专利名称：皱纹盘鲍基因组dna的无损伤提取方法皱纹盘鲍(Haliotisdiscus hannai)属于软体动物门腹足纲、前鳃亚纲、原始腹足目，是鲍科贝类分布于我国北方的唯一种，也是辽宁和山东沿海海水养殖的重要对象。利用现代分子生物学技术，对皱纹盘鲍进行群体遗传结构分析和遗传改良等操作，均必须对皱纹盘鲍的基因组DNA进行提取。传统的动物基因组提取方法主要是以肌肉组织或外周血细胞为DNA提取对象，这些方法都会不可避免地导致皱纹盘鲍处于应激状态，造成永久性损伤甚至死亡，无法使试验对象继续应用于生产。目前，国际贝类育种已开始流行基于亲权鉴定的Walk-back选择法，而采用此种方法必须在选择前对子代贝类的家系归属进行鉴定，因此现在需要采用一种无损伤的DNA提取方法，以免影响鲍的存活能力和生产性能。
本发明是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种简单、高效、便捷，且不会对皱纹盘鲍造成损伤，不影响其存活能力和生产性能的皱纹盘鲍基因组DNA无损伤提取方法。本发明的技术解决方案是一种皱纹盘鲍基因组DNA的无损伤提取方法，其特征在于包括以下步骤 a、使用沾有70%-75%酒精的棉球对皱纹盘鲍的外套膜进行消毒和刺激，将处理后的皱纹盘鲍腹面朝上静置，待分泌粘液后，刮取0. 1-0. 2g粘液和表皮组织碎片的混合物，将该混合物中加入无水乙醇固定，冰上静置5-10分钟后，离心分离，取沉淀； b、所得沉淀中加入细胞裂解液，震荡混匀； C、在上步中获得的混合样品中加入6iil-20iil，5mg/ml-10mg/ml的蛋白酶K，在65°C的条件下消化3-5小时，且每15分钟震荡一次，消化完成后在4°C条件下冷却10-20分钟； d、在冷却后的样品中加入7.5M/L的NH4Ac,加入的体积为样品总体积的，冰上静置5-10分钟后，4°C条件下离心，取上清液；
e、在所得的上清液中加入与其体积相同的异丙醇，充分震荡混匀，冰上静置2-5分钟后，离心取沉淀；
f、所得沉淀用70%-75%的乙醇洗涤两次，室温下晒置5-10分钟，获得皱纹盘鲍基因组
DNA。本发明同现有技术相比，具有如下优点
本发明与传统的动物基因组DNA提取方法的主要区别是，通过75%的乙醇刺激皱纹盘鲍的外套膜，使其分泌粘液，并通过处理粘液即挂取粘液时一同获得的表皮组织碎片进而、提取基因组DNA。本方法的优点是首先，保护了取样个体的组织完整性，没有造成任何机械性损伤，通过不长的恢复期个体即可从应激状态中恢复过来，可以长期多次取样；其次，通过75%乙醇清洗，起到了消毒杀菌和减少外源DNA干扰的作用，有利于获得高质量的DNA。本方法所得DNA可广泛应用于皱纹盘鲍的种群遗传结构分析、系统进化和分子标记辅助育种等方面，也为利用分子手段连续监测特定个体的生长发育情况奠定了基础。同时本方法还可以应用于其它贝类如九孔鲍、栉孔扇贝等的育种上。因此可以说这种DNA提取方法具备了多种优点，特别适合于在本领域中推广应用，其市场和科研前景十分广阔。

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实施例一
皱纹盘鲍基因组DNA的无损伤提取方法，它包括以下步骤首先取鲜活皱纹盘鲍，用无菌人工海水反复冲洗3遍，使其腹面朝上，室温下静置5分钟。使用沾有70%酒精的棉球对皱纹盘鲍的外套膜进行消毒和刺激，将处理后的皱纹盘鲍腹面朝上静置5分钟，待分泌粘液后，刮取0. Ig粘液和表皮组织碎片的混合物，并将混合物放入离心管内，向离心管中加A 600微升无水乙醇进行样品固定，固定后的样品于冰上静置8分钟后，上离心机分离，取沉淀物；
在所得的沉淀物中加入细胞裂解液600微升，这里的细胞裂解液推荐选用Tris-Cl100 mM, EDTA 50 mM, 1% SDS, pH 8.0，并震荡混匀；
混勻后的样品中加入I的蛋白酶K(其浓度为10mg/ml),并在65°C条件下消化3小时，每15分钟震荡一次，消化完成后在4°C条件下冷却10分钟；
在冷却后的样品中加入7. 5M/L的NH4Ac,加入的体积为样品总体积的三分之一，在冰上静置5分钟后，4°C条件下离心，取上清液；
在获得的上清液中加入等体积的异丙醇，充分震荡混匀，在冰上静置2分钟后，离心取沉淀；
将所得的沉淀用70%的乙醇洗涤两次，并在室温下晒置5分钟，便获得皱纹盘鲍基因组DNA ;将基因组DNA在4°C的条件下保存在无水乙醇中，或溶解于适量的无菌水中备用即可。实施例二
皱纹盘鲍基因组DNA的无损伤提取方法，它包括以下步骤首先取鲜活皱纹盘鲍，用无菌人工海水反复冲洗3遍，使其腹面朝上，室温下静置5分钟。使用沾有72%酒精的棉球对皱纹盘鲍的外套膜进行消毒和刺激，将处理后的皱纹盘鲍腹面朝上静置5分钟，待分泌粘液后，刮取0. 15g粘液和表皮组织碎片的混合物，并将混合物放入离心管内，向离心管中加A 600微升无水乙醇进行样品固定，固定后的样品于冰上静置5分钟后，上离心机分离，取沉淀物；
在所得的沉淀物中加入细胞裂解液600微升，这里的细胞裂解液推荐选用Tris-Cl100 mM, EDTA 50 mM, 1% SDS, pH 8.0，并震荡混匀；
混勻后的样品中加入12ii I的蛋白酶K(其浓度为8mg/ml),并在65°C条件下消化4小时，每15分钟震荡一次，消化完成后在4°C条件下冷却15分钟；
在冷却后的样品中加入7. 5M/L的NH4Ac,加入的体积为样品总体积的三分之一，在冰上静置8分钟后，4°C条件下离心，取上清液；
在获得的上清液中加入等体积的异丙醇，充分震荡混匀，在冰上静置3分钟后，离心取沉淀；
将所得的沉淀用73%的乙醇洗涤两次，并在室温下晒置8分钟，便获得皱纹盘鲍基因组DNA ;将基因组DNA在4°C的条件下保存在无水乙醇中，或溶解于适量的无菌水中备用即可。实施例三
皱纹盘鲍基因组DNA的无损伤提取方法，它包括以下步骤首先取鲜活皱纹盘鲍，用无菌人工海水反复冲洗3遍，使其腹面朝上，室温下静置5分钟。使用沾有75%酒精的棉球对皱纹盘鲍的外套膜进行消毒和刺激，将处理后的皱纹盘鲍腹面朝上静置5分钟，待分泌粘液后，刮取0. 2g粘液和表皮组织碎片的混合物，并将混合物放入离心管内，向离心管中加入600微升无水乙醇进行样品固定，固定后的样品于冰上静置10分钟后，上离心机分离，取沉淀物；
在所得的沉淀物中加入细胞裂解液600微升，这里的细胞裂解液推荐选用Tris-Cl100 mM, EDTA 50 mM, 1% SDS, pH 8.0，并震荡混匀；
混勻后的样品中加入20 ii I的蛋白酶K(其浓度为5mg/ml),并在65°C条件下消化5小时，每15分钟震荡一次，消化完成后在4°C条件下冷却20分钟；
在冷却后的样品中加入7. 5M/L的NH4Ac,加入的体积为样品总体积的三分之一，在冰上静置10分钟后，4°C条件下离心，取上清液；
在获得的上清液中加入等体积的异丙醇，充分震荡混匀，在冰上静置5分钟后，离心取沉淀；
将所得的沉淀用75%的乙醇洗涤两次，并在室温下晒置10分钟，便获得皱纹盘鲍基因组DNA ;将基因组DNA在4°C的条件下保存在无水乙醇中，或溶解于适量的无菌水中备用即
可。

本发明公开一种皱纹盘鲍基因组DNA的无损伤提取方法，包括以下步骤用75%酒精对皱纹盘鲍的外套膜进行消毒和刺激，刮取粘液和表皮组织碎片的混合物，并对该混合物经过处理后离心分离取沉淀；在沉淀中加入细胞裂解液；蛋白酶K，经消化、震荡后冷却一段时间；并在样品中加入NH4Ac，离心取上清液；在上清液中加入异丙醇，震荡混匀后离心取沉淀；所得沉淀用乙醇洗涤，并室温下晒置5分钟，便获得皱纹盘鲍基因组DNA。这是一种简单、高效、便捷，且不会对皱纹盘鲍造成损伤，不影响其存活能力和生产性能的皱纹盘鲍基因组DNA无损伤提取方法。