一种适用于dna扩增技术的中药材基因组dna提取方法【技术领域】。[0002]1985年问世的PCR反应(聚合酶链式反应)是一种体外核酸扩增技术，因其具有敏感性高、特异性强、操作简便、重复性好，易于自动化的特点，已被广泛用于生命科学、医学、药学的各个领域，成为医药研究不可或缺的手段。除此之外，等温扩增技术包括Q复制酶反应(QBRA)、链置换扩增技术(SDA)、切口酶恒温扩增技术(NEMA)、转录依赖的扩增技术(TASTMA、3SR、NASBA)、解旋酶扩增技术(HAD)、滚环扩增技术(RCA)、环介导等温扩增技术(LAMP)、单引物等温扩增技术(SPIA)等简化了对仪器和实验室条件的要求、缩短了检测时间，在中药鉴定领域具有很好的发展前景。(Walker GT, Fraiser MS, Schram JL, etal.Strand displacement amplification 「is othermal, in vitro DNA amplificationtechnique.Nucleic Acids Research,1992,20 (7):1691-1696 ;Notomi T, Okayama H,Masubuchi H,ct al.Loop「mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic AcidsResearch,2000,28(12):63.)[0003]DNA扩增技术的第一步是模板DNA的制备，即样品中DNA的提取。长期以来DNA的提取一直是PCR检测过程中最耗时，繁琐的步骤，严重影响了检测的速度。对于中药研究来说，中药材品种繁多，各品种差异大，基因组DNA提取的工作量非常巨大。传统的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法或SDS (十二烷基硫酸钠)法通过使用CTAB或SDS裂解细胞，酚/氯仿抽提蛋白质，异丙醇沉淀DNA，乙醇洗涤，适用于大多数中药材基因组DNA的提取。然而，CTAB法或SDS法流程繁琐、操作复杂，一般需要5小时以上才能提取出DNA。并且操作过程中使用了大量的酚/氯仿、β_巯基乙醇、异丙醇的有机溶剂，有损于操作人员的身体健康。
[0004]本发明的目的是提供一种可大规模、简单快速的中药材基因组DNA提取方法，用于DNA扩增技术鉴别中药材及研究遗传多样性。本发明通过以下技术方案实现:[0005](I)取供试品中药材20-50mg，置于粉碎机中研磨至可过40目筛，放入2.0mL的微量离心管内。[0006](2)加入 200-400 μ L、0.25-0.6mol/L 的氢氧化钠溶液，混匀 2_3min。
[0007](3)加入 1600 μ LU00mmol/L 的 Tris-HCl 溶液(pH = 8.0)，温和混匀。
[0008](4) 12000rpm 下离心 2min。
[0009](5)取 50 μ L 上清至一新的 1.5mL 离心管，加入 450 μ L、100mmol/L 的 Tris-HCl 溶液(pH = 8.0)。取I μ L上清，加入PCR反应体系内进行PCR扩增。
[0010]本发明的有益效果主要体现在:(I)本方法具有简单、快速、节约试剂及耗材、污染小等特点，可用于规模化提取。(2)本方法通用性强，对于植物药、动物药的饮片及炮制品均具有良好的提取效果。[0011]为了能更清晰地说明本发明的提取方法，下面结合具体实施案例，对本发明的提取方法进行进一步阐述。



[0012]图1:植物类中药材PsbA-trnH片段PCR扩增电泳图
[0013]1，金银花；2，红花；3，辛夷；4，藿香；5，人参；6，苍耳子；7，枸杞子；8，车前子；9，葶苈子；10，菟丝子；11，石楠叶；12，紫苏叶；13，苦参；14，葛根；15，当归；16，预知子；17，白芍；18，厚朴(发汗)；19，竹叶；20，黄芩；21，丹皮；22，龙胆；23，大黄(酒制)；24，吴茱萸(甘草制)；25，大血藤；26，黄连；27，鸭趾草；28，草乌(煮制)；29，苦参；30，山药(蒸制)；31，槐米；33，草豆蘧；34，甘草(炙)；35，姜黄；36，决明子。
[0014]图2:动物类中药材COI片段PCR扩增电泳图
[0015]M，DL2000DNA marker ；N,阴性对照；1，乌梢蛇；2，金钱白花蛇；3，土鳖虫；4，地龙；
[0016]图3:乌梢蛇特异性鉴别引物PCR扩增电泳图
[0017]M，DL2000DNA marker ；N,阴性对照；1，乌梢蛇；2，金钱白花蛇；3，地龙；4，全蝎；5，全蝎。
[0018]具体实施例1
[0019]1.材料和方法
[0020]1.1 材料
[0021]所用材料如表1所示,包括:
[0022]表1中药材相关样品基本情况
[0023]