一种去除疫苗中宿主dna的方法[0002]狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的人畜共患疾病，在全球分布广泛，每年死于狂犬病的人数超过5.5万人，其中约95%发生在亚洲和非洲。大多数死亡事件均是被狂犬病毒感染的狗咬伤所致，受害者中30%~60%为15岁以下儿童。狂犬病的预防和治疗通常采用狂犬病疫苗。[0003]在狂犬疫苗生产中，经病毒感染的细胞培养上清液中含有目标物狂犬病毒，而且还有宿主细胞碎片和蛋白以及宿主DNA。另外，还有细胞培养基组份。这些杂质都是需要去除的。其中，以传代细胞制备狂犬疫苗安全性的关键是细胞残余DNA的含量。中国药典规定狂犬疫苗(Veix)细胞)的宿主DNA残留量不得高于IOOpg/剂。[0004]传统的狂犬病毒纯化路线主要采用超滤浓缩和凝胶过滤色谱法。其中，凝胶过滤色谱法是目前最有效的纯化方法，但是该方法的纯化效果并不能满足狂犬疫苗制品新的国家标准IOOpg/剂的要求，主要原因是凝胶过滤色谱法是根据生物分子量大小进行分离的，而病毒与宿主DNA的分子量不相上下，不能在凝胶介质中被有效分离。[0005]此外，采用在病毒收获液中添加硫酸鱼精蛋白的方法去除DNA，原理是硫酸鱼精蛋白可以与DNA结合，结合物容易沉淀，使用离心的方法能有效去除DNA。但是同时鱼精蛋白也与病毒结合，病毒损失严重，通常回收率只有25-30%。[0006]此外，在超滤浓缩后加入核酸酶处理步骤，经过酶切以后的DNA变成了小片段，然后再经过凝胶过滤色谱步骤，使大部分DNA和病毒分离开。但是由于核酸酶的作用受环境条件限制，不能完全发挥效果，仍有极小一部分DNA不能和病毒分开，最终DNA残留量还停留在纳克(ng)级水平。结果只是接近国家标准，仍然很难达到合格水平。[0007]近几年，在狂犬病毒的纯化过程中引入了离子交换色谱步骤，首先是阴离子交换色谱，让DNA和病毒一起被吸附在介质上，然后控制条件仅对病毒洗脱，能够使病毒液中DNA的残留量降低至500pg/ml，但是病毒量的回收率只有大约20%。[0008]CN102282253A公开了一种狂犬病病毒纯化方法，使用一步阳离子交换色谱法能够使DNA的去除率达到95%以上，而病毒回收率在70%以上。所述的阳离子交换介质是MERCK公司的产品Fractogel EMD S03_，结合后续的核酸酶处理步骤和超速离心纯化步骤，最终得到的病毒液配制成的狂犬疫苗，在含有2.5IU有效剂量里DNA残留量小于20pg。整个纯化过程病毒回收率在50%左右。然而，CN102282253A公开的狂犬病病毒纯化工艺过于复杂，生产成本高。
[0009]CN102282253A公开了采用离子交换色谱纯化狂犬病病毒的工艺，先将被病毒感染的细胞的培养物的上清液与阳离子交换色谱担体接触，以便让狂犬病毒结合在担体上，随后从担体上洗脱该病毒。这样的工艺流程主要是为了去除病毒液中的宿主DNA残留，但是由于病毒先吸附再洗脱的做法使得病毒量损失较大。而且病毒和宿主DNA都吸附在担体上，先后洗脱病毒和DNA的做法也导致了 DNA去除不彻底的后果。
[0010]因此开发一种既能有效去除DNA残留从而达到国家药典标准又能提高病毒回收率的纯化工艺非常重要。


[0011]本发明的目的在于提供一种去除疫苗中宿主DNA的方法，包括:
[0012]步骤I)调整病毒感染的宿主细胞上清浓缩液的pH值和盐浓度，使pH值在6~8之间，盐浓度在0.2^0.5mol/L之间；
[0013]步骤2)使调整后的宿主细胞上清浓缩液与阴离子交换介质充分接触。
[0014]细胞培养上清浓缩液在与介质接触之前要进行澄清和浓缩，调整后的上清浓缩液pH值在6~8之间，盐浓度在0.2^0.5mol/L之间。上清浓缩液pH值优选在广8之间，进一步优选在7~7.8之间；盐浓度优选0.3~0.5mol/L。
[0015]pH值的区间是狂犬病毒的活性耐受区间，越过这个区间病毒生物活性会受到很大影响。盐浓度区间则是病毒回收和DNA去除的优选区间，当盐浓度低于0.2M/L时，病毒的回收率只有8% ;而当盐浓度高于0.5M/L时，DNA的去除率下降到70%。
[0016]阴离子交换色谱介质选自偶联二乙胺基乙基(DEAE)、季铵盐(Q)为配基的琼脂糖微球或者是其他具有阴离子效果的介质。本发明采用的阴离子交换层析并不需要依赖特定的填料，任何具有阴离子效果的介质都可以运用到本发明的工艺中。
[0017]在本发明的实施例中米用了 Q Sepharose FF和DEAE Sepharose FF这两种为最普遍的因离子交换色谱介质。Q Sepharose FF为强阴离子交换介质，DEAE Sepharose FF是弱阴离子介质，两者均可用于本发明的工艺中而且去除宿主DNA效果良好。
[0018]在本发明的
[0019]Vero细胞是一种理想的疫苗生产基质:遗传背景清楚，核型稳定，无外源因子污染，160代以内没有致瘤性，适合大规模培养，可用生物反应器生产，保证了疫苗大批量细胞的均质性和安全性。目前用VeiO细胞作为宿主细胞开发、研究和生产的疫苗包括但不限于狂犬疫苗、流感疫苗、出血热疫苗、甲肝疫苗、乙脑疫苗、轮状病毒疫苗、SARS疫苗等等。
[0020]CHO细胞与VeiO细胞被WHO是经中国药品监督管理局认可，用于生物制品的生产的传代细胞。本领域技术人员理解，所述疫苗包括但不限于狂犬疫苗、脊髓灰质炎疫苗、乙脑疫苗、甲肝疫苗、出血热疫苗、流感疫苗、SARS疫苗或轮状病毒疫苗，所述宿主细胞包括但不限于CHO细胞与VeiO细胞，利用本发明所述方法处理，调整病毒感染的宿主细胞上清浓缩液的PH值和盐浓度，使pH值在6~8之间，盐浓度在0.2^0.5mol/L之间；使调整后的宿主细胞上清浓缩液与阴离子交换介质充分接触，均可达到去除疫苗中宿主DNA的目的。
[0021]采用本发明所述方法处理后，细胞培养上清浓缩液中检测的病毒量至少是处理前的60%，优选至少是处理前的80%以上，病毒量检测是采用ELISA方法对病毒的G蛋白组分做的检测。
[0022]接触介质后上清浓缩液中DNA的去除率在99%以上，优选99.5%以上，更优选99.9%以上，DNA检测采用斑点杂交法。
[0023]所述狂犬疫苗宿主DNA的去除方法，在阴离子交换色谱步骤之后优选还包含核酸内切酶处理步骤。核酸内切酶可以选自Benzonase等品牌的内切酶。
[0024]酶切后的病毒液经过凝胶过滤层析纯化，收集含有病毒成分的纯化吸收峰，凝胶过滤介质是4-6%交联度的琼脂糖微球。凝胶过滤层析纯化液中检测的病毒量是层析前的78%以上，有的高达95%以上。凝胶过滤层析纯化液中宿主DNA残留量小于40pg/ml。
[0025]上述方法得到的纯化液以单剂量配苗并进行冻干，检测到冻干疫苗宿主DNA残留量< IOpg/ 剂。
[0026]最终的纯化病毒液以单剂量配苗，然后进行冻干。冻干疫苗有效剂量为8IU (NIH法检测)时,用斑点杂交法检测宿主DNA残留量不高于10pg。
[0027]本发明提供的更具优势的狂犬疫苗宿主DNA的去除方法，通过对阴离子交换色谱进行了仔细的实验摸索，意外的发现狂犬病毒不适合被吸附后再洗脱下来，为此，发明人采用严格控制阴离子交换条件的思路，通过调整病毒感染的宿主细胞培养上清浓缩液的PH值和盐浓度，仅仅使宿主DNA被吸附，而病毒几乎不受损失，这一思路达到非常好的去除宿主DNA的效果，
[0028]与现有技术相比，本发明具有如下优点:
[0029]I)宿主DNA去除率好，能够达到99.95%，更优的能达到99.99% ；
[0030]2)病毒损失低，总的病毒回收率在50%以上；
[0031]3)避免使用价格昂贵的耗材和设备，生产成本大大降低；
[0032]4)避免使用操作复杂的技术和方法，使生产过程大大简化；
[0033]5)全过程各项技术结合紧密，运行流畅，易于放大进行工业化大规模生产。`


[0034]图1本发明所述方法流程图。
[0035]图2为对病毒各组分的Western blot检测结果。
[0036]图3为本发明所述方法处理后的狂犬病毒电子显微镜照片。
【具体实施方式】
[0037]本发明公开了一种去除疫苗中宿主DNA的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0038]在本发明的实施例中，本发明所述方法的具体流程如图1，下面以VeiO细胞生产狂犬疫苗为例，对本发明所述方法作进一步的详细说明:
[0039]1.澄清步骤
[0040]采用0.65um孔径的套筒式滤器对病毒感染的Vero细胞培养收获液做过滤澄清，去除因细胞被病毒裂解产生的大量细胞碎片和大颗粒物质，病毒颗粒大小在200nm左右，能够很容易穿透滤器的筛孔，而细胞碎片和大颗粒物质被隔离，使病毒液澄清。
[0041]2.浓缩步骤
[0042]澄清后的病毒液体积大，不利于下一步的纯化操作，所以采用超滤方法对澄清病毒液浓缩，浓缩倍数一般在20-30倍，使用的超滤膜包截留分子量在300-1000KD之间。
[0043]3.阴离子交换介质
[0044]与尚子交换介质充分接触之前,调整病毒浓缩液的pH值在6_8之间，盐浓度在
0.2-0.5mol/之间，然后进行阴离子交换处理，收集处理后病毒液。所述的阴离子交换介质是耦联DEAE或Q配基的琼脂糖微球，或者是其他具有阴离子效果的介质。
[0045]4.二次超滤浓缩
[0046]经过离子交换色谱后，为了减轻下一步操作负担，同时也为了降低生产成本，对病毒液进行二次超滤浓缩，所用超滤膜包截留分子量300-1000KD。
[0047]5.病毒灭活
[0048]采用β -丙内酯1:4000稀释对病毒液灭活24小时,37°C水解2小时降解β -丙内酯。
[0049]6.核酸酶 处理
[0050]米用benzonase酶处理病毒液，30_37°C静置20小时。
[0051]7.凝胶过滤色谱法纯化
[0052]酶处理后病毒液经过凝胶过滤柱层析纯化，去除杂蛋白、小片段DNA和残留核酸酶。所述凝胶过滤介质为4-6%交联度的琼脂糖微球。
[0053]本发明对最终纯化液做了电子显微镜观察病毒颗粒形态，显示病毒颗粒呈子弹状，颗粒大小在200nm左右，符合狂犬病毒特征；同时也对整个工艺的每个环节做了Western blot检测(图2)，结果显示从病毒收获液到纯化液，病毒组分没有发生改变，见图3，说明本发明的去除DNA的方法以及后续的纯化方法比较好的保持了病毒颗粒的完整性，对病毒没有造成损害。
[0054]本发明提供的去除狂犬疫苗宿主DNA的方法分别进行了 1200ml、12L、30L规模试验和300L规模的实验。在病毒的纯化过程中均高效地去除了宿主DNA，DNA去除率达到99.95%以上；并且有效地回收了病毒，总的病毒回收率在50%以上；而且外源蛋白的去除到了目前的检测限度以下。
[0055]为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0056]实施例1:
[0057]取1200ml狂犬病毒收获液，用0.65um孔径的套筒滤器澄清过滤，超滤浓缩30倍，用磷酸盐缓冲液调整pH为7.8，盐摩尔浓度为0.4mol/L，与50ml Q Sepharose FF介质充分接触15分钟；然后对介质处理后的病毒液超滤浓缩3倍；用β -丙内酯终浓度1:4000灭活24小时；灭活液37°C水解2小时；用氯化镁溶液调整Mg2+浓度为l-2mmol/L，加入终浓度为90IU/ml的Benzonase核酸酶，处理20小时；上样到IL Sepharose 4FF凝胶层析柱中，层析柱缓冲液为PBS，线性流速90cm/h收取病毒洗脱峰，检测残留DNA和病毒量，DNA残留量为80pg/ml，去除率为99.95%，病毒回收率55%。
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