专利名称：组织干细胞提取物及其制备方法和应用的制作方法乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。据资料统计，乳腺癌发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10%，在很多地区已经超过子宫癌，成为严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的肿瘤之一。乳腺癌的发病与患 者的遗传基因、生活习惯、常用食物、生育状况等紧密相关，不同人种、地域的乳腺癌发病率有着明显的区别。乳腺癌的高发地区，主要集中在北美、北欧和大洋洲，尤其白种女性居多。乳腺癌的中发地区，集中在南美、南欧和以色列。亚洲则是乳腺癌的低发地区。举例来说，美国白种女性一生乳腺癌发病率为13.1%，即平均每8-9人就有I人可能会患上乳腺癌，而亚洲女性的乳腺癌发病率为4-7%。WHO统计，全球每年新发乳腺癌达130万人左右，死亡50万人左右。在我国北京、上海、天津等大城市的乳腺癌发病已跃居女性各种癌瘤首位，而且有明显上升的趋势。黑素瘤是源于皮肤，粘膜，眼和中枢神经系统色素沉着区域的黑素细胞的恶性肿瘤。每年美国有25000个恶性黑素瘤新增病例，死亡约6000人，发病率在急速上升。日光照射是危险因素，同样危险因素还包括家族史，发生恶性斑痣，较大的先天性黑素细胞痣和发育不良性痣综合征。恶性黑素瘤在大小，形状和颜色(通常色素沉着)及局部侵袭和远处转移的倾向方面均有不同。该肿瘤扩散迅速，可在诊断数月后死亡。早期，非常表浅的病损5年治愈率可为100%。
本发明的目的是提供一种组织干细胞提取物及其制备方法和应用。本发明提供了一种制备组织干细胞提取物的方法，包括如下步骤(I)将离体的含有干细胞的小鼠组织的匀浆液离心，收集上清液；(2)将步骤(I)得到的上清液进行ConA琼脂糖凝胶柱层析，收集第0. 5-3柱体积的洗脱液；所述进行ConA琼脂糖凝胶柱层析时用溶液C进行洗脱；所述溶液C由溶质和溶剂组成，所述溶剂为20mM pH7. 4 Tris-HCl溶液，所述溶质及其在所述溶液C中的浓度如下10g/100mLa -D-吡喃葡萄糖、500mM NaClUmM PMSF ；(3)将步骤(2)得到的洗脱液进行Hitrap Q阴离子交换柱层析,用300_800mMNaCl的PBS溶液进行线性梯度洗脱，共洗脱20个柱体积，收集用400_450mM NaCl的PBS溶液洗脱得到的洗脱液；(4)将步骤(3)得到的洗脱液进行截留分子量为50KD的浓缩，得到组织干细胞提取物。将所述组织干细胞提取物进行电泳和Western Blot鉴定，发现含有热休克蛋白gp960 所述离体的含有组织干细胞的小鼠组织可为离体的小鼠胎盘、小鼠脐带血或小鼠骨髓。所述步骤(I)中，所述离心的步骤具体如下将所述勻衆液16500g离心Ih,收集上清液，然后16500g离心50min，收集上清液。所述步骤(2)中，所述进行ConA琼脂糖凝胶柱层析的方法具体如下将步骤(I)得到的上清液与溶液B混合，得到上样液，上样于ConA琼脂糖凝胶柱，用所述溶液C进行洗脱，收集第0. 5-1. 5柱体积的洗脱液，然后孵育50分钟，再接着收集I. 5个柱体积的洗脱液，共得到2. 5柱体积的洗脱液。所述ConA琼脂糖凝胶柱中ConA琼脂糖凝胶的型号具体可为Con A Sepharose4B (购自GE公司，产品号17-0440-01);所述Hitrap Q 阴离子交换柱中，Hitrap Q的型号具体可为HiTrap Q HP(购自GE公司，产品号17-1153-01)。将所述组织干细胞提取物进行电泳和Western Blot鉴定时所述电泳可采用SDS-PAGE，如常规的10%浓度的蛋白凝胶电泳；所述Western Blot所用的一抗可为热休克蛋白gp96单克隆抗体(如购自santa cruz,产品号sc_56399),所用的二抗可为HRP标记的IgG抗体(如购自SER0TEC公司，产品号为STAR117P)。以上任一所述方法制备得到的组织干细胞提取物也属于本发明的保护范围。所述组织干细胞提取物中含有热休克蛋白gp96。所述组织干细胞提取物可用于制备预防和/或治疗癌症的药物(或疫苗)。所述癌症具体可为黑色素瘤(如B16黑色素瘤细胞引起的黑色素瘤)或乳腺癌(如4T1乳腺癌细胞引起的乳腺癌)。所述药物(或疫苗)具体可抑制所述黑色素瘤的生长(如抑制所述黑色素瘤体积增大)和/或发生。本发明还保护一种预防和/或治疗癌症的药物(或疫苗)，它的活性成分为所述组织干细胞提取物(含有热休克蛋白gp96)。所述癌症具体可为黑色素瘤(如B16黑色素瘤细胞引起的黑色素瘤)或乳腺癌(如4T1乳腺癌细胞引起的乳腺癌)。所述药物(或疫苗)具体可抑制所述黑色素瘤的生长(如抑制所述黑色素瘤体积增大)和/或发生。将本发明的提取物作为疫苗或药物时，可在制备得到提取物后进行内毒素检测、无菌检测、浓度测定后分装，直接冻存或者冻干后保存。应用本发明的提取物作为疫苗或药物，针对免疫对象，免疫剂量为每次不少于IOii g，总共不少于5次，采取皮下注射、皮内注射或腹腔注射方式进行免疫。本发明的提取物免疫数周后，可引发机体的特异免疫反应，清除体内肿瘤干细胞和/或肿瘤休眠细胞，以及癌变的细胞，从而达到预防和治疗癌症的目的。本发明的提取物可作为肿瘤预防性疫苗，用于自体或异体肿瘤防治，降低健康人群中癌症的发生率，也可作为肿瘤治疗性疫苗，患者术后即时施治能有效防转移防复发，或作为化学疗法的辅助治疗。本发明的提取物也可以用于异体肿瘤的免疫防治。图I为组织干细胞提取物的western blot鉴定图。图2为组织干细胞提取物对诱发的黑色素瘤的预防作用(肿瘤体积)。图3为组织干细胞提取物对诱发的乳腺癌的预防作用(肿瘤体积)。图4为组织干细胞提取物对诱发的黑色素瘤的预防作用(ELISP0T实验)。图5为组织干细胞提取物对诱发的乳腺癌的预防作用(ELISP0T实验)。图6为组织干细胞提取物对自发乳腺癌的预防作用(肿瘤体积)。图7为组织干细胞提取物对自发乳腺癌的预防作用(ELISP0T实验)。图8为组织干细胞提取物对诱发的黑色素瘤的治疗作用(肿瘤体积)。图9为组织干细胞提取物对诱发的黑色素瘤的治疗作用(ELISPOT实验)。图10为组织干细胞提取物对诱发的乳腺癌的治疗作用(肿瘤体积)。 图11为组织干细胞提取物对诱发的乳腺癌的治疗作用(ELISP0T实验)。图12为组织干细胞提取物对自发乳腺癌的治疗作用(肿瘤体积)。图13为组织干细胞提取物对自发乳腺癌的治疗作用(ELISP0T实验)。图14为组织干细胞提取物免疫后鼠淋巴细胞对黑色素瘤的治疗作用(肿瘤体积)。图15为组织干细胞提取物免疫后鼠淋巴细胞对黑色素瘤的治疗作用(ELISP0T实验)。图16为组织干细胞提取物免疫后鼠淋巴细胞对乳腺癌的治疗作用(肿瘤体积)。图17为组织干细胞提取物免疫后鼠淋巴细胞对乳腺癌的治疗作用(ELISP0T实验)。
(3) 16500g离心50min，弃沉淀，取上清(上清体积为X)。(4)在步骤(3)得到的溶液中加入X/9体积的溶液B，得到上样液；所述溶液B的溶剂为 20mM Tris-HCl (pH7. 4)溶液，溶质及其浓度如下2mM MnCl2,2mM CaCl2,500mM NaCl,PMSF ImM。(5)给预先平衡后的ConA琼脂糖凝 胶柱(Con A Sepharose 4B,购自GE公司，产品号17-0440-01，层析柱的内径和柱长是I. 6X2. 5cm)上样。(6)用清洗液清洗柱子，直到没有蛋白检测出(A280 < 0. 01);所述清洗液为将溶液B用水稀释至10倍体积得到的溶液。(7)用溶液C洗脱柱子，前0. 5个柱体积不要，然后收集I个柱体积，然后使柱子孵育50min，再收集I. 5个柱体积，共得到2. 5个柱体积的ConA洗脱液；所述溶液C的溶剂为20mM Tris-HCl (pH7. 4)溶液，溶质及其浓度如下10% (10g/100mL) a-D-吡喃葡萄糖、500mM NaClUmM PMSF。(8)用ConA洗脱液给Hitrap Q阴离子交换柱(HiTrap Q HP ;购自GE公司，产品号17-1153-01 ;内径和柱长是0. 7x2. 5cm)上样。(9)用300-800mM NaCl的PBS溶液进行线性梯度洗脱，流速lml/min，共洗脱20个柱体积，收集400-450mM NaCl的洗脱液。(10)将步骤(9)得到的洗脱液用millipore超滤管(型号为50KDa、15ml)浓缩到5mg/ml，即为组织干细胞提取物(分别为胎盘提取物、脐带血提取物或骨髓提取物)，在-70°C条件下冻存。将组织干细胞提取物(分别为胎盘提取物、脐带血提取物或骨髓提取物)进行常规10% SDS-PAGE蛋白凝胶电泳和Western Blot免疫印迹试验。western blot所用的一抗为热休克蛋白gp96单克隆抗体(购自santa cruz,产品号sc_56399), 二抗为HRP标记的IgG抗体，购自SER0TEC公司，产品号为STARl 17P。Western Blot杂交鉴定试验结果见图I (泳道I为胎盘提取物、2为脐带血提取物、3为骨髓提取物)。将胎盘提取物、脐带血提取物和骨髓提取物分别用PBS溶液进行稀释，进行实施例2、实施例3和实施例4的实验。实施例2、组织干细胞提取物对黑色素瘤和乳腺癌的预防作用一、组织干细胞提取物对诱发的黑色素瘤和乳腺癌的预防作用将C57BL/6小鼠分成四组，每组20只，分别进行如下处理第一组腹部皮下注射胎盘提取物(稀释液)，免疫两次(每次0. 2ml)，胎盘提取物的单次免疫剂量为20ug/只；第二组腹部皮下注射脐带血提取物(稀释液)，免疫两次(每次0. 2ml)，脐带血提取物的单次免疫剂量为20ug/只；第三组腹部皮下注射骨髓提取物(稀释液)，免疫两次(每次0. 2ml)，骨髓提取物的单次免疫剂量为20ug/只；第四组腹部皮下注射0. 2ml PBS溶液，免疫两次。以上四组中实验第I天进行第一次免疫；第7天进行第二次免疫；第14天将每组分成两个亚组(每个亚组10只；1亚组和II亚组)，I亚组皮下接种B16黑色素瘤细胞(每只皮下注射5X IO4个细胞)，II亚组皮下接种4T1乳腺癌肿瘤细胞(每只皮下注射2X IO6个细胞)；自接种黑色素瘤细胞(或乳腺癌肿瘤细胞)开始计天数，每天检测肿瘤生长，第28天进行ELISPOT实验检测并统计肿瘤发生率。I亚组接种肿瘤细胞后第I至33天的肿瘤体积变化(平均值)见图2。II亚组接种肿瘤细胞后第I至33天的肿瘤体积变化(平均值)见图3。肿瘤体积计算公式V =
ab2/6 (V-体积，a-肿瘤长径，b_肿瘤短径)。I亚组的ELISPOT实验检测步骤如下处死小鼠，分离脾脏淋巴细胞，用B16黑色素瘤细胞(死细胞)刺激一周，测特异性有活性的CTL数目。ELISPOT检测试剂盒购自深圳达科为公司，产品号DKW22-2000-096，操作方法见试剂盒产商说明书。结果见图4。II亚组的ELISPOT实验检测步骤如下处死小鼠，分离脾脏淋巴细胞，用4T1乳腺癌细胞(死细胞)刺激一周，测特异性有活性的CTL数目。ELISPOT检测试剂盒购自深圳达 科为公司，产品号DKW22-2000-096，操作方法见试剂盒产商说明书。结果见图5。肿瘤发生率(肿瘤直径大于2毫米的小鼠的比例)统计结果见表I。表I肿瘤发生率统计结果


本发明公开了一种组织干细胞提取物及其制备方法和应用。本发明的方法包括如下步骤(1)将含干细胞的小鼠组织匀浆液离心，收集上清；(2)将上清进行ConA琼脂糖凝胶柱层析，收集洗脱液；(3)将洗脱液进行Hitrap Q阴离子交换柱层析，收集洗脱液；(4)将洗脱液进行浓缩，得到组织干细胞提取物。本发明的提取物免疫数周后，可引发机体的特异免疫反应，清除体内肿瘤干细胞和/或肿瘤休眠细胞，以及癌变的细胞，从而达到预防和治疗癌症的目的。本发明的提取物可作为肿瘤预防性疫苗，用于自体或异体肿瘤防治，降低健康人群中癌症的发生率，也可作为肿瘤治疗性疫苗，患者术后即时施治能有效防转移防复发，或作为化学疗法的辅助治疗。