嘧啶配对，且检测探针3’端的序列与甲基化DNA的自中部所述甲基化胞嘧啶至3’端的序列反向互补配对，检测探针5’端的序列与甲基化DNA的自中部所述甲基化胞嘧啶的临近脱氧核苷酸至5’端的序列反向互补配对。[0006]在其中一个实施例中，所述检测探针的DNA序列是SEQ ID NO:1。[0007]具有SEQ ID NO:1基因序列的检测探针可以应用在人类非小细胞肺癌细胞系基因组甲基化程度的检测领域。
[0008]该DNA甲基化检测探针，包括能与甲基化DNA互补的3’端和5’端以及中间部分的用于引发超分支滚环扩增(HRCA)反应的特异性序列，且检测探针的3’端的最后ー个碱基对应甲基化DNA中部的甲基化胞嘧啶，能特异性的与甲基化DNA中部的甲基化胞嘧啶通过三个氢键的形成而互补配对。若待测DNA为甲基化DNA，则其能与检测探针完全互补配对，且互补配对后导致检测探针的3’端和5’端靠近，在后续DNA连接酶的作用下，检测探针的3’端和5’端连接形成环状DNA，从而不会被DNA外切酶III和I消化；而非甲基化的DNA经过亚硫酸氢盐处理，胞嘧啶环上4号位置的氨基被羰基取代，即胞嘧啶已经转变成尿嘧啶，然而尿嘧啶不能与鸟嘌呤互补配对，非甲基化的DNA不能与检测探针完全互补配对，没有环状DNA的形成，从而所有DNA都被DNA外切酶III和I消化。环状DNA可以通过后续的HRCA反应及信号检测定量分析待测DNA的甲基化程度，由于HRCA具有超高扩增能力(IO9倍信号放大)，从而保证了检测的超高灵敏度要求。此外，使用该探针，检测过程中不需要使用昂贵的荧光标记的探针或进行PCR扩增，检测的成本大大降低。
[0009]ー种DNA甲基化的检测方法，包括如下步骤:用亚硫酸氢盐处理待测DNA，使所述待测DNA中未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶；向亚硫酸氢盐处理后的待测DNA中加入上述检测探针进行DNA融合反应；向融合反应得到的产物中加入DNA连接酶，进行连接反应；使用超分支滚环扩增方法扩增上步骤得到的产物并进行光谱信号检测。
[0010]在其中一个实施例中，所述亚硫酸氢盐为亚硫酸氢钠或亚硫酸氢钾。
[0011 ] 在其中一个实施例中，还包括在融合反应后向融合反应后得到的产物中加入DNA消化液，消化未完全互补配对的DNA序列的步骤。
[0012]在其中一个实施例中，所述进行光谱信号检测是将超分支滚环扩增后的DNA产物与SYBR Green I荧光染料混合，在荧光光度计下检测混合物的发射波強度。
`[0013]通过将待测DNA与锁式探针融合，若待测DNA是甲基化DNA，则可以与锁式探针在DNA连接酶的作用下形成环状DNA，而非甲基化的DNA则不能与锁式探针互补配对；通过HRCA扩增后，环状DNA被大量扩增，从而能检测到荧光强度，而没有互补配对的序列则不能被扩增，从而使用上述检测方法可以较为方便的分析待测DNA是否甲基化，且由于HRCA具有超高扩增能力，检测的灵敏度得到保证，通过光谱分析，还具有定量的效果。检测过程中不需要使用昂贵的荧光标记探针或进行PCR扩增，检测的成本大大降低。且该检测方法对甲基化DNA没有酶切位点的要求，对于任ー给定位置的DNA甲基化程度检测吋，只需改变该检测探针的3’和5’端序列，使其与目标DNA序列互补，就能实现该位置DNA甲基化程度的检测，说明该方法有广泛应用性。
[0014]此外，还有必要提供一种灵敏度高、检测成本低的用于人类非小细胞肺癌检测的试剂盒。
[0015]一种人类非小细胞肺癌检测试剂盒，包括检测探针，所述检测探针的DNA序列是SEQ ID NO:1。
[0016]在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括超分支滚环扩增引物，所述超分支滚环扩增的正向引物的DNA序列和反向引物的DNA序列分别为SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4。
[0017]上述检测试剂盒中，检测探针具有能与人类非小细胞肺癌细胞系(H157)的甲基化DNA互补配对的3’端(13个碱基)和5’端(21个碱基)以及为引发HRCA反应的两个特异性序列(序列长度分别为25个和23个)，且检测探针的3’端的最后ー个碱基被设定为鸟嘌呤，能特异性的甲基化DNA中部的甲基化胞嘧啶通过三个氢键的形成而互补配对；若待测个体的细胞中该位置DNA有甲基化，则其能与检测探针互补配对，并导致检测探针的3’端和5’端靠近，在后续DNA连接酶的作用下，检测探针的3’端和5’端连接形成环状DNA ;而非甲基化的DNA经过亚硫酸氢盐处理，胞嘧啶环上4号位置的氨基被羰基取代，即胞嘧啶已经转变成尿嘧啶，然而尿嘧啶并不能与鸟嘌呤互补配对，从而非甲基化的DNA不能与检测探针互补配对，也没有环状DNA的形成。环状DNA再通过HRCA反应扩增，在扩增引物的存在下，引物的延伸和链置换不断发生，得到大量的长度不同的双链DNA产物，而这些产物通过荧光染料然后可以进行光谱定量检测出。由于HRCA具有超高扩增能力，检测的灵敏度得到保证，通过光谱分析，还具有定量的效果。检测过程中不需要使用昂贵的荧光标记探针或进行PCR扩增，检测的成本大大降低。



[0018]图1为甲基化DNA与检测探针的完全互补配对示意图；
[0019]图2为非甲基化的DNA与检测探针的部分互补配对示意图；
[0020]图3为ー实施方式的DNA甲基化的检测流程图；
[0021]图4为实施例1的检测流程示意图；
[0022]图5为连接反应的电泳验证图，变性的10%的聚丙烯胺按凝胶电泳用标准银染的结果图，跑道M是DNA标志，道1，2，3分别表示空白实验，IOnM未甲基化DNA和IOnM甲基化DNA的连接产物；
[0023]图6为为消化产物的电泳验证图，条件与图5中相同；
[0024]图7为实施例1中HRCA实验的条件优化，InM的甲基化DNA (虚线柱)和InM的未甲基化DNA (实线柱)随着引物浓度的变化得到的荧光强度变化图；
[0025]图8为实施例1中HRCA实验的条件优化，InM的甲基化DNA (虚线柱)和InM的未甲基化DNA (实线柱)随着dNTPs浓度的变化得到的荧光强度变化图；
[0026]图9为扩增反应的电泳验证图，使用的是SYBR Green I的琼脂糖凝胶电泳法，跑道与图5中表示的一致；
[0027]图10为不同浓度的甲基化DNA的荧光检测强度图；
[0028]图11为甲基化DNA的浓度与荧光强度的指数线性图，线性范围:lfmol/L到10pmol/L ；
[0029]图12为不同甲基化含量水平的荧光检测结果图；
[0030]图13为测量得到的甲基化含量水平与实际放入的甲基化含量水平的关系图；
[0031]图14为不同浓度的H157 (虚线柱)和H209 (实线柱)的基因组DNA与其荧光检测值的关系图；
[0032]图15为IOnM甲基化DNA (M)和未甲基化DNA (U)的荧光检测值。

[0033]下面结合附图及具体实施例对DNA甲基化检测探针、检测方法及检测试剂盒进行进ー步的说明。[0034]ー实施方式的DNA甲基化检测探针包括5’端和3’端的用干与甲基化DNA互补配对的序列以及中间部分的用于引发超分支滚环扩增反应的特异性序列，其中，检测探针3’端的最后ー个碱基为鸟嘌呤，与甲基化DNA中部的甲基化胞嘧啶配对，且检测探针3’端的序列与甲基化DNA的自中部甲基化胞嘧啶至3’端的序列反向互补配对，检测探针5’端的序列与甲基化DNA的自中部甲基化胞嘧啶的临近脱氧核苷酸至另5’端的序列反向互补配对。
[0035]该DNA甲基化检测探针3’端的最后ー个碱基对应甲基化DNA中部的甲基化胞嘧啶，能特异性的与甲基化DNA中部的甲基化胞嘧啶通过三个氢键的形成而互补配对。如图1所示，若待测DNA为甲基化DNA，则其能与检测探针完全互补配对，且互补配对后导致检测探针的3’端和5’端靠近，在后续DNA连接酶的作用下，检测探针的3’端和5’端连接形成环状DNA，不会被消化液消化。如图2所示，非甲基化的DNA经过亚硫酸氢盐处理，胞嘧啶环上4号位置的氨基被羰基取代，即胞嘧啶已经转变成尿嘧啶，然而尿嘧啶不能与鸟嘌呤互补配对，非甲基化的DNA不能与检测探针完全互补配对，没有环状DNA的形成，从而所有DNA都被DNA外切酶III和I消化。
[0036]环状DNA可以通过后续的HRCA反应及信号检测定量分析待测DNA的甲基化程度，由于HRCA具有超高扩增能力(IO9倍信号放大)，从而保证了检测的超高灵敏度要求。且该检测探针能与众多甲基化的DNA融合，兼容性好。此外，使用该探针，检测过程中不需要使用昂贵的荧光标记的探针或进行PCR扩增，检测的成本大大降低。
[0037]此外，本实施方式还提供了ー种DNA甲基化的检测方法，如图3所示，包括如下步骤:
[0038]步骤S310，用亚硫酸氢盐处理待测DNA，使待测DNA中未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶。
[0039]亚硫酸氢盐为亚硫酸·氢钠或亚硫酸氢钾等。
[0040]未甲基化的胞嘧啶被亚硫酸氢盐转化尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶则不能被转化。
[0041]步骤S320，向亚硫酸氢盐处理后的待测DNA中加入上述介绍的检测探针进行DNA
融合反应。
[0042]锁式探针(Padlock probe)是ー种较长的单链寡核苷酸片段，两个末端和目标毗邻互补，中间的一段连接序列对检测结果没有影响，可以作为通用引物的结合位点。从而锁式探针与DNA融合后，探针的两端毗邻接近，在后续DNA连接酶的作用下，可以连接起来形成环状DNA。在本实施方式中，锁式探针即为上述DNA甲基化检测探针。
[0043]步骤S330，向融合反应后得到的产物中加入DNA连接酶，进行连接反应。若待测DNA是甲基化DNA，则可以与锁式探针在DNA连接酶的作用下形成环状DNA ;而非甲基化的DNA则不能与锁式探针完全互补配对，没有环状DNA的形成。
[0044]步骤S340，向经消化处理得到的产物中加入DNA消化液，消化未完全互补配对的DNA序列，从而得到纯化的环状DNA。进行消化步骤主要是为了減少非连接DNA导致的扩增，以减少后续检测假阳性或其他DNA对实验结果的干扰。可以理解，在其他实施方式中，此步骤可以省略。步骤S350，使用超分支滚环扩增方法扩增上步骤得到的产物并进行光谱信号检测。
[0045]环状DNA可以通过后续的HRCA反应及信号检测定量分析待测DNA的甲基化程度，由于HRCA具有超高扩增能力(1O9倍信号放大)，从而保证了检测的超高灵敏度要求。
[0046]在本实施方式中，进行信号检测是将超分支滚环扩增后的DNA产物与SYBR GreenI荧光染料混合，在荧光光度计下检测混合物的发射波強度。
[0047]上述检测方法可以较为方便的分析待测DNA是否甲基化，且由于HRCA具有超高扩增能力，检测的灵敏度得到保证，通过光谱分析，还具有定量的效果。检测过程中不需要使用昂贵的荧光标记探针或进行PCR扩增，检测的成本大大降低。
[0048]进ー步，本实施方式还提供了一种人类非小细胞肺癌检测试剂盒，其包括检测探针，检测探针的DNA序列是SEQ ID NO:1。该探针用于检测人类非小细胞中DNA序列为SEQID NO: 2的甲基化DNA。
[0049]此外，该检测试剂盒还包括超分支滚环扩增引物，超分支滚环扩增引物的DNA序列分别为序列表中的SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4。
[0050]该检测试剂盒中的检测探针具有能与人类非小细胞肺癌细胞系(H157)的甲基化DNA互补配对的3’端(13个碱基)和5’端(21个碱基)以及为引发HRCA反应的两个特异性序列(序列长度分别为25个和23个)，且检测探针的3’端的最后ー个碱基被设定为鸟嘌呤，能特异性的甲基化DNA中部的甲基化胞嘧啶通过三个氢键的形成而互补配对；若待测个体的细胞中该位置DNA有甲基化，则其能与检测探针互补配对，并导致检测探针的3’端和5’端靠近，在后续DNA连接酶的作用下，检测探针的3’端和5’端连接形成环状DNA ;而非甲基化的DNA经过亚硫酸氢盐处理，胞嘧啶环上4号位置的氨基被羰基取代，即胞嘧啶已经转变成尿嘧啶，然而尿嘧啶并不能与鸟嘌呤互补配对，从而非甲基化的DNA不能与检测探针完全互补配对，也没有环状DNA的形成。
[0051]以下结合具体实施例验证上述检测探针及检测方法的可行性
[0052]实施例1
[0053]H157 (人类非小细胞肺癌细胞系)及H209 (人类小细胞肺癌细胞系)细胞系的甲基化DNA检测,如图4所示。
[0054]1、DNA提取及消化
[0055]1.1分别培养H157和H209两种细胞系。正常的H157细胞系中pl6启动子区域是高度甲基化的，而正常的H209细胞系中的这些区域是没有甲基化的。
[0056]培养条件:将两种细胞系分别置于含有10%牛血清白蛋白的DMEM培养液中，放置在加湿处理的含有5% 二氧化碳的37 °C培养箱中培养。
[0057]1.2 提取 DNA
[0058]用DNA提取试剂盒分别提取上述两种细胞系的基因组DNA，并采用分光光度计检测该DNA提取溶液在260纳米处的吸收值，换算出DNA浓度。 [0059]1.3用Pst I和BstE II两种限制性消化酶分别处理提取的DNA，以消化基因组DNA为较短的碱基片段，得到待测DNA。
[0060]在其他实施例中，细胞系中DNA的提取这个步骤可以省略，采用直接购买的方式获得甲基化的DNA和未甲基化的DNA。
[0061]2、亚硫酸氢钠处理待测DNA，使所述待测DNA中未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶。
[0062]处理条件为:1μ g待测DNA中加入至20μ L体积的浓度为0.35mol/L的氢氧化钠溶液中，37°C反应20分钟后，将一定体积的的亚硫酸氢钠溶液和对苯二酚加至上述溶液中使其终浓度分别为3.2mol/L和0.5mmOl/L，50°C反应16-18小时，然后使溶液过脱盐柱，回收DNA ;向回收的DNA中加入一定体积的氢氧化钠溶液，使其在50ii L的溶液中终浓度为
0.3mol/L，37°C反应15分钟，然后用醋酸氨将该溶液完全中和，最后在こ醇中沉淀，干燥得到DNA粉末。将得到的DNA粉末溶于超纯水中，于-20V保存备用。
[0063]3、连接反应
[0064]3.1根据待测DNA的序列设计锁式探针
[0065]在本实施例中，待测DNA的序列分别如下:
[0066]甲基化DNA 序列为:GAG GGT GGG GmCG GAC mCGmC GTG mCGC TmCGGmCG GCT G (SEQID NO:2)，其中，mC表示甲基化的胞嘧啶；
[0067]未甲基化DNA 序列为:GAG GGT GGG GCG GAC CGC GTG CGC TCGGCG GCT G (SEQID NO:5)。
[0068]设计的锁式探针的序列:CACGCG ATC CGC CCC ACC CTC ATT AGG TTACTG CGA TTAGCA CAA GCA CCA AGA GCA ACT ACA CGA ATT CCA ACCGCC GAA CG (SEQ ID NO:1)。
[0069]在本实施例中，为了增强检测的特异性，在锁式探针的序列上做了特别设计:锁式探针的总长为83个碱基，与甲基化DNA互补配对的5’端有21个碱基，3’端有13个碱基，中间成环部分49个碱基，这种两端互补配对的不对称序列结构，将有利于目的基因与锁式探针的结合；其次，锁式探针的3’端的最后ー个碱基被设定为鸟嘌呤，特异性与甲基化DNA的甲基化胞嘧啶通过三个氢键的形成而互补配对，而未甲基化DNA通过亚硫酸氢钠的处理，胞嘧啶环上4号位置的氨基被羰基取代，即胞嘧啶已经转变成尿嘧啶，不能与鸟嘌呤互补配对。`
[0070]在其他实施例中，锁式探针可以采用其他合理的设计方案，例如5’端的用于互补配对的序列长度不限于21bp，3’端的用于互补配对的序列长度也不限于13bp。锁式探针的设计只要满足实验要求即可。即确保锁式探针5’和3’端的序列分别与目的甲基化DNA的5’和3’的序列反向互补配对。
[0071]3.2连接反应的条件
[0072]将不同浓度的2L待测DNA与2L的lmol/L的锁式探针混合，制备20L的混合液，混合液中含有:20mmol/L Tris-HCl (pH 7.6)缓冲液，25mmol/L醋酸钾，10mmol/L醋酸镁，lmmol/L的烟酰胺腺苷二核苷酸和0.l%Triton X-100。95°C反应5分钟，然后加入12单位的Taq DNA连接酶，65 °C反应60分钟。
[0073]用亚硫酸氢盐处理待测DNA后，未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不发生变化，在连接反应中，甲基化的DNA能与锁式探针的两端完全互补配对，使锁式探针的3’端和5’端靠近，在连接酶的作用下，锁式探针的3’端和5’端连接起来，形成环状锁式探针。未甲基化的DNA由于序列有了重大区别，不能与锁式探针完全互补配对，因此3’端和5’端不能被连接酶连接起来，从而甲基化DNA与未甲基化DNA可以由此区分，由于锁式探针的环化连接特异性强，因此这种利用锁式探针的环化连接用于甲基化检测的方法具有高特异性。
[0074]3.3连接反应产物的验证
[0075]为了证明该方法的可行性，在本实施方式中，选用电泳实验来验证，如图5所示，图5为连接反应产物的标准银染的变性的10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，跑道M是DNA标志，泳道1、2、3分别表示空白实验、IOnM未甲基化DNA和IOnM甲基化DNA的连接产物。由于线性锁式探针比环状锁式探针跑得快，电泳图证明连接反应产物的存在，方法可行。
[0076]4、消化反应
[0077]4.1消化反应的条件
[0078]取IOL连接反应后的溶液与IOL消化液混合，37°C反应2小时，最后在95°C 10分钟失活。IOL消化液中含有lmmol/L的DTT，6.7mmol/L的氯化镁，67mmol/L的pH 9.5的甘氨酸-氢氧化钾缓冲液，10单位的DNA外切酶I和外切酶III。
[0079]DNA外切酶1和外切酶III能消化非环状DNA，但不能消化环状DNA，从而得到纯的环状锁式探针。在本实施例中，非环状DNA指的是甲基化DNA、未甲基化DNA及未发生连接反应的锁式探针。
[0080]4.2消化反应产物的验证
[0081]在本实施例中，选用电泳实验来验证，如图6所示是消化反应产物通过标准银染的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图，从图6看到，所有非环状DNA均被消化干净(图6中跑道I和2)，除了环状锁式探针(图6中跑道3)。环状锁式探针的存在进ー步证明了连接反应的可行性，同时为了減少后面的扩增反应中非连接特异性扩增的发生，进ー步提高特异性，外切酶的消化作用非常重要。
[0082]5、超分支滚环扩增反应
[0083]5.1根据锁式探针设计两条引物
[0084]引物I 序列(正向引物)为:3’CTT GTG CTA ATC GCA GTA ACC TAA T 5’ (SEQ IDNO:3)；
[0085]引物2 序列(反向引物)为:3，ACC AAG AGC AAC TAC ACG AAT TC 5，(SEQ ID NO:4)。
[0086]5.2超分支滚环扩增反应的条件
[0087]将IOL的消化反应产物与20L扩增溶液混合，63V反应I小吋。扩增溶液中含有:
0.05umol/L的引物I和引物2，400iimol/L的脱氧核苷三磷酸混合液和8个单位的Bst
DNA聚合酶。
[0088]如图7，随着两引物的浓度由lymol/L到0.05iimol/L的降低，甲基化基因与未甲基化基因的荧光强度的差值逐渐増大，因此，本实施例选定0.05 u mol/L为两种引物的最优浓度，因为较高浓度的引物，将会引起引物自身的二聚和非特异性的扩增。另外，如图8所示，随着dNTPs底物浓度由2 u mol/L到400 u mol/L的增加，甲基化基因与未甲基化基因的荧光强度的差值逐渐増大，因此本实施例选用400 u mol/L为dNTPs底物的最佳浓度。
[0089]5.3超分支滚环扩增反应产物的验证
[0090]在本实施例中，选用电泳实验来验证，如图9所示是超分支滚环扩增反应产物以SYBR Green I为染料的琼脂糖凝胶电泳图，从图9中跑道3可以看到，甲基化基因能通过环化锁式探针进而扩增得到大量的DNA产物，而空白实验(图9中跑道I)和未甲基化DNA (图9中跑道2)不能扩增，因而得不到产物。
[0091]6、检测
[0092]6.1检测条件
[0093]将30 ii L超分支滚环扩增反应后的溶液和IuLW SYBR Green I (20倍)混合，加去离子水至100 uし室温孵育10分钟，后用荧光光度计检测该溶液，荧光检测条件:激发光波长为488纳米，光谱采集范围为500-650纳米，在520纳米处计量其发射波強度。
[0094]6.2检测结果
[0095]DNA甲基化的高灵敏度的准确定量对于癌症的早期治疗是非常重要的。为了证明该方法的高灵敏性，本实施例研究了不同浓度的甲基化基因的荧光检测結果。如图10所示，随着甲基化基因浓度的増大，其荧光检测值也増大，且浓度与信号强度值成指数关系，即浓度的对数值与信号强度值成线性关系(如图11)，且线性关系覆盖4个数量级，由IfmoI/L到IOpmoI/L0线性关系式为=If = 34.54+102.981oglOC，其中If为荧光信号强度值，C为甲基化基因的浓度(费摩尔每升)。用此方程分析空白值加上3倍偏差值的荧光强度得到检测限为0.8费摩尔每升。这个检测限值比用金纳米的比色方法高出8个数量级，比用单碱基扩增的拉曼增强光谱得到的高3个数量级。 [0096]此外，本实施例还将甲基化基因与未甲基化基因以ー定比例混合得到的人工混合液，并对其甲基化程度做了检测。如图12，随着甲基化程度的増加，得到的荧光强度值也跟着増大。且如图13显示，检测得到的甲基化程度与实际加入的甲基化程度几乎吻合。并且，该方法能成功检测混合样品中0.01%的甲基化基，明显比下列方法得到的分辨率高:MALD1-MS质谱(5%)，基于量子点的荧光能量转移(1%)，阳离子共轭聚合电解质方法(1%)，甲基化特异的PCR (0.1%)，甚至可以和MS-qFRET (0.01%)相比。
[0097]在本实施例中，为了进一步验证上述检测方法的可靠性，对实际样品进行检测。用此方法考察了非小细胞肺癌细胞系H157和小细胞肺癌细胞系H209中pl6启动子区域片段中的六个CpG岛屿的甲基化情況。用本分析方法检测细胞系的实际样品时，本实施例在实验之前用限制性消化酶处理了基因组DNA，目的是为了防止在随后的试验中DNA的形成的超螺旋或超环化等二级结构。如图14所示，随着基因组DNA的量的增加,检测H157得到的荧光强度随之増大，而H209则保持不变，且H157的检测限为2ng。由此表明，本专利中的检测方法能较高灵敏度的检测肺癌细胞系中DNA甲基化的情況。
[0098]实施例2
[0099]特异性检测甲基化基因
[0100]早前的研究表明，pl6中的癌症抑制基因的甲基化将导致多种癌症。为了证明该方法的可行性，本实施例合成了一段DNA,序列与pl6中的一段癌症基因相同,序列为:GAGGGT GGG GmCG GAC mCGmC GTGmCGC TmCG GmCG GCTG (SEQ ID NO:2)，并对这段 DNA 的甲基化做了检测。如图15所示，由IOnM甲基化DNA得到的荧光强度值为698.8±25.3，比由IOnM未甲基化DNA得到的荧光强度值(30.2±5.5)高了 23倍，说明该方法能成功用于甲基化DNA的检测。
[0101]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。