专利名称：疫苗组合物的制作方法疫苗组合物技术领域本公开内容涉及奈瑟球菌免疫原性组合物和疫苗、它们的生产和这样的组合物在药物中的用途的领域。细菌中的奈瑟球菌菌株是很多人类病变的致病因子，需要研制出可抗这些致病因子的有效疫苗。特别是，淋病奈瑟球菌OVeisseria和脑膜炎奈瑟球菌 {Neisseria meningitidis)所引起的病变可通过接种疫苗而治疗。脑膜炎奈瑟球菌是一种重要的病原体，特别是在儿童和年轻人中。败血症和脑膜炎是侵入性脑膜炎球菌病(MD)的最严重威胁生命的形式。这种疾病由于其较高的发病率和死亡率已经成为全世界的健康问题。根据荚膜多糖的抗原差异，已经鉴定出了 13种脑膜炎奈瑟球菌血清群，最普遍的是A、B和C，它们导致全世界90%的该疾病。血清群B是欧洲、美国和拉丁美洲几个国家中脑膜炎球菌病的最普遍原因。已经研制出了基于血清群A、C、W和Y的荚膜多糖的疫苗，它们表现出可控制脑膜炎球菌病的暴发(Peltola等人，1985 Pediatrics 76 ;91_96)。然而，血清群B的免疫原性较差，且仅主要诱导IgM同种型的短暂抗体应答(Ala’Aldeen D和Cartwright K 1996, J.1nfect. 33 ; 153-157)。因此，目前还没有能够抗导致绝大多数温带国家中大多数该疾病的血清群B脑膜炎球菌的广泛有效的疫苗。尤为严重的是，血清型B疾病在欧洲、澳洲和美洲的发生率日益增加，主要是在5岁以下的儿童中 。抗血清群B脑膜炎球菌的疫苗的研制提出了一个特有的困难，即由于多糖荚膜与人神经细胞粘着分子的免疫学相似性导致其免疫原性较差。因此，已经将疫苗生产的方案集中于脑膜炎球菌外膜的表面暴露结构，但却已经被这些抗原在菌株之间的显著变异所阻碍。一种测试中的抗原是fHbp。但是，已经再次发现针对fHbp的免疫应答对衍生出所述fHbp的脑膜炎球菌菌株是特异性的。Lewis等人公开了 fHbp作为疫苗候选物的状态。Expert Reviews Vaccines 8(6) 第 729 页，(2009)。Beernink和 Granoff (“Bactericidal antibody induced by meningococcal recombinant chimeric 因子 H 结合 protein vaccines” Inf. & I mm. 第 76 卷， 第 2568-2575页，2008)公开了工程设计含有fhbp的不同结构域的嵌合fHbp分子的可能性， 这基于所述蛋白的3个结构域模型，也基于所述蛋白分类成3个主要抗原组。
最近的尝试还已经提示，抗-fH MAb杀菌活性的模型需要针对非重叠表位的2种 MAb的结合,这会活化经典的补体途径以及抑制fH结合(P. T. Beernink , 2008“Fine antigenic specificity and cooperative bactericidal activity of monoclonal antibodies directed at the meningococcal vaccine candidate Factor H—binding protein” Inf. & I mm.第 76 卷，第 4232-4240 页)。
W0/2009/114485公开了含有异源b结构域的嵌合因子H结合蛋白(fHbp)和使用方法。发明内容
本文提供了嵌合fHbp蛋白和包含所述蛋白的组合物。
本公开内容涉及包含氨基酸序列Fl和F2的融合蛋白，其中Fl是第一个fHbp氨基酸序列的N-端片段；F2是第二个fHbp氨基酸序列的C-端片段；所述第一个和第二个fHbp 氨基酸序列来自不同的fHbp家族，其中片段Fl和F2的长度都是至少10个氨基酸；其中所述融合蛋白能够引发针对两个fHbp家族的抗体。
在另一个方面，本公开内容涉及编码本公开内容的融合蛋白的多核苷酸。
在另一个方面，本公开内容涉及重组宿主细胞，其含有本公开内容的多核酸。
在另一个方面，本公开内容涉及分离的外膜囊泡，其包含本文公开的融合蛋白。
在另一个方面，本公开内容涉及生产融合蛋白的方法，所述方法包括在外膜囊泡中表达本文公开的融合蛋白。
在另一个方面，本公开内容涉及生产融合蛋白的方法，所述方法包括在适合表达 嵌合fHBP的条件下，培养含有本公开内容的多核酸的重组宿主细胞；和分离所述嵌合 fHBPo
在另一个方面，本公开内容涉及药物组合物，其包含本公开内容的融合蛋白和药学上可接受的赋形剂。
在另一个方面，本公开内容涉及疫苗，其包含本公开内容的融合蛋白和药学上可接受的赋形剂。
在另一个方面，本公开内容涉及治疗或预防脑膜炎奈瑟球菌感染或疾病的方法， 所述方法包括给有此需要的宿主施用保护剂量的本公开内容的疫苗。
在另一个方面，本公开内容涉及用于治疗或预防脑膜炎奈瑟球菌感染或疾病的本公开内容的融合蛋白，和本公开内容的融合蛋白在药物生产中的用途，所述药物用于治疗或预防脑膜炎奈瑟球菌感染或疾病。


图1 -使用fHbp (菌株MC58 -全长序列的氨基酸残基1-202)、LVL491、LVL511、 LVL512.LVL513和LVL514进行的蛋白序列比对。
图2 -使用fHbp (菌株8047 -全长序列的氨基酸残基157-274)、LVL491、 LVL511、LVL512、LVL513和LVL514进行的蛋白序列比对。
图3 -显示了融合体A的潜在结构。图例白色-来自菌株MC58 (fHbp家族B) 的蛋白序列；黑色-来自菌株8047 (fHbp家族A)的蛋白序列；灰色(箭头)-Glu217和 Thr238向丙氨酸的2点突变。
图4 -显示了融合体B的潜在结构。图例白色-来自菌株MC58 (fHbp家族B) 的蛋白序列；黑色-来自菌株8047 (fHbp家族A)的蛋白序列；灰色(箭头)-Glu217向 Ala的点突变。
图5 -显示了融合体C的潜在结构。图例白色-来自菌株MC58 (fHbp家族B)的蛋白序列；黑色-来自菌株8047 (fHbp家族A)的蛋白序列；灰色-Glu218和Thr239 向丙氨酸的2点突变;灰色(+箭头)-Aspl46、Lysl48和Ser204分别向Glul46、Argl49 和Arg204的3点突变；添加Gly 148。
图6 -显示了融合体E的潜在结构。图例白色-来自菌株MC58 (fHbp家族B) 的蛋白序列；黑色-来自菌株8047 (fHbp家族A)的蛋白序列；灰色-Glu218和Thr239 向丙氨酸的2点突变；灰色-Aspl46、Lysl48和Ser204分别向Glul46、Argl49和Arg204 的2点突变；添加Glyl48 ;灰色+箭头-Arg230向Lys230的突变。
图7 -显示了 TdfI结构。
图8 -显示了表达不同水平的fHBP的完整细胞的蛋白印迹高(线I)、中等(线 7)、低(线5)和不可检测(线2、3、4、6)。
序列标识符在序列表中包括下述序列标识符，并在说明书提及SEQIDNO:1-SEQIDNO:2 -SEQIDNO:3 -SEQIDNO:4-SEQIDNO:5 -SEQIDNO:6 -SEQIDNO:7 -SEQIDNO:8 -SEQIDNO:9 -SEQIDNO:10SEQIDNO:11SEQIDNO:12SEQIDNO:1358成熟序列中的氨塞SEQIDNO:14(LVL489) SEQIDNO:15SEQIDNO:16(LVL490)SEQIDNO:17SEQIDNO:18SEQIDNO:19SEQIDNO:20SEQIDNO:21SEQIDNO:22SEQIDNO:23SEQIDNO:24来自菌株8047的成熟 的A族fHbp序列的核酸序列在A和B族中相同的肽GEHT (在A族的8047成熟序列和B族的MC来自菌株8047的全长fHbp序列的氨基酸27-273，具有组氨酸标签-LVL490的核酸序列-融合蛋白LVL491的氨基酸序列-LVL491的核酸序列-融合蛋白A (LVL511)氨基酸序列-融合蛋白A的核酸序列-融合蛋白B (LVL512)氨基酸序列-融合蛋白B的核酸序列-融合蛋白C (LVL513)氨基酸序列SEQ ID NO: 25 -融合蛋白C的核酸序列SEQ ID NO: 26 -融合蛋白E (LVL514)氨基酸序列SEQ ID NO: 27 -融合蛋白E的核酸序列。

本公开内容一般地涉及嵌合的fHbp蛋白。
术语嵌合的fHbp蛋白和fHbp融合蛋白可以在本文中可互换地使用，表示本文公开的包含来自不同fHbp家族的区域的蛋白。
本公开内容鉴别了 2个fHbp蛋白家族A和B，因而允许用来自2个家族的序列构建嵌合的fHbp融合蛋白，从而提供针对脑膜炎奈瑟球菌感染或疾病的保护。
在第一个方面，本公开内容涉及包含氨基酸序列Fl和F2的融合蛋白，其中Fl是第一个fHbp氨基酸序列的N-端片段，且F2是第二个fHbp氨基酸序列的C-端片段。
在一个方面，所述融合蛋白包含来自fHbp家族B的Fl N-端片段和来自fHbp家族A的F2 C-端片段。
所述Fl片段可以含有来自fHbp的N端部分(适当地，来自fHbp的残基1_139)的任意10个邻接氨基酸，为了避免疑问，其不一定包括fHbp的氨基酸1-10。类似地，所述F2 片段可以含有来自fHbp的C端部分(适当地，从fHbp的残 基139开始)的任意10个邻接氨基酸，为了避免疑问，其不一定包括fHbp的最后10个氨基酸。
在一个方面，Fl和F2的长度是至少10个氨基酸，但是适当地包含20个氨基酸， 适当地30个氨基酸，适当地40个氨基酸，适当地50个氨基酸，适当地60个氨基酸，适当地 70个氨基酸，适当地80个氨基酸，适当地90个氨基酸，适当地100个氨基酸，适当地110个氨基酸，适当地120个氨基酸，适当地邻接地取自fHbp蛋白的氨基酸序列。
在一个方面，当关于第一个和第二个fHbp家族序列之间的比对进行考虑时，所述 Fl和F2片段不包含重叠序列。
在一个方面，所述融合蛋白Fl + F2具有至少200个氨基酸(适当地至少210、至少 220、至少230、至少240、至少250个氨基酸)的组合长度，且在一个方面，是254个氨基酸的全长HffiP蛋白。
本公开内容的任何融合蛋白的2个部分Fl和F2不需要直接相连，且可以包括在 Fl和F2之间的连接物。但是，在一个方面，所述Fl和F2部分直接相连。
任选地，所述融合蛋白可以具有添加、置换或删除。
在一个方面，所述序列的Fl和F2部分都包含免疫原性的表位。
在一个方面，所述序列的Fl或F2部分含有适用于制备针对A族和B族fHbp蛋白的抗体的表位。
Fl和F2适当地是选自天然存在的fHBP序列的片段,适当地来自奈瑟球菌属,适当地来自脑膜炎奈瑟球菌。
在一个方面，N端片段可以与fHbp家族B蛋白的成熟序列的140个N-端氨基酸 (适当地，fHbp蛋白的成熟序列的N-端135、136、137、138或139个氨基酸的全部或一部分) 等效或是其一部分。
B族菌株的氨基酸编号通常参照下面列出的MC58序列给出。通过与该序列的比对，可以容易地鉴别在其它家族成员中的等效位置。
B族fHbp蛋白的成熟序列的氨基酸残基1-137代表全长B族fHbp序列的氨基酸残基 66-202。
合适的片段是B族fHbp蛋白的成熟序列的氨基酸残基1-135、1-136、1-137、1-138 和 1-139、8-135、8-136、8-137、8-138 或 8-139。
成熟序列的残基1-137由下面Seq ID No.1所示的B族菌株MC58或B族其它菌株的等效区域来表示。


本发明涉及奈瑟球菌免疫原性组合物和疫苗领域、它们的生产和这样的组合物在药物中的用途。所述的嵌合fHbp(因子H结合蛋白)蛋白和包含所述蛋白的组合物会克服针对fHbp的免疫应答的问题，所述免疫应答对衍生出所述fHbp的脑膜炎球菌菌株是特异性的。