专利名称：疫苗组合物的制作方法目前注册和使用的灭活脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)是基于非减毒(Salk)脊髄灰质炎病毒疫苗和病毒株因此它们也指野生型IPV(WtIPV)。通过肌肉(IM)或深皮下(SC)注射传送IPV。目前IPV既可作为无佐剂的独立制剂，也可以多种组合，包括DT-IPV(与白喉和破伤风类毒素)和六价DTPH印B-Hib-IPV疫苗(此外还有百日咳、B型肝炎和b型流感嗜血杆菌一起)得到。根除脊髄灰质炎病毒后未来对IPV的全球需求可由目前的毎年8 千万剂的水平増加到毎年4亿5千万剂。因此，可能需要IPV “延伸”供给的方法。另外，需要评估多种使IPV的价格更易于接受的策略。当常规疫苗的供给不足以满足全球需求或当制造常规疫苗的成本阻止疫苗以发展中国家可承受的价格售卖时，需要使用低剂量的IPV抗原对抗感染的减量疫苗制剂。允许将抗原用于大流行性感冒疫苗的减量疫苗是已知的(例如參见WO2008/128939)。水包油型乳剂本身在本领域已知，并被建议用作佐剂。(EP 399843; WO95/17210)。脊髄灰质炎疫苗的目前可接受的标准剂量包含作为40単位的灭活脊髓灰质炎病毒I型(Mahoney)、8単位的灭活脊髓灰质炎病毒2型(MEF-I)和32単位的灭活脊髓灰质炎病毒3型(Saukett)的D抗原(例如Infanrix-IPV )。现有的独立IPV的制剂不含佐剂。在结合疫苗中，已报道铝类佐剂使IPV剂量减少3至4倍，请參照与0PV/IPV制造商的第八次WH0/UNICEF会议和第30届NRA，2009年10月，日内瓦，WH0/HQ。预计该3至4倍的減少不足以延伸全球疫苗的供应以及显著降低制造成本。因此在现有技术中急需允许显著降低剂量(多于5倍)以便增加疫苗供应和降低制造成本的方法。这种降低将制造发展中国家可负担的疫苗。本发明人惊奇地发现通过将水包油型乳剂作为佐剂与灭活脊髓灰质炎抗原結合，可使用减量的IPV来引发足够的或改善的对抗脊髓灰质炎的水平。该疫苗具有显著的优点，包括向需要该疫苗的个体提供更多剂量的IPV疫苗。
本发明提供多种包含抗原(可只具有IPV组分或可具有与其它抗原结合的IPV组分)和水包油型乳剂的减量IPV疫苗。因此，本发明的ー个方面提供了ー种包含大于I个D抗原単位并小于10个D抗原単位的剂量的I型灭活脊髓灰质炎病毒的本发明的IPV疫苗。在一个实施方式中，本发明提供了ー种包含I至7个D抗原単位间剂量的3型灭活脊髓灰质炎病毒的本发明的IPV疫苗。在另ー个实施方式中，本发明提供了ー种包含0. 2至2个D抗原単位间剂量的2型灭活脊髓灰质炎病毒的本发明的IPV疫苗。在又ー个方面中，本发明提供了ー种包含灭活脊髓灰质炎病毒型和水包油型乳剂的本发明的IPV疫苗。另外根据本发明，所述佐剂的使用导致灭活脊髓灰质炎病毒D抗原的有效剂量减 少 5、6、7、8、9 或 10 倍。本发明的所述水包油型乳剂包含可代谢油、乳化剂和可选的生育酚，如a -生育酚。定义术语“疫苗”可选择被术语“免疫原性组合物”代替，反之亦然。“D抗原単位”(也称作“国际单位”或IU):脊髄灰质炎病毒的D抗原形式诱发保护性中和抗体。此处所指的D抗原单位(例如在本发明的疫苗中)为在形成最后的疫苗前每个块状IPV抗原中测得的总的D抗原単位，该疫苗被加入每人剂量的配制疫苗中(通常0. 5mL的最终体积)。可靠的测量D抗原单位的方法在本领域是已知的，并被例如欧洲药典公开。例如，可使用以下实施例1( “通过ELISA定量D抗原”)描述的ELISA测试来測量D抗原单位。欧洲药典提供了用于将制造商间的这种方法标准化(Pharmeuropa Special Issue, Bio96-2)的测试样品(欧洲药典生物參比制剂-可购自Ph. Eur. Secretariat,如Code P 2160000)。因此可更好地理解本领域中D抗原单位值。文中术语“剂量”通常为本发明的疫苗的一次给药量，通常是一次注射量。通常人剂量为0. 5mL。当然可根据疫苗给药计划给药多种剂量。文中术语“IPV”或包含该组分的疫苗旨在表示灭活脊髓灰质炎病毒I型(如作为优选使用的Mahoney,或由国立血清研究所销售的名为DiTeKiPol的Brunhilde)或2型(如MEF-I)或3型(如Saukett)，或这些类型中的两种或全部三种的组合。用于本发明目的的全(或标准)剂量(1、2和3型IPV各自的40-8-32D抗原単位)的IPV疫苗的实例可为:P0iim-kK (美国葛兰素史克生物制品)。因此，此处所说的存在于本发明的疫苗中的IPV的标准剂量的倍数減少，是表示在所述疫苗的每个剂量中配制分别等于1、2和/或3型IPV的40、8和/或32个D抗原単位(在每个块状IPV抗原型中测得)的至少5倍的減少，且优选10倍的減少的D抗原単位。文中术语来自病原体的“组分”或本发明的疫苗中的“对这种病原体提供保护的组分” g在表示来自该病原体的ー种或更多种抗原。文中术语“大约”或“近似地”表示对所述数值的土 10%，但应符合上下文的使用。制备灭活脊髓灰质炎病毒(IPV)的方法在本领域是已知的。在一个实施方式中，IPV应包含疫苗领域中普通的1、2和3型，并可为用甲醛灭活的Salk脊髄灰质炎疫苗(參见例如，Sutter 等，2000，Pediatr. Clin. North Am. 47:287; Aimmerman &Spann 1999, AmFam Physician 59:113;Salk等，1954，Official Monthly Publication of the AmericanPublic Health Association 44 (5):563;Hennesen, 1981,Develop.Biol.Standard47:139;Budowsky, 1991, Adv. Virus Res. 39:255)。脊髄灰质炎病毒可在细胞培养中生长。细胞培养可为VERO细胞系或来自于猴子肾脏的连续细胞系PMKC。VERO细胞可便利地在微载体上培养。在病毒感染之前和期间的VERO细胞的培养可包括牛源性材料如小牛血清的使用，且该材料应从不具有牛脑部海绵状病变(BSE)的来源获得。培养还可包括如乳清蛋白液的材料。在生长后，可使用如超滤、渗滤和色谱的技术纯化病毒粒子。在向患者给药前，必须灭活病毒，而这可通过使用甲醛处理来实现。病毒可各自独立地生长、纯化和灭活，之后结合以提供用于IPV疫苗的浓缩块状 混合物。本发明疫苗中的抗体将以“免疫有效量”存在，即无论是以单ー剂量或作为一系列中的一部分向个体给药能有效治疗或防止疾病的量。剂量治疗可为单ー剂量计划或多剂量计划(如包括激发剂量)。现今，脊髄灰质炎疫苗的标准剂量趋于包含40个D抗原単位的灭活脊髓灰质炎病毒I型、8个D抗原単位的灭活脊髓灰质炎病毒2型和32个D抗原単位的灭活脊髓灰质炎病毒 3 型(如 Infanrix-IPV )。然而，本发明人惊奇地发现通过将抗原与水包油型乳剂佐剂结合，可使用减量的IPV获得良好的免疫反应。在一个实施方式中，本发明的IPV疫苗剂量可包含在IPV I型的I至10个D抗原単位间。在另ー个实施方式中，本发明的疫苗剂量可近似地或精确地包含IPV I型的标准40个D抗原单位的十分之一。在又一个实施方式中，本发明的疫苗可包含少于2个D抗原単位、0. 2 2个D抗原単位(相当于2. 5 25%的标准8个D抗原单位剂量)或大约或精确的0. 8个D抗原单位的IPV 2型(相当于10%的标准8个D抗原单位剂量)。在又一个实施方式中，本发明的疫苗可包含大于I个且小于8个D抗原単位，例如大约或精确为3. 2个D抗原単位的IPV 3型。在另ー个实施方式中，本发明的疫苗可近似地或精确地包含IPV 3型的标准32个D抗原単位的十分之一(相当于近似3. 2个D抗原単位)。另外，根据本发明，所述佐剂的使用可导致IPV抗原剂量的至少10倍的減少。在另ー个方面中，提供了用于引发对人体内脊髄灰质炎抗原或抗原组合物的改善的体液反应的免疫原性组合物或试剂盒的制备方法，该组合物包含(a)如文中定义的少量的脊髄灰质炎病毒抗原或其抗原性制剂和(b)水包油型乳剂佐剂。适合的所述水包油型乳剂包含可代谢油、乳化剂和可选的生育酚，如a生育酚。在另ー个中，所述水包油型乳剂佐剂包含含量为总体积的0. 5%至20%的至少ー种可代谢油，并具有按强度计至少70%的且直径小于I y m的油珠。在一个实施方式中，脊髓灰质炎抗原和水包油型乳剂佐剂包含在同一容器中。这称为“ー瓶法(One vial approach)”。在可选的实施方式中，脊髓灰质炎抗原和水包油型乳剂佐剂包含在独立的容器或小瓶或単元中，并在向受试者给药前或当时混合。这被称作“两瓶法(Two vials approach)”。举例来说，当该疫苗为0. 5mL的注射剂量的总剂量体积的2组分疫苗时，脊髄灰质炎抗原可作为在ー个小瓶中(500 yl)(抗原容器，如小瓶)分别含有近似40-8-32个D抗原単位的IPV 1、2和3型的标准脊髓灰质炎疫苗存在，而另ー个小瓶包含佐剂(4500 ill)。将抗原容器中的内含物与佐剂容器中的内含物混合。典型地，脊髓灰质炎疫苗为0. 5mL的注射剂量，而在第一个受试者之前多剂量小瓶含有1:10的小瓶混合物。水包油型乳剂佐剂 本发明的佐剂组合物包含水包油型乳剂佐剂，适合的所述乳剂包含含量为总体积的0. 5%至20%的可代谢油，并具有按强度计至少70%且小于I ii m直径的油珠。为了使任何水包油型组合物适宜用于人类给药，乳剂体系的油相必须包含可代谢油。该油可为任何对对接受者无毒且能够通过新陈代谢转化的植物油、鱼油、动物油或合成油。坚果、种子和谷物为植物油的普遍来源。合成油也是本发明的一部分，并可包括可商购油，如NEOBEE 及其它。特别适合的可代谢油为鲨烯。鲨烯(2,6, 10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯)是ー种在鲨鱼肝油中被大量发现并在橄榄油、麦胚油、米糠油和酵母中被少量发现的不饱和油，并且是一种特别适用于本发明的油。鲨烯是ー种可代谢油，是由于它是胆固醇的生物合成中的中间体的事实(Merck index,第十版,索引号8619)。水包油型乳剂本身在本领域是已知的，并被认为有效作为佐剂组合物(EP399843;W0 95/17210)。可代谢油的适合含量为免疫原性组合物总体积的0. 5%至20%(最终浓度)，适合含量为总体积的I. 0%至10%，适合含量为总体积的2. 0%至6. 0%。在
中，可代谢油的最终含量为免疫原性组合物总体积的约0. 5%、1%、
3.5%或5%。在另ー个
中，可代谢油的最終含量为免疫原性组合物的总体积的
0.5%、1%、3. 57%或5%。鲨烯的适合含量为每疫苗剂量的约10. 7mg，适合为每疫苗剂量10. 4至 11. Omg。本发明适合的水包油型乳剂体系具有在亚微米范围内的小油珠尺寸。适合的油珠尺寸将在120至750nm的直径范围内、适宜尺寸在120至600nm的直径范围内。通常水包油型乳剂含有按强度计至少70%的且直径小于500nm的油珠，具体地是按强度剂至少80%且直径小于300nm，适合的按强度计至少90%且直径在120至200nm的范围内。根据本发明通过强度表示的油珠尺寸即直径。有几种通过强度测定油珠尺寸直径的方法。通过使用尺寸测量仪器(sizing instrument),适合通过动态光散射如MalvernZetasizer 4000或适合的Marvern Zetasizer 3000HS测量强度。详细过程在实施例II. 2中给出。第一个可能性是通过动态光散射(PCS-光子相关光谱)确定z平均直径ZAD ;该方法还另外给出多分散指数(PDI)，并使用累积量算法计算ZAD和roi。这些数值不需要知道颗粒的折射率。第二种途径是通过使用另ー种算法，Contin,或NNLS,或自动“Malvern”算法(由尺寸测量仪器提供的默认算法)确定整个粒径分布来计算油珠的直径。大多数时候，由于复杂组合物的颗粒折射率未知，只考虑强度分布，且如果必要的话考虑由该分布得来的平均強度。根据本发明的水包油型乳剂包含生育酚，如a -生育酚。存在适合的a生育酚或其衍生物如a生育酚琥珀酸酷。适合的a生育酚的含量为免疫原性组合物的总体积的0. 2%至5. 0%(v/v)间，适合含量为0. 5ml的疫苗剂量体积的2. 5%(v/v)，或0. 5ml的疫苗剂量体积的0. 5%(v/v)或0. 7ml疫苗剂量体积的I. 7 1.9%(v/v)，适合为1.8%。通过说明，可通过使用以下转换因子将以v/v给出的浓度转换为w/v的浓度5%(v/v)的a生育酚浓度等于4. 8% (w/v)的a-生育酚浓度。适合的a生育酚的含量为每疫苗剂量约11. 9mg，适合为每疫苗剂量11. 6至12. 2mg。水包油型乳剂包含乳化剤。该乳化剂的含量可为免疫原性组合物的0.01至
5.0wt%(w/w),适合含量为0. I至2. 0wt%(w/w)。适合的浓度为总组合物的0. 5至I. 5wt%。乳化剂可适合为聚氧こ烯失水山梨醇单油酸酯(Tween 80)。在
中，
0.5ml的疫苗剂量体积含有l%(w/w)的Tween 80，而0. 7ml的疫苗剂量体积含有0. 7%(w/w)的Tween 80。在另ー个
中，Tween 80的浓度为0. 2%(w/w)。聚山梨醇酯80的适合含量为每疫苗剂量约4. 9mg，适合为每疫苗剂量的4. 6至5. 2mg。适合的疫苗剂量包含每疫苗剂量约11. 9mg含量的a生育酚，每疫苗剂量10. 7mg含量的鲨烯，和每疫苗剂量约4. 9mg含量的聚山梨醇酯80。水包油型乳剂佐剂可与其它佐剂或免疫增强剂一起使用，因此本发明的重要实施方式为包含鲨烯或另ー种可代谢油、生育酚如a生育酚和Tween 80的水包油型制剂。该水包油型乳剂还可含有span 85和/或卵磷脂。通常，水包油包含免疫原性组合物总体积的2至10%的鲨烯、2至10%的a生育酚和0. 3至3%的Tween 80，并可根据WO 95/17210中所述方法制备。适合的鲨烯a生育酚的比例等于或小于1，因为这样提供了更稳定的乳剂。也可存在Span85(聚氧こ烯失水山梨醇三油酸酯)，例如以1%的水平。本发明的疫苗可包含含有脊髓灰质炎病毒D抗原或由选自由脊髓灰质炎病毒I型、2型和3型组成的组中的至少ー种灭活脊髓灰质炎病毒类型制得的抗原性制剂的单价组合物。本发明中的疫苗可包含含有脊髄灰质炎病毒D抗原或由至少2种或至少3种灭活脊髄灰质炎病毒类型制备的抗原性制剂的多价组合物。所述多价组合物可选自由a)作为8个单元的灭活脊髓灰质炎病毒I型，I. 6个単元的灭活脊髓灰质炎病毒2型和6. 4个单元的灭活脊髓灰质炎病毒3型的D抗原；b)作为6. 6个单元的灭活脊髓灰质炎病毒I型，I. 3个单元的灭活脊髓灰质炎病毒2型和5. 3个单元的灭活脊髓灰质炎病毒3型的D抗原；c)作为5. 7个单元的灭活脊髓灰质炎病毒I型，I. I个单元的灭活脊髓灰质炎病毒2型和4. 5个单元的灭活脊髓灰质炎病毒3型的D抗原；d)作为5个单元的灭活脊髓灰质炎病毒I型，I个单元的灭活脊髓灰质炎病毒2型和4个单元的灭活脊髓灰质炎病毒3型的D抗原；e)作为4. 4个单元的灭活脊髓灰质炎病毒I型，0. 88个单元的灭活脊髓灰质炎病毒2型和3. 5个单元的灭活脊髓灰质炎病毒3型的D抗原；或f)作为4个单元的灭活脊髓灰质炎病毒I型，0. 8个单元的灭活脊髓灰质炎病毒2型和3. 2个单元的灭活脊髓灰质炎病毒3型的D抗原组成的组中。除了上述抗原和佐剂组分，本发明的疫苗通常还包含一种或多种“药学可接受的载体或赋形剂”，包括自身不引发对接受该组合物的个体有害的抗体的产生的任何赋形剂。适合的赋形剂通常为大的、代谢慢的大分子，如蛋白质、糖类、聚乳酸、聚こ醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、鹿糖(Paoletti 等,2001，Vaccine, 19:2118)、海藻糖(W0 00/56365)、乳糖和脂类聚集物(如油珠或脂质体)。这种载体对本领域普通技术人员是已知的。该疫苗还可含有稀释剂，如水、盐水、甘油等。另外，可存在辅助物质，如润湿剂或乳化剤、pH缓冲物质等。无菌无热原的磷酸盐缓冲生理盐水是典型的载体。对药学可接受的赋形剂的详细描述可參见 Gennaro, 2000, Remington:科学和药学实践，第 20 版，ISBN:0683306472。组合物可存在于小瓶中，或它们可存在于准备填充的注射器中。该注射器可具有 或不具有针头。注射器会包含单剂量的组合物，而小瓶可包括单剂量或多剂量(如2剂量)。在一个实施方式中该剂量是用于人类。在又一个实施方式中该剂量是用于成人、青少年、儿童、婴儿或小于ー岁的人类并可通过注射给药。本发明的疫苗可以单位剂量形式或多剂量形式(如2剂量)包装。所述多剂量组合物可选自由2剂量、5剂量和10剂量组成的组中。对多剂量形式来说，小瓶优选于预填充注射器。可按常规建立有效剂量体积，但用于注射的该组合物的典型人剂量具有0. 5mL的体积。本发明的组合物对人类来说是等渗的。本发明的疫苗可包括抗菌剂，特别是当以多剂量形式包装吋。应避免硫柳汞，因为它会导致IPV组分效カ的丧失。可使用其它抗菌齐IJ，如2-苯氧基こ醇或苯甲酸酯(苯甲酸甲酷、こ酷、丙酷)。任何防腐剂都优选以低水平存在。防腐剂可另外添加和/或为混合以形成组合物的块状抗原的组分(如作为百日咳抗原的防腐剂存在)。在一个实施方式中，本发明的疫苗不含硫柳汞或基本不含硫柳汞。“不含硫柳汞”或“基本不含硫柳汞”是指在最終制剂中不存在足够的以负面地影响IPV组分的效カ的硫柳汞。本发明的疫苗可包含清洁剂，如Tween(聚山梨醇酷)，如Tween 80。清洁剂通常以低水平存在，如〈O. 01%。本发明的疫苗可包括钠盐(如氯化钠)以提供滲透压。该组合物可包含氯化钠。在一个实施方式中，本发明的组合物中氯化钠的浓度在0. I至100mg/mL的范围内(如I 50mg/mL,2 20mg/mL,5 15mg/mL),且在又一个实施方式中，氯化钠的浓度为10±2mg/mL NaCl,如约 9mg/mL。本发明的疫苗通常包括缓冲液。典型的是磷酸盐、柠檬酸盐或组氨酸缓冲液。本发明的疫苗可在溶液中包括游离的磷酸根离子(如通过使用磷酸盐缓冲液)以防止促进抗原的不吸收。本发明组合物中游离磷酸根离子的浓度在一个实施方式中为0. I至10. OmM间，或在另ー个实施方式中为I至5mM间，或在又一个实施方式中为约2. 5mM。通过对大鼠的血清中和试验测得的脊髄灰质炎效力为了本发明的目的，应使用单剂量疫苗并通过确定测试疫苗的几何平均滴度(GMT)与对照疫苗的GMT的比值对本发明的含IPV的疫苗进行疫苗效力的IPV定量评估的分析，并以相对响应(RR)或相对效カ(RP)表示。对照GMT可为使用任何分别含40-8-32个D抗原单位的IPV 1_2_3型的任意IPV疫苗获得的GMT，并可为通过已知疫苗;p0li0rix 获得的GMT。通常，如下进行RP测试通过血清中和试验确定脊髓灰质炎病毒1、2和3型对大鼠的效カ对10组健康大鼠(Sprague-Dawley(OFA)或任何预先验证的种)肌肉注射测试样品或对照材料在磷酸盐缓冲盐水中的稀释液(1/1. 25; 1/3. 125; 1/7. 81)。如果必要，可通过注射未稀释疫苗和三种上述稀释液将稀释范围扩大到4种稀释液。将注射稀释液的十只大鼠作为阴性对照。每周观察一次大鼠以检测任何异常反应。在注射后20至22天后，对大鼠深度麻醉并放血，收集血清以通过血清中和测试进行分析。对血清中和测试来说，通过在56°C下在水浴中温育30分钟对血清灭活。使用合适的稀释介质在微孔板中制备血清的三种稀释系列，每种脊髄灰质炎类型为ー种。在+4°C下储存微孔板。对三种脊髄灰质炎病毒类型，将预定含量的病毒(30-300 CCID50)加入血清稀释液中。根据它们各自的滴度稀释该三种病毒悬浮液。将最终稀释液称作“有效稀释液”。将每种有效稀释液加入相应的微孔板中。之后将板密封并在370C ±1°C下温育16小时，之后加入H印-2细胞并将微孔板在37°C ±1°C下温育7天。在考马斯亮蓝染色后使用倒置显微镜读取病毒的细胞病变效应(CPE)。抗脊髓灰质炎抗体的 存在抑制了病毒的生长和相应的CPE的出现。抗脊髓灰质炎病毒滴度(1、2和3型)对应于不具有任何CPE的最后稀释液的滴度。在每组中，记录具有中和抗体的动物并确定每个血清样品中不同类型的脊髄灰质炎病毒的抗体滴度。以完全抑制脊髄灰质炎病毒在H印-2细胞中的细胞病变效应的血清样品的最高稀释度的倒数的log2表示中和抗体滴度。同样确定每组大鼠的每个稀释度和每个病毒类型的几何平均滴度(GMT)。本发明的疫苗的包装可使用多种类型的容器包装本发明的疫苗，如小瓶、注射器等。多剂量小瓶通常包含可再封的塑料ロ，通过该塑料ロ可插入无菌针头以带走ー剂量的疫苗，当移除针头后将塑料ロ再次密封。可在多种容器(如2或3种)中提供疫苗。可在以单次注射向主体给药前现场混合容器内含物，或在不同位点伴随给药。疫苗的剂量，或如果试剂盒伴随给药(在两个或更多容器中)每种疫苗的剂量通常为0. 5mL。本发明疫苗的给药本发明提供了在哺乳动物体内引发免疫反应的方法，包含给药有效含量的本发明疫苗的步骤。可预防性地给药该疫苗(即防止感染)。免疫反应优选是保护性的并优选包含抗体。该方法可能引发升压反应。在初次接种后，可对受试者进行一次或几次具有充分间隔的加强(随后的)接种。剂量治疗可为单剂量计划或多剂量计划。多剂量可用在主要接种计划和/或加强接种计划中。可在可能有一年效カ的主要剂量计划后进行加强剂量计划。适合的启动剂量间的时间(如在4-16周之间)和启动与加强间的时间可按常规确定。在一个实施方式中，该哺乳动物为人类。当该疫苗用于预防时，该人类优选为儿童(如幼童或婴儿)或青少年；当该疫苗用于治疗吋，该人类优选为成人。_在用于儿童的疫苗也可用于成人，例如来确定安全、剂量、免疫原性等。可使用本发明的疫苗制剂通过将所述疫苗直接给药于患者来保护或治疗易于感染的哺乳动物。可通过非消化道给药(肌肉、腹腔、皮内、皮下、静脉或组织间的空间)；或通过直肠、口腔、阴道、局部、透皮、鼻腔、眼镜、肺或其它粘膜给药来完成直接给药。在一个实施方式中，通过肌肉注射向大腿或上臂给药。可通过针头进行注射(如注射针)，但也可选地使用无针注射。典型的肌肉注射剂量为0.5mL。细菌感染影响人体的多个部位，因此可本发明的组合物可以多种形式制备。例如，该组合物可被制成可注射的液体溶液或悬浮液。可制备该组合物以用于使用细粉或喷雾的肺部给药，如吸入器。该组合物可被制成栓剂或药拴。可制备该组合物以用于鼻腔、耳部或眼部给药，如作为喷雾、液滴、胶体或粉末(參见如 Almeida & Alpar, 1996, J Drug Targeting, 3:455;Bergquist等，1998,APMIS, 106:800)。已报道DTP疫苗的成功德鼻腔给药(Ryan等，1999，Infect.Immun. , 67:6270;Nagai et al. , 2001, Vaccine, 19:4824)。在一个实施方式中，同时将第一和第二(以及适当的第三)容器中的疫苗在不同部位给药，而在可选的实施方式中本发明人设想在作为单ー疫苗给药前将第一和第二容器中的内含物混合(可选地现场混合)。本发明可用于引发系统和/或粘膜免疫。所有引用的參考和出版物通过引用合并于此。实施例
仅为了说明的目的提供实施例，而不旨在限制本发明的范围。实施例I :制备水包油型乳剂并将该乳剂与IPV疫苗结合的方法根据文件[Ott等，The adjuvant MF59:a 10-year perspective. In-vaccineadjuvants:preparation methods and research protocols. Methoas in Molecularmedicine, vol 42, chapter 12，p211_228. Edited by D. T. 0，Hagan (2000)]中描述的方法制备水包油型乳剤。简单地说，将9. 75g鲨烯(Sigma，来自鲨鱼肝脏)与I. 175g失水山梨醇三油酸酯混合。单独将I. 175g聚山梨醇酯80与240ml的IOmM pH 6. 5的柠檬酸盐缓冲液混合,之后加入鲨烯-失水山梨醇三油酸酯溶液中。使用台式均质机(Silverson)将该混合物进一步均质化I分钟。之后立刻使用Microfluidics M110H微射流机(Microfluidics,MA, USA)对该材料进行五通道的高压微射流。使用马尔文激光粒度仪验证了油珠的尺寸小于150nm。对所得乳剂进行无菌过滤并在2 8°C下储存。使用PBS将I瓶(I人剂量)IPV (NVI,荷兰)稀释五倍，之后向其中加入等量体积的乳剂，得到该疫苗的总共10倍稀释液。实施例2 大鼠的免疫和免疫原性的评价使用0. Iml的A)全强度的IPV ；B)使用PBS稀释10倍的IPV和C)使用上述乳剂稀释10倍的IPV肌肉注射两次(第0和28天)使大鼠(n=5)免疫。在第42天时收集血清并对IPV疫苗中的所有三种进行脊髓灰质炎病毒中和滴度的评价。病毒中和的几何平均滴度如下表所示表I几何平均滴度(N=5)_组__I型__2型__3型_
_IPV 满則量__ 1024 (1.55)__ 1824 (1.685)__1024 (I 55) 一 —IPV 1/10 剂量__ 32 (1.55)__45.254 (1.78)__57.01 (1.976) _
IPV 1/10剂量加水
2048 (1.55)22 98.86 (1.685) 2298.80 (1.685)
—包油型乳剂__—__—__——(括号内数值表示几何平均偏差)这说明当与水包油型乳剂组合吋，1/10剂量的IPV疫苗引发的免疫反应至少与不含佐剂的满剂量疫苗引发的一祥有效。因此向IPV疫苗中加入佐剂允许疫苗剂量的減少并允许使用更低剂量的抗原接种。


本申请提供了高性价比的免疫原性IPV制剂。所述制剂含有可减少5至10倍剂量的灭活脊髓灰质炎病毒疫苗的佐剂。