专利名称：新型dna编码的d－酰化氨基酸水解酶以及将其用于生产d－氨基酸的方法D-氨基酸是许多杀虫剂、抗生素和医药的重要中间体。对于它们的合成已进行了许多的研究。到目前为止，合成DL-氨基酸可以通过物理化学、化学或酶的方法实现，其中，酶方法被认为是最方便和有效的。例如在一个已知的利用酶方法的例子中，使用D-酰化氨基酸水解酶将N-乙酰基-DL-氨基酸直接水解得到相应的D-氨基酸。已知的D-酰化氨基酸水解酶包括属于细菌、放线菌和霉菌的微生物，例如，假单胞菌(日本专利公开(JP-B)60-31477)、链霉菌(JP-B53-36035)、产碱杆菌(JP-B 07-83711)、Rhodococcus，Pimelobacter(日本专利请公开(JP-A)06-227789)、节核细菌、棒状杆菌、欧文氏菌、埃希氏杆菌、黄杆菌、Norcadia、精蛋白杆菌、黄(单胞)杆菌(日本专利申请公开(JP-A)11-113592)、Amycolatopsis(JP-A 11-98982)、Sebekia(JP-A 11-318442)、Hypomyces、镰刀菌、Auricularia、Pythium、Menisporosis(JP-A 12-41684)。已经有过用这些微生物得到的D-酰化氨基酸水解酶作用在N-酰基氨基酸上反应制备D-氨基酸的报道。然而，这些D-酰化氨基酸水解酶的活性对于有效的基质浓度来说却是不够的，因而就需要有一种工业上可应用的D-酰化氨基酸水解酶。特别的是，在水解N-乙酰基-D-色氨酸时，这些酶的活性对于有效的基质浓度来说是不够的。因此，它们都不能被称为是满足工业需要的酶。近来，Tokuyama(JP-A 13-275688)和Taylor(Chirotech Technology Limited，WO 00/23598)公开了一种作用于N-乙酰基-D-色氨酸以制备D-色氨酸的D-酰化氨基酸水解酶，该D-酰化氨基酸水解酶分别选自Hypomyces和产碱杆菌。这些D-酰化氨基酸水解酶中的任何一种都只能使N-乙酰基-D-色氨酸水解到10g/L，不能认为是有效浓度下催化反应的酶。D-氨基酸是医药的重要原料，因此需要找到一种生产成本更低的方法来生产D-氨基酸。到目前，尚未发现一种能有效催化氨基酸的D-酰化氨基酸水解酶。
本发明的目的是提供一种新型的在工业有效基质浓度下显示出有效高活性的D-酰化氨基酸水解酶，使用该酶能够有效地由N-乙酰基-DL-氨基酸得到D-氨基酸，以及提供一种使用该酶由N-酰基氨基酸制备D-氨基酸的方法。本发明的另一目的是提供一种D-酰化氨基酸水解酶的碱基序列编码，该D-酰化氨基酸水解酶的碱基序列编码是生产D-酰化氨基酸水解酶以及用D-酰化氨基酸水解酶生产D-氨基酸的有用材料；一种含有碱基序列的质粒；以及由这种质粒宿主转化而得到的转化体。在解决问题的同时，我们还对由众多微生物得到的D-酰化氨基酸水解酶的性能进行了评价。在研究基质浓度和反应速率的关系时，我们惊奇地发现，在一种已知的D-酰化氨基酸水解酶中，更高的基质浓度更显著地降低了它的反应速率，即是说，抑制了酶的活性。这一现象当基质是N-乙酰基-D-色氨酸时尤为显著。我们猜想，在普通的D-酰化氨基酸水解酶中，这种现象可能会使得在有效的基质浓度下，由N-乙酰基-DL-色氨酸生产D-色氨酸的无效性。因此，为了寻找一种新型的能够在高的N-乙酰基-D-色氨酸基质浓度下仍显示出高活性而其活性不受抑制的D-酰化氨基酸水解酶，我们测试了各种不同的微生物，最后，发现了能满足上述要求的表现新型D-酰化氨基酸水解酶活性属于甲基杆菌(Methylobacterium)和类诺卡氏菌属(Nocardioides)的微生物。通过各种纯化方法的结合使用，我们成功地测定了源自属于甲基杆菌(Methylobacterium)的微生物的D-酰化氨基酸水解酶的氨基酸序列，得到了序列表SEQ.ID.No.3中N-端基氨基酸残基的氨基酸序列。我们还获得了具有序列表SEQ.ID.No.1中序列的DNA，并由含有此序列的DNA碎片质粒制得了转化体，还制得了活性态的D-酰化氨基酸水解酶，并在有效的基质浓度下高效地由N-乙酰基氨基酸制得了相应的D-氨基酸。由此完成了本发明。
基于上述的新观察得到的本发明包括了以下方面
(1)一种能够作用于N-酰基-D-氨基酸而催化生成相应的D-氨基酸反应的D-酰化氨基酸水解酶。
其中在水介质中由N-乙酰基-D-色氨酸经催化反应生成D-色氨酸时，N-乙酰基-D-色氨酸浓度为50g/L时的反应速率至少是其浓度为5g/L时的40％。
(2)根据(1)中所述的D-酰化氨基酸水解酶，其中N-乙酰基-D-色氨酸浓度为100g/L时的反应速率至少是其浓度为5g/L时的20％。
(3)根据(1)中所述的D-酰化氨基酸水解酶是由属于甲基杆菌(Methylobacterium)或类诺卡氏菌属(Nocardioides)的微生物得到的。
(4)根据(3)中所述的D-酰化氨基酸水解酶，其中属于甲基杆菌(Methylobacterium)的微生物是甲基杆菌嗜中温菌属(Methylobacterium mesophilicum)，属于类诺卡氏菌属(Nocardioides)的微生物是类诺卡氏菌属(Nocardioides)thermolilacinus。
(5)根据(4)中所述的D-酰化氨基酸水解酶，其中属于类诺卡氏菌属(Nocardioides)thermolilacinus的微生物是类诺卡氏菌属(Nocardioides)thermolilacinus ATCC 35863菌株。
(6)一种能够作用于N-酰基-D-氨基酸而催化生成D-氨基酸的反应的D-酰化氨基酸水解酶，其包括
(A)序列表中SEQ.ID.No.2所示的氨基酸序列，或者
(B)在保持催化活性下，由插入、缺失或替换上述的氨基酸序列中至少一个氨基酸残基而得到的变异的氨基酸序列。
(7)根据(6)中所述的D-酰化氨基酸水解酶，其中在水介质中由N-乙酰基-D-色氨酸经催化反应生成D-色氨酸时，N-乙酰基-D-色氨酸浓度为50g/L时的反应速率至少是其浓度为5g/L时的40％。
(8)根据(7)中所述的D-酰化氨基酸水解酶，其中N-乙酰基-D-色氨酸浓度为100g/L时的反应速率至少是其浓度为5g/L时的20％。
(9)一种编码了能够作用于N-酰基-D-氨基酸而催化生成D-氨基酸的反应的D-酰化氨基酸水解酶的碱基序列，其包括
(a)序列表中SEQ.ID.No.1所示的碱基序列，或者
(b)在保持由上述的碱基序列中编码的D-酰化氨基酸水解酶的催化活性下，由插入、缺失或替换碱基序列SEQ.ID.No.1中至少一个碱基而得到的变异的碱基序列。
(10)根据(9)中所述的碱基序列，其中变异的碱基序列与SEQ.ID.No.1中的碱基序列在苛刻条件下进行杂交。
(11)根据(9)中所述的碱基序列，其中在水介质中由N-乙酰基-D-色氨酸经催化反应生成D-色氨酸时，N-乙酰基-D-色氨酸浓度为50g/L时的反应速率至少是其浓度为5g/L时的40％。
(12)根据(11)中所述的碱基序列，其中N-乙酰基-D-色氨酸浓度为l00g/L时的反应速率至少是其浓度为5g/L时的20％。
(13)一种含有(9)中所述碱基序列的质粒。
(14)一种由(13)中所述质粒经转化得到的转化体。
(15)一种制备D-酰化氨基酸水解酶的方法，其中包括将含有碱基序列的质粒插入到(14)中所述的转化体中，并对此转化体进行培养生成编码的D-酰化氨基酸水解酶的步骤。
(16)一种制备具有光活性的氨基酸的方法，其中包括在水介质中用D-酰化氨基酸水解酶作用于N-酰基氨基酸得到相应的D-氨基酸的步骤，其中，在水介质中用D-酰化氨基酸水解酶催化由N-乙酰基-D-色氨酸生成D-色氨酸的反应时，N-乙酰基-D-色氨酸浓度为50g/L时的反应速率至少是其浓度为5g/L时的40％。
(17)根据(16)中所述的方法，其中N-乙酰基-D-色氨酸浓度为100g/L时的反应速率至少是其浓度为5g/L时的20％。
(18)根据(16)中所述的方法，其中的酰化氨基酸水解酶是由属于甲基杆菌(Methylobacterium)或类诺卡氏菌属(Nocardioides)的微生物得到的。
(19)根据(18)中所述的方法，其中属于甲基杆菌(Methylobacterium)的微生物是甲基杆菌嗜中温菌属(Methylobacterium mesophilicum)，属于类诺卡氏菌属(Nocardioides)的微生物是类诺卡氏菌属(Nocardioides)thermolilacinus。
(20)根据(19)中所述的方法，其中属于类诺卡氏菌属(Nocardioides)thermolilacinus的微生物是类诺卡氏菌属(Nocardioides)thermolilacinus ATCC 35863菌株。
(21)根据(16)中所述的方法，其中N-酰基氨基酸的浓度为大于等于50g/L。
(22)根据(21)中所述的方法，其中N-酰基氨基酸的浓度为大于等于100g/L。
(23)一种制备具有光活性的氨基酸的方法，其中包括在水介质中用D-酰化氨基酸水解酶作用于N-酰基氨基酸得到相应的D-氨基酸的步骤，其中D-酰化氨基酸水解酶为(6)中所述的D-酰化氨基酸水解酶。
(24)根据(23)中所述的方法，其中在水介质中用D-酰化氨基酸水解酶催化由N-乙酰基-D-色氨酸生成D-色氨酸的反应时，N-乙酰基-D-色氨酸浓度为50g/L时的反应速率至少是其浓度为5g/L时的40％。
(25)根据(24)中所述的方法，其中N-乙酰基-D-色氨酸浓度为100g/L时的反应速率至少是其浓度为5g/L时的20％。
(26)根据(23)中所述的方法，其中用于和N-酰基氨基酸反应的D-酰化氨基酸水解酶是将(14)中所述的转化体培养得到的培养基或者从培养基中分离得到的转化体或者由其制得的材料。
(27)根据(23)中所述的方法，其中N-酰基氨基酸作为基质的浓度为大于等于50g/L。
(28)根据(27)中所述的方法，其中N-酰基氨基酸作为基质的浓度为大于等于100g/L。
本发明中的D-酰化氨基酸水解酶可用于在工业有效的浓度下以更高的反应速率由N-酰基氨基酸制备相应的D-氨基酸。本发明还提供了在使用基因重组技术制备D-酰化氨基酸水解酶的一种有用的碱基序列，和一种含有此碱基序列的质粒以及通过将含有此质粒宿主转化得到的转化体。


图1为重组质粒pUSDA3的物理谱图。图中，“ori”和“Ampr”分别代表了质粒的一个复制起点和一个抗氨比西林标计；“SacI”、“HincII”、“PstI”和“XhoI”代表限制点；粗箭头代表在D-酰化氨基酸水解酶中ORF的位置和方向。

本发明中的D-酰化氨基酸水解酶是一种能够作用于N-酰基-D-氨基酸以催化制备相应的D-氨基酸的反应的酶。特别的是，即使是在较高的基质浓度下，这种酶也只对N-乙酰基-D-色氨酸表现出少量的抑制，同时自身显示出较高的活性。对N-乙酰基-D-色氨酸的抑制可以通过下面的基质浓度和反应速率的关系来定义。
I.在水介质中，N-乙酰基-D-色氨酸浓度为50g/L时的反应速率至少是其浓度为5g/L时的40％。
II.N-乙酰基-D-色氨酸浓度为100g/L时的反应速率至少是其浓度为5g/L时的20％。
一种本发明中的D-酰化氨基酸水解酶具有上述I中所述的性质，优选为具有上述I和II中所述的性质。因此，本发明可以包括由任何一种微生物得到的D-酰化氨基酸水解酶或者由任何一种通过基因重组改变的已知的D-酰化氨基酸水解酶，只要它们至少表现出了上述的抑制性质I的D-酰化氨基酸水解酶活性即可。
对于性质I来说，更优选的情况是N-乙酰基-D-色氨酸浓度为50g/L时的反应速率至少是其浓度为5g/L时的50％，特别是60％。对于性质II来说，更优选的情况是N-乙酰基-D-色氨酸浓度为100g/L时的反应速率至少是其浓度为5g/L时的25％，特别是30％。
本发明中基质浓度和反应速率的关系可以确定如下。例如，向200μL含有10、50、100或者200g/L基质(N-乙酰基-D-色氨酸)的100mM的磷酸盐缓冲液中加入200μL具有足够反应活性的酶溶液，将混合液在30℃下反应适当的时间。反应生成的D-色氨酸的量可以用如HPLC方法确定，并可用于比较得出每一个基质浓度下的酶活性(反应速率)。对于本发明中用于确定反应速率的水介质没有限制，只要它能够使酶反应得以进行即可，例如，水及缓冲液，这些缓冲液是向水中加入一种或多种适当选自磷酸、Tris、柠檬酸、乙酸、硼酸、氨基乙酸、HEPES、MOPS、MES、CAPS、CHES、PIPES和其他的酸成分而得到。反应温度可以选自包含了最佳温度的选择范围。例如，特别优选的温度范围是使反应保持在30-60℃。反应的pH范围也应该能使D-酰化氨基酸水解酶保持其活性，特别是当pH为6-11时，包括了最佳pH值。酶可以是微生物培养基自身，也可以是利用离心过滤通过分离和收集得到的微生物，或者是其提取物，由微生物制得的粗产品或纯化产品。在本发明中，以能够正确确定反应速率来选择反应速率的条件如酶的用量和反应时间；这些条件如，在确定反应速率的过程中，反应达到饱和前的时间段，优选的是当N-乙酰基-D-色氨酸作为基质浓度为5g/L时，产生的D-色氨酸的累积浓度约为0.2g/L-1g/L时。
本发明中的D-酰化氨基酸水解酶的物理性质如下
最佳pHpH8-10(最优选为pH9)；
最佳温度60℃；
热稳定性在40℃下加热20小时后，有80％保持活性。
本发明中的D-酰化氨基酸水解酶具有序列表中SEQ.ID.No.2的氨基酸序列，或者在保持D-酰化氨基酸水解酶活性下，将SEQ.ID.No.2的氨基酸序列进行替换、缺失、变形或插入其中的一个或两个，优选为几个氨基酸而得到的氨基酸序列。
编码本发明中的D-酰化氨基酸水解酶的多聚核苷酸包含序列表中SEQ.ID.No.1的碱基序列。碱基序列SEQ.ID.No.1编码了SEQ.ID.No.2的蛋白质，尽管编码SEQ.ID.No.2的氨基酸序列的碱基序列不仅仅局限于碱基序列SEQ.ID.No.1，但是任何碱基序列基于不同的密码子。另外，还可以通过适当引入替换、缺失、改变、插入和/或增加来提供一个多聚核苷酸的同源物。本发明中多聚核苷酸的同源物可以通过对碱基序列SEQ.ID.No.1的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。这种同源物的一个例子是一种具有能够在苛刻条件下和具有与SEQ.ID.No.1互补序列的多聚核苷酸进行杂交的碱基序列的多聚核苷酸。
在苛刻条件下进行的杂交可根据“分子克隆”中描述的方式进行Cold Spring Harbor Laboratory Press，分子生物学中的通用协议(Current Protocols in Molecular Biology)；Wiley Interscience。一种可以由商业上可用的体系是GeneImage体系(Amersham)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行，根据上述协议中的产物协议，将一个载有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交。杂交缓冲液的组成为0.1wt％SDS、5wt％硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂(dilution blocking agent)以及2-7×SSC。稀释抑制剂可以例如由将5倍浓度的100×Denhardt’s溶液、2％(重量/体积)的牛血清蛋白、2％(重量/体积)的FicllTM400和2％(重量/体积)的聚乙烯吡咯烷酮稀释到1/20制得。20×SSC为3M的氯化钠和0.3M的柠檬酸组成的溶液。优选使用的SSC为3-6×SSC，更优选为4-5×SSC。杂交温度为40-80℃，更优选为50-70℃，进一步优选为55-65℃。在培养几小时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜。清洗温度优选为室温，更优选为杂交温度。清洗缓冲液的组成为6×SSC+0.1wt％SDS溶液，更优选为4×SSC+0.1wt％SDS溶液，进一步优选为1×SSC+0.1wt％SDS溶液，最优选为0.1×SSC+0.1wt％SDS溶液。当用这种清洗缓冲液清洗完膜后，就可以通过在DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。
本发明中的新型D-酰化氨基酸水解酶包括了从甲基杆菌嗜中温菌属(Methylobacterium mesophi1icum)MT 10894菌株和类诺卡氏菌属(Nocardioides)thermolilacinus ATCC 35863菌株中得到的酶。其中，甲基杆菌嗜中温菌属(Methylobacterium mesophilicum)MT 10894菌株是从日本的Mobara城，Ciba中的土壤中分离得到的。表1给出了它的菌学特征。
表1
通过将以上的菌学特征与Bergey’s Manual of SystematicBacteriology Vol.1(1984)William & Wilkins，Bergey’s Manual ofDeterminative Bacteriology Ninth Edition(1994)Williams & Wilkins，G.I.Barrow and R.K.A.Feltham ed.，Cowan & Steel’s Manual forthe Identification of Medical Bacteria 3rd. ed，Cambridge univ.press，(1993)等书中描述的类别相比较，从而确定出该菌株属于甲基杆菌嗜中温菌属(Methylobacterium mesophilicum)。菌株MT 10984于2000年3月8日在日本经济工业部下的国立生命科学和人体技术研究所(1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaragi，Japan)保藏，保藏编号为FERMP-17771，然后在2002年1月21日，根据布达佩斯条约转为国际保藏后，保藏编号变为FERM BP-7856。
编码本发明的新型D-酰化氨基酸水解酶的DNA可以通过如下步骤分离。从微生物中纯化一种基因组DNA。用一种限制内切酶进行消化后得到的DNA通过超离心或电泳沿其长度分段。收集碎片DNA，将之插入质粒以得到质粒库。从库中选出一个表达D-酰化氨基酸水解酶的克隆，给出一个含有编码D-酰化氨基酸水解酶基因的DNA的质粒。可通过分析该质粒的碱基序列确定出编码目标D-酰化氨基酸水解酶基因的DNA碱基序列，并从该DNA碱基序列推断出编码D-酰化氨基酸水解酶的氨基酸序列。
通过如上分离得到的编码本发明中D-酰化氨基酸水解酶的DNA可被插入到一个表达质粒中，例如，当宿主为大肠杆菌时，典型的表达质粒为pUC18、pKK223-3、pBR322、Bluescript II SK(+)和pSC101，这样，可以得到表达D-酰化氨基酸水解酶的质粒。对于宿主的选者不仅仅局限于大肠杆菌等，任何微生物只要满足重组载体可以稳定地和自动地生长并且一些外源DNA可以被表达即可作为转化宿主。
在本发明中，一种由质粒转化得到的转化体可以基于已知信息生长并产生本发明中的D-酰化氨基酸水解酶。任何一种人工的或天然的含有适量的碳源、氮源、无机和其他营养物的介质均可使用。可使用通常的培养方法如摇瓶培养、充气旋转器培养、连续培养和流加培养在含有上述培养成分的液体介质中进行。对于培养条件的选择没有特别的限制，可以根据培养类型和方法等因素的不同而进行适当选择，只要使宿主菌株能够产生D-酰化氨基酸水解酶即可。
用于制备本发明的D-氨基酸的方法中的D-酰化氨基酸水解酶可以是上述产生D-酰化氨基酸水解酶的细菌的培养物，也可以是通过将培养基进行离心后分离和收集得到的转化体细胞或者用其加工的细菌制品。这里使用的“加工的细菌制品”是指由转化体得到的提取物或粗产品、通过对提取物或粗产品中的D-酰化氨基酸水解酶活性碎片进行分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定转化体或提取物或者转化体的粗产品或分离产品而得到的固定产品。宿主生物体中产生的活性成分可能会对培养基介质本身、离心分离培养基介质并收集得到的转化体和/或由转化体的加工的细菌制品的目的反应的反应性或选择性造成不良的影响。在这种情况下，可以用有机溶剂或在反应前或反应中加热处理培养基介质本身、离心分离培养基介质并收集得到的转化体或者转化体的加工的细菌制品，以改善其反应性和/或选择性。有机溶剂可以适当地选用一种或多种醇类，如甲醇和乙醇；可与水混合的有机溶剂如丙酮、THF、DMF、DMI和DMSO；芳香有机溶剂如甲苯和苯；酯如乙酸乙酯和丁酸乙酯；烃如己烷和庚烷；卤化烃如二氯甲烷和氯仿；醚如二乙醚。有机溶剂用量范围根据D-酰化氨基酸水解酶活性的稳定性存在范围而定。加热温度可以为40℃-70℃，考虑到D-酰化氨基酸水解酶的稳定性，优选为45℃-55℃。加热的时间范围根据D-酰化氨基酸水解酶活性的稳定性存在范围而定；30-100分钟足够。
在用本发明中的D-酰化氨基酸水解酶处理N-酰基-D-氨基酸时，选择对反应性如D-酰化氨基酸水解酶的活性和稳定性有利的条件有利于反应的进行。
反应中使用的介质可以是水或含有不同缓冲液的水介质。其中的缓冲液可以是向水中加入一种或多种适当选自磷酸、Tris、柠檬酸、乙酸、硼酸、氨基乙酸、HEPES、MOPS、MES、CAPS、CHES、PIPES和其他的酸成分而得到。
为了进一步提高反应效率或产品产率，还可以加入各种添加剂。一些D-酰化氨基酸水解酶对金属离子如Zn2+和Co2+具有活性，因此，可向反应中加入这些二价金属离子。与此相反，如果金属离子抑制酶时，可加入螯合剂如EDTA。
本发明中制备D-氨基酸的原料(N-酰基氨基酸)包括N-酰基-D-氨基酸，其存在形式可以是DL-氨基酸、富集了D-异构体或纯D-异构体的光活性的氨基酸。
原料的浓度没有限制，通常为约1g/L-300g/L。特别是考虑到反应性和经济性时，浓度优选为大于等于50g/L，更优选为大于等于100g/L并且优选为小于等于200g/L。反应温度优选保持在D-酰化氨基酸水解酶可以表达其活性的温度范围内，优选为30-60℃。反应pH也优选保持在D-酰化氨基酸水解酶可以表达其活性的pH范围内，优选为pH6-11。
本发明中的新型D-酰化氨基酸水解酶可以提供由多种N-酰基氨基酸的D-异构体得到的相应的D-氨基酸。因此，本发明中的D-酰化氨基酸水解酶可以在工业上方便地用于由N-酰基-DL-氨基酸制备旋光性氨基酸。可应用的N-酰基-DL-氨基酸可选的化合物范围很广，没有限制。典型的优选N-酰基-DL-氨基酸的例子包括N-酰基-DL-甲硫氨酸、N-酰基-DL-亮氨酸、N-酰基-DL-色氨酸、N-酰基-DL-5-羟基色氨酸、N-酰基-DL-苯基丙氨酸、N-酰基-DL-苯基甘氨酸、N-酰基-DL-高苯基丙氨酸(N-acyl-DL-homophenylalanine)、N-酰基-DL-二高苯基丙氨酸(N-acyl-DL-bishomophenylalanine)、N-酰基-DL-对-硝基苯基丙氨酸、N-酰基-DL-对-氟苯基丙氨酸、N-酰基-DL-对-氯苯基丙氨酸、N-酰基-DL-对-溴苯基丙氨酸、N-酰基-DL-对-甲氧基苯基丙氨酸、N-酰基-DL-酪氨酸、N-酰基-DL-对-腈基苯基丙氨酸、N-酰基-DL-2-吡啶基丙氨酸、N-酰基-DL-3-吡啶基丙氨酸、N-酰基-DL-4-吡啶基丙氨酸、N-酰基-DL-邻-苄基丝氨酸、N-酰基-DL-S-苯基半胱氨酸、N-酰基-DL-1-萘基丙氨酸和N-酰基-DL-2-萘基丙氨酸。更优选的N-酰基-DL-氨基酸是N-乙酰基-DL-氨基酸。特别是对于N-乙酰基-D-苯基丙氨酸或N-乙酰基-D-色氨酸来说，基质专一性特别高。
实施例
下面将用实施例对本发明作更为详细的描述，但并非对发明内容进行限制。
通过高效液相色谱分析反应中产生的D-氨基酸和剩余的N-酰基氨基酸来评价反应性和光学纯度。(色谱柱CROWNPAK CR(-)；DaicelChemical Industries，Ltd.；柱温40℃；流动相HClO4水溶液，pH1.5和0-15％甲醇(V/V)；流速0.8mL/min；检测波长210nm)
实施例1甲基杆菌嗜中温菌属(Methylobacterium mesophilicum)MT 10894(FERM BP-7856)的培养
在具有下述组成的液体介质中，在肉汤琼脂皿中培养细菌，介质在30℃下振荡培养40小时制备表现D-酰化氨基酸水解酶活性的细菌。
培养介质组成
N-乙酰基-DL-亮氨酸5g/L
葡萄糖10g/L
胨10g/L
磷酸二氢钾1g/L
一代磷酸氢钾(potassium hydrogenphosphate monobasic)1g/L
七水合硫酸镁0.1g/L
酵母提取物0.5g/L
pH7.0(用KOH标定)
实施例2类诺卡氏菌属(Nocardioides)thermolilacinus(ATCC35863)的培养
在具有下述组成的液体介质中，在肉汤琼脂皿中培养细菌，介质在30℃下振荡培养100小时制备表现D-酰化氨基酸水解酶活性的细菌。
培养介质组成
N-乙酰基-DL-亮氨酸5g/L
改进的察氏-Dox液体介质(Oxoid)5g/L
酵母提取物2g/L
维他命测试酪蛋白氨基酸(vitamin assay casamino acid)10g/L
pH7.2(用KOH标定)
实施例3由甲基杆菌嗜中温菌属(Methylobacteriummesophilicum)MT 10894(FERM BP-7856)和类诺卡氏菌属(Nocardioides)thermolilacinus(ATCC 35863)得到的D-酰化氨基酸水解酶的基质浓度与反应速率的关系
粗酶溶液
用实施例1和2中得到的甲基杆菌嗜中温菌属(Methylobacteriummesophilicum)MT 10894(FERM BP-7856)和类诺卡氏菌属(Nocardioides)thermolilacinus(ATCC 35863)制备细菌细胞悬浮液(0.1g/0.1M的磷酸缓冲溶液(pH7.8)1mL)。用超声均质器将每一悬浮液进行均质，再用冷冻离心分离机使细胞碎片沉淀。收集上清液即为粗酶溶液。
基质溶液
将N-乙酰基-D-色氨酸溶于0.1M的磷酸盐缓冲液中(pH7.8)，配成浓度为200g/L的基质溶液。
测定
用0.1M的磷酸盐缓冲液(pH7.8)稀释基质溶液，制备200μL的5，25，50和100g/L的基质溶液。向其中加入200μL的粗酶溶液后，混合物在30℃下反应1小时。然后，加入0.4mL1M的磷酸盐缓冲液结束反应。再加入0.4mL 1N
的氢氧化钠溶解沉淀的未反应的乙酰基化合物。离心除去细菌碎片后，用HPLC确定反应液中生成的D-色氨酸。表2中假设基质浓度为5g/L时反应速率为100时，给出了用不同菌株得到的D-酰化氨基酸水解酶作用于浓度分别为25、50和100g/L的基质时，D-色氨酸的相对生成速率。
表2
对比例1在已知菌株中基质浓度与反应速率的关系
我们研究过已知的带有D-酰化氨基酸水解酶的细菌株产碱杆菌属denitrificans subsp.xylosodans MI4(FERM P-9413)和链霉菌tuirus(IFO 13418)中基质浓度与反应速率之间的关系。这些菌株的制备方法将在下面介绍。如例1所述的方法制备Alcaligenes denitrificans subsp.xylosodans MI4(FERM P-9413)。将链霉菌tuirus(IFO 13418)在含有下列组分的液体介质中于30℃下培养48小时以制得链霉菌tuirus(IFO13418)。
培养基介质组成
D-缬氨酸4g/L
葡萄糖10g/L
胨10g/L
磷酸二氢钾1g/L
一代磷酸氢钾(potassium hydrogenphosphate monobasic)1g/L
七水合硫酸镁0.5g/L
酵母提取物10g/L
氯化钴1mg/mL
pH7.0(用KOH标定)
粗酶溶液和基质溶液的制备以及酶活性的测定如实施例3所述进行。表3中假设基质浓度为5g/L时反应速率为100时，给出了用不同菌株得到的D-酰化氨基酸水解酶作用于浓度分别为25、50和100g/L的基质时，D-色氨酸的相对生成速率。
表3
实施例4由甲基杆菌嗜中温菌属(Methylobacteriummesophilicum)MT 10894(FERM P-17771)得到的D-酰化氨基酸水解酶的N-端基氨基酸序列
如实施例1所述培养并收集甲基杆菌嗜中温菌属(Methylobacteriummesophilicum)。将细菌细胞悬浮于0.1M的含1mM DTT(dithiothreitol)的磷酸盐缓冲液中(pH7.8)。悬浮的细菌细胞通过超声均质机进行匀质。再用冷冻离心分离机将细胞碎片除去，得到粗酶溶液。向粗酶溶液中加入硫酸铵。然后，将30-60％的沉淀组分进行脱盐，并通过一个DEAEToypearl柱收集流过的组分。再将收集的组分经过采用苯基Toypearl和Q-琼脂糖凝胶的色谱进行分离，得到表现D-酰化氨基酸水解酶活性的组分。组分再经过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，在56kDa处观察到谱带。对56kDa处的蛋白质的N-端基氨基酸进行排序，结果确认为如SEQ.ID.No.3.中的Thr-Asp-Ser-Thr-Arg-。
实施例5甲基杆菌嗜中温菌属(Methylobacterium mesophilicum)MT 10894(FERM P-17771)的基因组DNA库的制备
如实施例1所述将甲基杆菌嗜中温菌属(Methylobacteriummesophilicum)培养2天。然后对细菌细胞离心收集并用磷酸盐缓冲液(pH7.8)洗。再按照“Kiso Seikagaku Jikken Hou 2，Extraction，Separation and Purification，Koichi Anami et al.，MaruzenPublication”中所述的DNA分离方法从细菌细胞中制备基因组DNA。得到的基因组DNA用限制性内切酶Sac I进行完全消化，并用超离心沿DNA长度分段，收集3kb或更长的DNA。用5’-端基已被限制性内切酶Sac I消化后已经被脱去磷酸的载体pUC18对DNA进行绑扎，以制备质粒库。用质粒库对大肠杆菌DH5α进行转化。将转化体放入含有50μg/mL氨比西林的LB(Luria-Bertani)琼脂糖介质中静置培养以生成菌落。
实施例6从质粒库中对D-酰化氨基酸水解酶进行活性筛选
在实施例5中形成的每一个菌落到在LB介质(1％bactor胰岛素，0.5％bacto酵母提取物，1％氯化钠，pH 7.0)中于37℃下进行液相摇瓶培养过夜。转化体经离心沉淀，再用0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.8)洗一次。离心收集细菌细胞。对得到的细菌细胞进行均质得到粗酶溶液。选择表现D-酰化氨基酸水解酶活性的转化体，通过它作用于基质N-乙酰基-D-色氨酸产生D-色氨酸。测定步骤如下所述。
粗酶溶液
将得到的细菌细胞悬浮于0.1M的磷酸缓冲溶液(pH7.8)中，配成浓度为0.1mg/mL的悬浮液。用超声均质器将细菌细胞进行均质，再用冷冻离心分离机使细胞碎片沉淀。收集上清液即为粗酶溶液。
基质溶液
将N-乙酰基-D-色氨酸溶于0.1M的磷酸盐缓冲液中(pH7.8)，配成浓度为10g/L的基质溶液。
测定
向200μL的基质溶液中加入200μL的粗酶溶液，混合物在30℃下反应1小时。然后，加入0.4mL1M的磷酸盐缓冲液结束反应。离心除去碎片后，用HPLC确定反应液中生成的D-色氨酸。
实施例7编码D-酰化氨基酸水解酶的DNA序列的测定
从实施例6中得到的表现D-酰化氨基酸水解酶活性的转化体中提取质粒。其物理谱图表示在图1中。其进一步排序，利用BigDye TermiatorCycle Sequencing kit(PE Applied Biosystem)，通过基因分析仪310(PE应用生物系统)(PE Applied Biosystem)对它进行测序。结果得到编码D-酰化氨基酸水解酶基因的DNA的碱基序列(SEQ.ID.No.1)。SEQ.ID.No.2为D-酰化氨基酸水解酶碱基序列的氨基酸翻译后的序列。它的N-端基氨基酸序列与实施例2中的N-端基氨基酸的测序结果是一致的。由氨基酸序列估计的D-酰化氨基酸水解酶的分子量约为53kDa。
实施例8含有由甲基杆菌嗜中温菌属(Methylobacteriummesophilicum)MT 10894(FERM P-17771)得到的D-酰化氨基酸水解酶基因的DNA的大肠杆菌转化体作用于基质N-乙酰基-DL-色氨酸时反应的评价
实施例7中由图1中所示的质粒得到的大肠杆菌在含氨比西林(50μg/mL)的LB介质中于37℃下进行摇瓶培养过夜。然后，离心收集细菌细胞并用0.1M的磷酸缓冲溶液(pH7.8)洗。再将细菌细胞悬浮于0.1M的磷酸缓冲溶液(pH7.8)中。
N-乙酰基-DL-色氨酸溶液的制备
将N-乙酰基-DL-色氨酸溶解于0.1M的磷酸盐缓冲溶液(pH7.8)，配成浓度为200g/L的基质溶液。
测定
将上述的于40℃下预热的细菌细胞悬浮液(2.5mL)和基质溶液(2.5mL)混合并在40℃下反应(反应基质浓度为100g/L)。反应20小时后，从反应液中取100μL，并加入相同量的1N的NaOH结束反应。然后用HPLC流动相将取出样品稀释到1/200，并离心沉淀细菌细胞。上清液用HPLC分析以测定由基质N-乙酰基-DL-色氨酸产生的D-和L-色氨酸的浓度。结果见表4。
表4
*(产生的D-色氨酸[mM])÷(产生的D-色氨酸[mM]+产生的L-色氨酸[mM]+剩余的N-乙酰基-DL-色氨酸[mM])
实施例9含有由甲基杆菌嗜中温菌属(Methylobacteriummesophilicum)MT 10894(FERM BP-7856)得到的D-酰化氨基酸水解酶基因的DNA的大肠杆菌转化体对基质的专一性
对实施例7中用图1所示质粒转化的大肠杆菌对N-乙酰基-DL-氨基酸的基质专一性进行了比较。此例中，在基质N-乙酰基-DL-氨基酸的浓度为5g/L时，在40℃下反应16小时。假设基质为N-乙酰基-DL-色氨酸时D-酰化氨基酸水解酶的活性为100时，同时测定多种N-乙酰基-DL-氨基酸的的相对活性与产物光学纯度以及反应产率。结果见表5。
表5
*(产生的D-氨基酸[mM])÷(产生的D-氨基酸[mM]+产生的L-氨基酸[mM]+剩余的N-乙酰基-DL-氨基酸[mM])
工业应用
本发明提供了一种新型的由如甲基杆菌嗜中温菌属(Methylobacterium mesophilicum)MT 10894(FERM BP-7856)得到的D-酰化氨基酸水解酶和编码它的DNA。本发明的D-酰化氨基酸水解酶是一种工业上有用的酶，它可以使由N-酰基氨基酸生成相应的D-氨基酸的反应以更高的效率进行。序列表图1
序列表<110>Mitsui Chemicals Inc.<120>编码新型D-酰化氨基酸水解酶的DNA及其制备方法<130>MTC02P014<160>3<210>1<211>1464<212>DNA<213>甲基杆菌嗜中温菌属<400>1atgaccgaca gcacccgtaa gcacgacctg atcatccgcg gcggcaccgt catcgacggc 60cgccggacgc cccgcttccg cgccgatgtg gcggtgcgcg acggccgact gagcgccatc 120ggcgatctgg cggaccatcg ggccgcccag gagatcgatg ccacgggacg catcgtggcg 180ccgggcttca tcgactcgca cacgcacgat gaccaggcgg tgctgtcgca gccgcagatc 240ccgttcaagg tgtcgcaggg cgtcacgacg gtgatcgccg gcaattgcgg catcagcgcg 300gcgccgctgc ggcgggacat ggacctgccc atgcccctca acctgatcga cgtgcccgcc 360gaggagcgct tcacccgctt cgccgactac ctggatgcgc tgcgtgcccg cccctcgtcg 420gtcaacgtgg ccgcgatggt cggccactcc accctgcgcg ccgtcaccat gccggcgctg 480gaccgcgagg ccaacagcga ggaaatcgca cgcatgcgcg cgctggtgca ggaggcgatg 540gacgcgggcg ccatcggcgt ctccaccggc accttctatc cacccgcggt gaaggccacc 600acggaggaga tcatcgaagt ctgccggccc ctcactgccg cggggggcct gtacgtcacc 660cacatgcggg acgagtccga ccaggtgatg acctcgctgg aagagacctt ccgcatcggc 720cgcgcgctgg acgtgccggt ggtcgtctcc caccacaaag tgcagaacac gcccaacttc 780ggcaagtcgc aggtcacgct gcccttcatc cgcgaagcca tgcaacgcca gcgcagtgtg 840cctcgactgc tatccctaca cggcgggctc gaccatgatc cgcgcggacc ggggcatgct 900cgaaggccgc gtgctgatcg ccgagagcct gccgcatccg gaatgcgcag gccgcgacct 960ggacgacatc gcccgcgact ggggcgtgac cgggtggagg ccgcccgccg gctgcagccc 1020ggcagcgcca tctacttcct gatggacgag ggcgatgtgc agcgcatcct ggccttcgac 1080gacacgatga tcggctcgga cggcatcccg gtcggcagca agccgcatcc gcggctctgg 1140ggcaccttcc cgcgcgtgct gggccattac agccgcgacg tcggcctgtt ccccctggag 1200accgccgtct ggaagatgac cggactcacg gcccgcaact tcggcctgca cggccggggc 1260acgctggagg ccggccaggc cgccgacatc gtggtcttcg atgccggcac cgtgcgcgac 1320gcggccgact atgccgagcc cacgcgtccc gcggaaggca tcgatgcggt gatcgtcaat 1380ggcgccatca cctggcaagg cggccagcac acgggcgcac gccagggtca ggtcatccgc 1440cgccaggcgg ccccatccca ctga1464<210>2<211>487<212>PRT<213>甲基杆菌嗜中温菌属<400>2Met Thr Asp Ser Thr Arg Lys His Asp Leu Ile Ile Arg Gly Gly Thr 1 5 10 15Val Ile Asp Gly Arg Arg Thr Pro Arg Phe Arg Ala Asp Val Ala Val
20 25 30Arg Asp Gly Arg Leu Ser Ala Ile Gly Asp Leu Ala Asp His Arg Ala
35 40 45Ala Gln Glu Ile Asp Ala Thr Gly Arg Ile Val Ala Pro Gly Phe Ile
50 55 60Asp Ser His Thr His Asp Asp Gln Ala Val Leu Ser Gln Pro Gln Ile 65 70 75 80Pro Phe Lys Val Ser Gln Gly Val Thr Thr Val Ile Ala Gly Asn Cys
85 90 95Gly Ile Ser Ala Ala Pro Leu Arg Arg Asp Met Asp Leu Pro Met Pro
100 105 110Leu Asn Leu Ile Asp Val Pro Ala Glu Glu Arg Phe Thr Arg Phe Ala
115 120 125Asp Tyr Leu Asp Ala Leu Arg Ala Arg Pro Ser Ser Val Asn Val Ala
130 135 140Ala Met Val Gly His Ser Thr Leu Arg Ala Val Thr Met Pro Ala Leu145 150 155 160Asp Arg Glu Ala Asn Ser Glu Glu Ile Ala Arg Met Arg Ala Leu Val
165 170 175Gln Glu Ala Met Asp Ala Gly Ala Ile Gly Val Ser Thr Gly Thr Phe
180 185 190Tyr Pro Pro Ala Val Lys Ala Thr Thr Glu Glu Ile Ile Glu Val Cys
195 200 205Arg Pro Leu Thr Ala Ala Gly Gly Leu Tyr Val Thr His Met Arg Asp
210 215 220Glu Ser Asp Gln Val Met Thr Ser Leu Glu Glu Thr Phe Arg Ile Gly225 230 235 240Arg Ala Leu Asp Val Pro Val Val Val Ser His His Lys Val Gln Asn
245 250 255Thr Pro Asn Phe Gly Lys Ser Gln Val Thr Leu Pro Phe Ile Arg Glu
260 265 270Ala Met Gln Arg Gln Arg Ser Val Pro Arg Leu Leu Ser Leu His Gly
275 280 285Gly Leu Asp His Asp Pro Arg Gly Pro Gly His Ala Arg Arg Pro Arg
290 295 300Ala Asp Arg Arg Glu Pro Ala Ala Ser Gly Met Arg Arg Pro Arg Pro305 310 315 320Gly Arg His Arg Pro Arg Leu Gly Arg Asp Arg Val Glu Ala Ala Arg
325 330 335Arg Leu Gln Pro Gly Ser Ala Ile Tyr Phe Leu Met Asp Glu Gly Asp
340 345 350Val Gln Arg Ile Leu Ala Phe Asp Asp Thr Met Ile Gly Ser Asp Gly
355 360 365Ile Pro Val Gly Ser Lys Pro His Pro Arg Leu Trp Gly Thr Phe Pro
370 375 380Arg Val Leu Gly His Tyr Ser Arg Asp Val Gly Leu Phe Pro Leu Glu385 390 395 400Thr Ala Val Trp Lys Met Thr Gly Leu Thr Ala Arg Asn Phe Gly Leu
405 410 415His Gly Arg Gly Thr Leu Glu Ala Gly Gln Ala Ala Asp Ile Val Val
420 425 430Phe Asp Ala Gly Thr Val Arg Asp Ala Ala Asp Tyr Ala Glu Pro Thr


本发明提供了一种新型的D－酰化氨基酸水解酶，它是对由甲基杆菌嗜中温菌属(Methylobacteriummesophilicum)MT10894等得到的新型D－酰化氨基酸水解酶的编码DNA进行克隆得到的，它对在工业有效基质浓度下有效进行由N－酰基－DL－氨基酸制备D－氨基酸的反应具有足够高的活性；本发明还提供了一种编码D－酰化氨基酸水解酶的DNA，以及使用含有这种DNA的转化体来由相应的N－酰基氨基酸制备D－氨基酸的一种方法。