专利名称：银杏提取物的用途的制作方法本发明涉及到银杏叶提取物或分离出的银杏苦内酯B(GKB)(银杏叶提取物的一种成分)在需要这些物质的患者细胞内减少外周型苯二氮?受体(PBR)表达的方法中的用途。进一步地，本发明涉及到银杏叶提取物或分离的GKB在需要的患者内减少癌细胞增生的方法中的用途。更具体地，本发明涉及到银杏叶提取物或分离的GKB在需要的患者内减少癌细胞增生的方法中的用途，其中所述的癌细胞是人乳癌细胞。甚至更具体地，本发明涉及到银杏叶提取物或分离的GKB在需要的患者内减少癌细胞增生的方法中的用途，其中所述的癌细胞是攻击性和侵染性表型并且表达的PBR水平高于非攻击性癌细胞。另一方面，本发明涉及到银杏叶提取物减少35个基因产物表达的用途，它在下文中进一步详述。已知为EGB 761?(IPSEN的产品，巴黎，法国)的银杏叶提取物特定制剂作为组合物的成分或用于本发明的方法是优选的。银杏是最古老的树中的一种，其叶的提取物已经用于传统医学几百年了。已经有大量的研究，介绍银杏提取物对患有失眠症、记忆和与年老和衰老有关的认识功能障碍的病人，以及患有所有类型的痴呆、情绪改变的病人和应付每天紧张性刺激的能力的有益效果。这些研究的大多数，已经采用标准化的银杏叶提取物，术语为EGB 761?。该提取物已知具有心脏保护作用(DeFeudis F.V.Ginkgo biloba extract(EGB 761?)from chemistry toclinic.Ullstein Medical，Wisbaden，Germany.400 pp.1998；Tosaki，A.，Droy-Lefaix，M.T.，Pali，T.，and Das，D.K.，Free Rad.Biol.Med.，14361-370，1993)。这些作用已经至少部分有助于EGb 761?的自由基清除性能，这大概归因于提取物中类黄酮或萜类成分的存在。最近的体内和体外研究证实EGB 761?的萜成分，银杏苦内酯和白果内酯，具有抗氧化性能(Pietri，S.，Maurelli，E.，Drieu，K.，and Culcasi，M.，J.Mol.Cell.Cardiol.，29733-742，1997；Yao，Z.，Boujrad，N.，Drieu，K.，and Papadopoulos，V.，Adv.Ginkgo Biloba Res.7129-138，1998)。其它的EGB 761?研究已经报道该产品在治疗包括与老龄化和衰老有关脑血管的和外周血管机能不全的各种临床疾病中的医疗价值。参见，例如Ginkgo biloba Extract(EGB 761?)Pharmacological Activities and Clinical Applications，DeFeudis，F.V.，Eds，Elsevier，1991；and Ullstein Medical 1998，Ginkgo biloba extract(EGB 761)，Eds.Wiesbaden，DeFeudis，F.V.这种提取物含有24％的银杏黄酮苷、6％的萜内酯(银杏苦内酯和白果内酯)、大约7％的原花青素(proanthocyanidins)和几种其它成分。参见Boralle，N.，等，InGinkgolides，Chemistry，Biology，Pharmacology and Clinical perspectives，EdBraquet，P.，J.R.Prous SciencePublishers，1988。肿瘤发生(Tumor progression)是一种多步骤过程，其中正常细胞逐渐地获得更多的恶性的表型，包括侵入组织和形成转移瘤的能力，这是乳癌死亡率的主要原因。在这种过程中，大量基因产物的＂异常的＂表达可能是肿瘤发生的原因或结果。考虑到肿瘤发生的第一步是细胞增生，可提出肿瘤发生和恶性肿瘤涉及到潜在的肿瘤细胞的增生。大量肿瘤的研究，例如含有神经胶质瘤的鼠脑(Richfield，E.K.等(1988)Neurology 381255-1262)，结肠腺癌和卵巢癌(Katz，Y.等(1988)Eur.J.Pharmacol.148483-484和Katz，Y.等(1990)Clinical Sci.78155-158)，与正常的组织比较已经显示丰富的外周型苯二氮?受体(PBR)。此外，在人脑神经胶质瘤或星形细胞瘤中发现PBR密度相对于正常软组织升高12倍(Cornu，P.等(1992)Acta Neurochir.199146-152)。作者提出PBR密度可能反映这些组织中受体的增生活性。最近，进一步显示了细胞增生涉及PBR(Neary，J.T.等(1995)Brain Research 67527-30；Miettinen，H.等(1995)CancerResearch 552691-2695)，并且发现人星形细胞瘤PBR的表达与肿瘤恶性和增生指数相关(Miettinen，H.等supra；Alho，H(1994)Cell Growth Different.51005-1014)。进一步的研究显示PBR受体在人成胶质细胞瘤中是丰富的(Broaddus，W.C.，等，Brain Research，Vol.518199-208，1990；和Pappata，S.，等，J.Nuclear Med.，321608-1610，1991)。PBR是一种18-kDa蛋白，它被发现是不同于GABA神经递质受体的苯二氮?受体的一类结合位点(Papadopoulos，V.(1993)Endocr.Rev.14222-240)。PBR在类固醇生成细胞中是极其丰富的，并且主要发现位于外侧的线粒体膜(Anholt，R.等(1986)J.Biol.Chem.261576-583)。PBR被认为是由18-kDa异喹啉-结合蛋白和34-kDa成孔电压依赖性阴离子信道蛋白组成的多聚体(multimeric)复合物的部分，优选位于外侧/内侧线粒体膜接触位点(McEnery，M.W.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.893170-3174；Garnier，M.等(1994)Mol.Pharmacol.45201-211；Papadopoulos，V.等(1994)Mol.Cel.Endocr.104R5-R9)。在体外试验中，PBR的药物配体与受体结合后，刺激类固醇生成细胞合成类固醇(Papadopoulos，V.等(1990)J.Biol.Chem.2653772-3779；Ritta，M.N.等(1989)Neuroendocrinology 49262-266；Barnea，E.R.等(1989)Mol.Cell Endocr.64155-159；Amsterdam，A.and Suh，B.S.(1991)Endocrinology 128503-510；Yanagibashi，K.等(1989)J.Biochem.(Tokyo)1061026-1029)。同样地，体内研究显示高亲和力的PBR配体增加垂体切除大鼠的类固醇血浆浓度(Papadopoulos V.等(1997)Steroids 6221-28)。关于分离出的线粒体的进一步体外研究提供这样的证据，PBR配体、药物配体或内源性PBR配体、多肽地西泮结合抑制剂(BDI)(Papadopoulos，V.等(1997)Steroids 6221-28)，通过增加胆固醇从线粒体膜外侧至内侧的转运速率，刺激孕烯醇酮形成(Krueger，K.E.andPapadopoulos，V.(1990)J.Biol.Chem 26515015-15022；Yanagibashi，K.等(1988)Endocrinology 1232075-2082；Besman，M.J.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.864897-4901；Papadopoulos，V.等(1991)Endocrinology1291481-1488)。基于18-kDa PBR的氨基酸序列，建立三维模型(Papadopoulos，V.(1996)InThe Leydig Cell.Payne，A.H.等(eds)Cache River Press，IL，pp.596-628)。这种模型显示容纳胆固醇分子并且起信道作用，支持PBR在胆固醇转运中的作用。最近我们通过经同源重组生成PBR阴性细胞，证实PBR在类固醇生成中的不利于产生类固醇的作用(Papadopoulos，V.等(1997)J.Biol.Chem.27232129-32135)。然而，胆固醇水溶性类似物、22R-羟基胆固醇的加入，恢复这些细胞中类固醇的生成，表明胆固醇转运机制被损害了。表达18-kDa PBR蛋白的细菌中，进一步的胆固醇转运试验提供了确定的起胆固醇信道/转运蛋白作用的证据(Li and Papadopoulos，V.等(1998)Endocrinology)。我们假设外周型苯二氮?受体是说明癌内增长的攻击行为的细胞和分子功能变化的一部分，并且我们选择在人乳癌中检查这种假设。乳癌是最普通的瘤并且是大多数发展中国家内妇女的癌相关死亡的主要原因(Lippman，M.E.(1993)Science 259631632)，单单在美国每年大约感染184,000名妇女，超过46,000人死亡(American Cancer Society，1996)。人乳癌不像脑和生殖腺细胞，不产生类固醇，但是如体内许多其它的细胞，能够代谢类固醇。
增长的PBR表达与肿瘤细胞增长的攻击行为相关。攻击性的肿瘤侵入并在局部生长，但是它们不会转移。然而，侵袭性肿瘤具有通过血管侵入和转移至人体不同部位的能力。肿瘤转移入重要器官(例如肺)是最普遍的死亡原因。
高水平的PBR表达和人乳癌潜在的转移性之间的相互关系如1998年3月25日提交的待批美国申请No.09/047,652所示，其中本申请的VassiliosPapadopoulos是共同发明人。然而，由于细胞增生中PBR的作用，以及细胞内PBR的表达，对于其它实体瘤和癌，例如前列腺癌、结肠癌、脑瘤和如生殖腺瘤的一些命名的类固醇生成组织内的肿瘤，这种相互关系存在是很有可能的。
另一方面，本发明涉及到在需要这种抗争的患者中抗争癌细胞增生的方法，其中增生由具有调节肿瘤细胞作用的蛋白表达失调引起，它包括给予所述患者有效量的银杏提取物或分离出的银杏苦内酯B。
另一方面，本发明涉及到在需要这种抗争的患者中抗争癌细胞增生的方法，其中增生由具有调节肿瘤细胞作用的蛋白超表达引起，它包括给予所述患者有效量的银杏提取物或分离出的银杏苦内酯B。
另一方面，本发明涉及到在需要这种抗争的患者中抗争具有攻击性表型的癌细胞增生的方法，其中增生由外周型苯二氮?受体蛋白超表达引起，它包括给予所述患者有效量的银杏提取物或分离出的银杏苦内酯B。
另一方面，本发明涉及到通过在需要这种抗争的患者中减少所述癌基因的表达，抗争癌细胞增生的方法，这里的增生由癌基因的超表达引起，它包括给予所述患者有效量的银杏提取物或分离出的银杏苦内酯B。刚刚述及的方法中优选的方法是这样的方法，所述的致癌基因是APC，PE-1，RhoA和c-Jun的一种或多种。
另一方面，本发明涉及到在需要这样减少的患者中减少癌细胞内外周型苯二氮?受体表达的方法，其中所述的癌细胞表达异常水平的与正常癌细胞有关的外周型苯二氮?受体，它包括给予所述患者有效量的银杏提取物或分离出的银杏苦内酯B。刚刚述及方法的优选方法是这样的方法，其中癌细胞是人乳癌细胞；人成胶质细胞瘤；人脑瘤；人星形细胞瘤；人结肠癌；人结肠腺癌；人卵巢癌；和人肝细胞癌。
另一方面，本发明涉及到在需要这样减少的患者中减少癌细胞内外周型苯二氮?受体mRNA表达的方法，它包括给予所述患者有效量的银杏提取物或分离出的银杏苦内酯B。
另一方面，本发明涉及到在需要这样增加的患者中增加c-Myc原癌基因表达的方法，它包括给予所述患者有效量的银杏提取物或分离出的银杏苦内酯B。
另一方面，本发明本发明涉及到在需要这样减少的患者中减少细胞周期调节因子prothymosin-α、CDK2、p55CDC、成髓细胞素和p120增生细胞核抗原(PCNA)，它包括给予所述患者有效量的银杏提取物或分离出的银杏苦内酯B。
另一方面，本发明涉及到在需要这样减少的患者中减少细胞内信号转导调节因子NET1和ERK2表达的方法，它包括给予所述患者有效量的银杏提取物或分离出的银杏苦内酯B。
另一方面，本发明涉及到在需要这样减少的患者中减少编程性细胞死亡有关的蛋白质腺苷A2A受体、Flt3配体、Grb2、Clusterin、RXR-β、谷胱甘肽S-转移酶P、N-Myc、TRADD、SGP-2和NIP-1的方法，它包括给予所述患者有效量的银杏提取物或分离出的银杏苦内酯B。
另一方面，本发明涉及到在需要这样减少的患者中减少转录因子Id-2、ATF-4、ETR101和ETR-103表达的方法，它包括给予所述患者有效量的银杏提取物或分离出的银杏苦内酯B。
另一方面，本发明涉及到在需要这样减少的患者中减少生长因子巨噬细胞集落刺激因子-1、肝素-结合EFG-状生长因子、肝细胞生长因子-状蛋白和抑制素α表达的方法，它包括给予所述患者有效量的银杏提取物或分离出的银杏苦内酯B。
另一方面，本发明涉及到在需要这样减少的患者中减少细胞粘着分子CD19 B-淋巴细胞抗原、L1CAM、β-连环蛋白、整联蛋白亚基α3、α4、α6、β5和αM表达的方法，它包括给予所述患者有效量的银杏提取物或分离出的银杏苦内酯B。
另一方面，本发明涉及到在需要这样减少的患者中减少基因APC，PE-1，RhoA，c-Jun，prothymosin-a，CDK2，p55CDC，成髓细胞素，p120增生性-细胞核抗原(PCNA)，NET1，ERK2，腺苷A2A受体，Flt3配体，Grb2，Clusterin，RXR-β，谷胱甘肽S-转移酶P，N-Myc，TRADD，SGP-2，NIP-1，Id-2，ATF-4，ETR-101，ETR-103，巨噬细胞集落-刺激因子-1，肝素-结合EGF样生长因子，肝细胞生长因子样蛋白，抑制素α，CD19 B-淋巴细胞抗原，L1CAM，β-连环蛋白，和整联蛋白亚基α3、α4、α6、β5和αM的表达方法，它包括给予所述患者有效量的银杏提取物或分离出的银杏苦内酯B。
另一方面，本发明涉及到包括抗争癌症有效量的银杏提取物或分离出的银杏苦内酯B以及药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。
所有前述方法和本发明的组合物中，每个优选的实施方案内银杏提取物是EGB 761?。
进一步地，所有前述的方法和本发明的组合物中，采用银杏苦内酯B是优选的。


图1.各种浓度的EGB 761?对MDA-231 PBR配体结合力的作用。如材料和方法项下所介绍的那样培养MDA-231细胞。以指明浓度的可注射形式的EGB 761?处理细胞。在指定的时间内收集细胞，通过Scatchard分析测定PBR配体结合特性。数据点表示实施三份的三个独立实验的平均值±S.D.。
图2.各种浓度的GKB对MDA-231 PBR配体结合力的作用。如材料和方法项下所介绍的那样培养MDA-231细胞。以指明浓度的GKB处理细胞48小时。接着在指定的时间期限收集细胞，通过Scatchard分析测定PBR配体结合特性。数据点表示实施三份的两个独立实验的平均值±S.D.。
图3.EGB 761?和GKB对MDA-231细胞内PBR mRNA水平的影响。不以或者以20(EGb-20)或200(EGb-200)μg/ml EGB 761?或2(GKB-2)或20(GKB-20)μg/ml GKB处理细胞48小时。在培养结束时，分离总RNA并以10μg/泳道荷载在1％甲醛凝胶上。以32P-标记的hPBR探针培养Northern印迹并曝光于XOMAT柯达胶卷。上部，印迹的放射自显影图。PBR迁移0.9Kb。底部，相对强度的PBR mRNA/28S核糖体RNA通过溴化乙锭染色显影。这种放射白显影图和PBR mRNA定量表示两项独立实验中的一项。
图4.EGB 761?对MDA-231细胞增生的影响。生长在96孔板上的MDA-231细胞以PBS洗涤并在补充10％FBS、含或不含指定浓度EGB 761?的培养基中培养4小时，培养结束之前，向每孔中加入溴脱氧尿苷(BrdU)。于450nm测量掺入的BrdU(参照＝700nm)。数据点表示四份、四个独立试验的平均值±S.D.。单向ANOVA表明经EGB 761?处理后在48、72和96小时时间点MDA-231细胞增生显著改变(P＜0.0001)。
图5右、中、左.除去EGB 761?后MDA-231细胞增生的回收率。生长在96-孔板的MDA-231细胞以PBS洗涤，并在补充10％FBS、含或不含2(左)、20(中)或200(右)μg/ml EGB 761?的培养基中培养48小时。在处理结束时，洗涤细胞并在不含EGB 761?的培养基中培养48小时。培养结束之前4小时，向每个孔中加入溴脱氧尿苷(BrdU)。于450nm测量掺入的BrdU(参照＝700nm)。数据点表示四份、两个独立试验的平均值±S.D.。
图6.GKB对MDA-231细胞增生的影响。生长在96孔板上的MDA-231细胞以PBS洗涤并在补充10％FBS、含或不含的2μg/ml或20μg/ml GKB的培养基中培养48小时，培养结束之前4小时，向每孔中加入溴脱氧尿苷(BrdU)。于450nm测量掺入的BrdU(参照＝700nm)。数据点表示四份、两个独立试验的平均值±S.D.。单向ANOVA表明MDA-231细胞增生经GKB处理后显着改变(P＜0.0001)。
图7.EGB 761?和GKB对MCF-7细胞增生的影响。如图4关于MDA-231细胞所介绍，MCF-7细胞生长于96孔板。不以或者以20(EGb-20)或200(EGb-200)μg/ml EGB 761?，或2(GKB-2)或20(GKB-20)μg/ml GKB处理MCF-7细胞48小时。培养结束之前4小时，向每孔中加入溴脱氧尿苷(BrdU)。于450nm测量掺入的BrdU(参照＝700nm)。数据点表示四份、两个独立试验的平均值±S.D.。单向ANOVA表明经EGB 761?或GKB处理后，与MDA-231细胞增生相比，MCF-7细胞增生较小程度改变。
图8.EGB 761?对MDA-231细胞游离基生成的作用。以2(EGb-2)、20(EGb-20)或200(EGb-200)μg/ml的EGB 761?处理MDA-231细胞48小时。接着洗涤细胞，并且采用材料和方法项下介绍的荧光探针DCF测量细胞氧化应激水平。结果显示为平均值±S.D.(n＝4)。统计学分析表明EGB 761?的作用不显着。
图9.EGB 761?的转录效应表明对细胞增生涉及的基因的作用。结果显示含有588PCR-扩增cDNA片段(Clontech公司)的Atlas人cDNA表达阵列的典型定量分析。从对照组或EGB 761?(20μg/ml)处理48小时的MDA-231细胞获得mRNAs。为了校正mRNA丰度，采用该阵列内提供的持家基因校正由图像分析得到的密度计值。只有一致显着的超过30％的变化才被考虑。
图10.以EGB 761?或GKB处理之后裸鼠内MDA-231异种移植物的生长。具有100-150mm3开始体积的MDA-231肿瘤的动物，或者口服50mg/kg EGB 761?或者ip 1mg/kg GKB每天一次，这样治疗一个月。治疗结束后将动物保养30多天，接着在第60天处死。显示的数据是平均值±S.E.M.(n＝10)。统计学分析表明与它们各自的对照相比，EGB 761?和GKB的作用是显着的(p＜0.05)。
图11A、B、C、D、E、F、G、H.来自对照组和EGB 761?或GKB治疗动物的MDA-231异种移植物内的PBR表达。如材料和方法节所述，将MDA-231异种移植物的福尔马林包埋切片用抗-PBR抗血清以1∶500稀释度作免疫染色。由以载体(A-D)、50mg/kg EGB 761?经口(E，G)或1mg/kgGKB ip(F，H)治疗的动物获得MDA-231瘤。A表示在载体治疗的动物的肿瘤中部发现的细胞，这里可轻易地观察到PBR蛋白的核定位(参见箭头)。B表示得自载体治疗的动物的肿瘤边缘的细胞内可见的免疫染色。位于得自载体治疗的动物的肿瘤边缘的细胞内可见的较高放大率的免疫染色如C所示。D表示以非特异性抗血清治疗的对照组。E表示在得自EGB 761?治疗的动物的肿瘤中部发现的细胞内PBR免疫染色。F表示在得自GKB治疗的动物的肿瘤中部发现的细胞内PBR免疫染色。G表示在得自EGB 761?治疗的动物的肿瘤边缘发现的细胞内PBR免疫染色。H表示在得自GKB治疗的动物的肿瘤中部发现的细胞内PBR免疫染色。箭头表示核。对于A，B，C，E，F，G和H，放大率是x 75，对于C为x 150。
详细说明术语＂银杏萜类＂包括所有源自裸子植物银杏树的天然存在的萜以及合成生产的银杏萜类和其药学上的活性衍生物及盐，以及它们的混合物。银杏萜类的例子包括银杏苦内酯。银杏萜类的例子公开于Ginkgolides，Chemistry，Biology，Pharmacology，and Clinical Perspectives，J.R.Provs.Science Publishers，Edited by P.Braguet(1988)；F.V.DeFeudis，GinkgoBiloba Extract (EGB 761?)；Pharmacological Activities and ClinicalApplications，Elsevier，Chapter II(1991)。
本文使用的术语＂银杏苦内酯＂包括以上引用的书本公开的各种银杏苦内酯以及它们的无毒药物活性衍生物。银杏苦内酯衍生物的例子包括四氢衍生物、乙酰基衍生物和烷基酯，例如Okabe，等人在J.Chem.Soc.(c)，pp.2201-2206(1967)公开的一乙酸酯衍生物或三乙酸酯衍生物。银杏苦内酯B具有下列结构，如本文采用的，指分离出的银杏苦内酯B 本文使用的术语＂银杏提取物＂包括含有萜类的天然分子的收集物，源自银杏树叶。优选地，该提取物是已知为EGB 761?的特定的银杏提取物制剂。
本文使用的术语＂抗争＂意指预防、抑制和或减小，无论单词＂抗争＂接着什幺使用，例如抗争癌细胞增生意指进一步预防和抑制癌细胞增生或者减小增生的程度或速度。
为了癌或肿瘤的诊断或预测起见，可以在几种水平检测PBR表达水平。采用本领域已知的标准方法，可设计PBR RNA的检测和定量试验，包括Northern杂交试验、原位杂交试验和PCR试验等试验。参见例如，Maniatis，Fitsch and Sambrook，Molecular Cloning；A Laboratory Manual(1982)orDNA Cloning，Volumes I and 11(D.N.Glover ed.1985)，或者CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel，F.M.等(Eds)，Wiley & Sons，Inc.对核酸杂交方法的一般描述。由得自保藏登记号为L21950的人PBR序列的序列，可设计检测PBR RNA的多核苷酸探针(Riond，J.等(1991)Eur.J.Biochem.195305-311；Chang，Y.J.等(1992)DNA and Cell Biol.11471-480)。其它来源例如牛(Parola，A.L.等(1991)J.Biol.Chem 26614082-14087)和小鼠(Garnier，M.等(1994)Mol Phar.45201-211)的PBR序列亦是已知的。
全序列PBR，正常或突变体，可以用于检测RNA表达的探针。或者，可以采用一部分或部分序列。设计探针的方法本领域是已知的。多核苷酸序列优选是同源于或者互补于PBR基因区，优选地，该区(多核苷酸从中衍生出)的序列同源于或互补于对PBR基因独特的序列。无论序列是否对PBR基因是独一无二的，它可通过本领域熟练技术人员已知的技术测定。例如，该序列可以与数据库(例如GenBank)的序列相比较。可衍生典型DNA序列的区域包括但并不限于，例如，编码特异表位区，以及非转录和非翻译区。
能够检测PBR的PBR配体或抗-PBR抗体或者配体和抗体的片段可以采用任意的各种标记物和标记方法加以标记，以便用于如乳癌等疾病的诊断和预测，尤其用于例如正电子发射断层显象和磁共振成像(Leong，D.等(1996)Alcohol Clin.Exp.Res.20601-605)。可用于本发明的标记物的类型包括但并不限于酶标记、放射性同位素标记、非放射性同位素标记和化学发光标记。
适合的酶标记的例子包括苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母-乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶(insomerase)、过氧化物酶、碱性磷酸酶、天门冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶、乙酰胆碱酯酶，等等。
适当的放射性同位素标记的例子包括3H，111In，125I，32P，35S，14C，57To，58Co，59Fe，75Se，152Eu，90Y，67Cu，21Ci，211At，212Pb，47Sc，109Pd，11C，19F，123I，等等。
适当的非放射性同位素标记的例子包括157Gd，55Mn，162Dy，52Tr，46Fe，等。
适当的荧光标记的例子包括152Eu标记、荧光素标记、异硫氰酸盐标记、罗丹明标记、藻红蛋白标记、藻蓝蛋白标记、别藻蓝蛋白标记、荧光胺标记，等等。
化学发光标记的例子包括鲁米那标记、异鲁米那标记、芳香吖啶嗡酯标记、咪唑标记、吖啶嗡盐标记、草酸酯标记、荧光素标记、荧光素酶标记，等等。
本文检测银杏提取物的作用，更具体地是EGB761?和GKB对PBR表达和细胞增生的作用，尤其是在人乳癌细胞中。我们采用高攻击性的MDA-231细胞系，它显示超过60倍的较高水平的PBR配体结合，以及有关非攻击性细胞系MCF-7的mRNA。EGB 761?和GKB以时间和剂量-依赖的方式减少MDA-231细胞的PBR表达和细胞增生，然而EGB 761?和GKB并不能在相同程度上影响MCF-7细胞增生。这种作用是可逆的并且它并不归因于试验化合物的抗氧化性能。
相对于未检出肿瘤的样品进行升高水平的PBR的测定。它可来自同一患者或不同患者。例如，紧接着外科清除实体瘤之后收集第一样品。采集随后的样品以监测肿瘤生长的再现和/或肿瘤细胞的增生。此外，其它的标准包括变化的攻击性表型的细胞，这样以致于可以读取攻击性表型的增加或减少。
在正常乳腺管上皮细胞的细胞质内PBR的不同亚细胞定位和核内染色的缺失及攻击性肿瘤细胞的核周面积提供简单的诊断攻击性表型肿瘤细胞的方法。采用能够结合PBR的标记PBR配体或抗体或标记PBR抗体或配体或抗体片段进行免疫染色，测定细胞样品的PBR亚细胞定位，又提供本发明另一个诊断试验。此外，识别PBR的抗血清也可合用与初级抗体反应的次级抗体。免疫染色试验是本领域公知的，并且在以下关于乳癌细胞和活组织检查的实施例中作进一步介绍。
当肿瘤细胞内的PBR水平大约是正常细胞PBR水平的2-3倍直到大约10-100倍于正常细胞的PBR量时，检测到PBR水平的升高。
细胞培养和处理。人乳癌细胞系(MCF-7和MDA-231)得自LombardiCancer Center，Georgetown University Medical Center。在聚苯乙烯培养皿(Corning)上培养细胞系并生长于补充10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)。采用注射形式(IPS200)的标准银杏提取物EGB761?。这种注射形式不含原花青素，已知它在体外与蛋白质交互作用(Defeuder，1998 Ullstein Medical)。由EGB 761?分离的EGB 761?和GKB(BN 52021)由Institut Henri Beaufour-IPSEN(巴黎，法国)提供。
放射性配体结合试验。将细胞从150mm培养皿刮入5ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)，通过研磨分散，并且在500×g离心15分钟。细胞颗粒再悬浮于PBS并检测蛋白浓度。有关50μg来自细胞悬浮液的蛋白的[3H]PK 11195结合研究如先前介绍的进行(Papadopoulos，V.等，1990，J.Biol.Chem.2653772-3779；Hardwick，M.等，1999，Cancer Research，59631-632)，它的内容本文一并参考。[N-甲基-3H]PK 11195(1-(2-氯苯基)-N-甲基-N-(1-甲基-丙基)-3-异喹啉酰胺；sp.Act.83.50(Ci/mmol)，得自Du Pont-New EnglandNuclear(Wilmington，DE)，PK 11195得自Research BiochemicalsIncorporated(Natick，MA)。通过LIGAND程序分析Scatchard图(Munson，PJ，and Robbard，D.1980，Anal.Biochem.，107220-239)(BIOSOFT，Ferguson，MO)。
蛋白测量。通过Bradford方法(Bradford，MM，1976，Anal.Biochem.，72248-254)，采用Bio-Rad Protein Assay试剂盒(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)并以牛血清白蛋白作为标准测量蛋白水平。
RNA(Northern)分析。用先前介绍的Northern印迹分析检测以各种化合物处理的MDA-231细胞中PBR mRNA的表达(Hardwick，M.等，1999，Cancer Research，59831-842)。简言之，采用RNAzol B试剂(TEL-TEST，Inc.，Friendswood，TX)和氯仿分离细胞总RNA。
将来自每个细胞系的20g总RNA加于1％琼脂糖凝胶并且彻夜转移至尼龙薄膜(S & S Nytran，Schleicher & Schuell，Keene，NH)(21)。0.2 kb人PBR(hPBR)cDNA片段(得自含全长hPBR的pCMV5-PBR质粒载体，它由Jerome Strauss博士友好提供，University of Pennsylvania，PA)以[α-32P]dCTP采用随机引物DNA标记系统(Life Technologies，Gaithersburg，MD)进行放射性标记。杂交条件如我们先前介绍的(Hardwick，M.，等，1999，CancerResearch，59831-842)。通过在-70℃曝光印迹至X-OMAT AR胶片(Kodak，Rochester，NY)4-48小时进行放射自显影。采用SigmaGel软件(JandelScientific，San Rafael，CA)进行PBR mRNA定量。
核酸阵列。我们采用Clontech的Atlas人cDNA表达阵列I(Palo Alto，CA)。该阵列含有固定在带正电荷尼龙薄膜上的588个200-500碱基对的人PCR-扩增cDNA片段。将MDA-231细胞以有或无20μg/ml EGB 761?处理48小时。从对照组和EGB 761?处理过的细胞分离聚腺苷酸化RNA。32P-标记的cDNA探针从每个聚腺苷酸化RNA产生，并且按照制造商的建议杂交Atlas阵列。通过在-70℃曝光印迹至X-OMAT AR胶片(Kodak，Rochester，NY)4-96小时进行放射自显影。采用SigmaGel软件进行可见杂交的定量(Jandel Scientific，San Rafael，CA)。采用多次曝光以便探测低水平表达的基因。采用三种内部对照物，遍在蛋白、G3PDH和β-肌动蛋白，以比较检出的基因产物在对照组和EGB 761?处理细胞内的相对表达水平。采用基因表达对内部对照的比率修正实验的差异。EGB 761?处理对每个基因产物的作用表示为对照组(未治疗)细胞的％。本文给出的结果显示受EGB 761?处理的基因的水平均在对照组的30％以上。
BrdU细胞增生试验。MDA-231细胞以在补充0.1％FBS的DMEM内，以大约10,000细胞/孔(24h培养)或者大约5,000细胞/孔(48h培养)的浓度，划板在96-孔板上(Corning，Corning，NJ)。然后将细胞在含各种浓度EGB761?或GKB的10％FBS内培养指定的时限。通过测量用BrdUELISA(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)测得的5-溴代-2′脱氧尿苷(BrdU)渗入量分析细胞增生的差异。在450nm测量掺入的BrdU(690nm参照)。
氧化应激分析。采用荧光探针二乙酸2，7-二氯荧光蛋白(2，7-DCF；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)如Goodman，Y.and Mattson，M.P.，Exp.Neurol.，1281-12，1994介绍的，测定细胞氧化应激水平。简言之，细胞在96-孔板内培养并以指定浓度的EGB 761?处理48小时。处理末尾，洗涤细胞并在含50μM 2，7-DCF的PBS中培养。接着采用Victor2定量检测荧光计(EGG-Wallac，Inc.，Gaithersburg，MD)测量荧光。
体内生物学评价。采用MDA-231人乳癌(雌激素不敏感)异种移植模型进行EGB 761?和GKB体内筛选。基于体外数据和先前公开的体内数据(23)，采用的剂量对于EGB 761?是50mg/kg，对于GKB是1mg/kg。雌性无胸腺的裸鼠(NCI/Charles River，Frederick，MD)皮下注射8×106MDA-231肿瘤细胞并且允许肿瘤形成～100至150mm3体积。此时，每种化合物10只动物经口给予EGB 761?或腹腔注射GKB，每天一次，持续一个月。治疗30天以及治疗结束后30天内，对于所有动物每周两次记录肿瘤大小和体重。处死动物，取出肿瘤，进行免疫组织化学处理。动物护理按照公共机构准则。
MDA-231肿瘤的免疫细胞化学。从以或者不以EGB 761?或GKB处理的鼠取出的MDA-231肿瘤在10％缓冲的福尔马林中固定。将肿瘤切片，置于玻片上并如我们以前介绍的进行处理(19)。对于抗-PBR初级抗体的免疫组织化学，以30％H2O2/甲醇混合物(1∶9比率)室温下处理组织切片5分钟以中和内源性过氧化物酶活性，接着以PBS洗涤。室温下将以PBS配制的10％小牛血清中的初级抗体以1∶500浓度加于切片1小时。采用辣根过氧化物酶-偶联的山羊抗-兔次级抗体进行次级抗体反应，该抗体在补充10％小牛血清PBS内以1∶500稀释。用PBS清洗玻片三次，每次2分钟之后，加入1∶500稀释的含3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)的新鲜H2O2，玻片在37℃培养1小时。然后在以水晶/装片(Crystal/Mount)封固之前在蒸馏水中清洗玻片。
统计学分析。以InStat单向变异分析(ANOVA)(GraphPad Inc.，SanDiego，CA)进行多种方法的比较。文中提供单向ANOVA所有F统计和P值。以不成对的t-检验进行单个药物治疗组与对照组的比较。文中提供所有不成对t-检验的p值。
结果EGB 761?和GKB减少MDA-231人乳癌细胞PBR配体结合力。图1显示增长浓度的注射形式EGB 761?以时间依赖性方式抑制PBR配体结合力(Bmax)，采用饱和等温线作放射性标记配体PK 11195测定，之后进行Scatchard数据分析。采用分离的GKB得到相似的结果(图2)。有趣地，EGB761?和GKB降低对照组值66％的PBR水平。对于受体亲和性(Kd)未观察到明显作用(5.8±1.4pmol/mg蛋白，n＝12)。
EGB 761?和GKB减少MDA-231人乳癌细胞内PBR mRNA表达。进行RNA(Northern)印迹分析以测定，是否在对照组和EGB 761?或GKB处理细胞之间可见的PBR配体结合差异反映对PBR mRNA表达的影响。如图3所示，EGB 761?和GKB都减少了PBR mRNA水平。这个结果符合以上出现的有关PBR配体结合表达的结果。
EGB 761?和GKB抑制MDA-231细胞增生。采用溴脱氧尿苷(BrdU)细胞增生ELISA(Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN)，我们检测了增长浓度的EGB 761?对MDA-231细胞增生的作用。图4显示EGB 761?以浓度和时间依赖性方式抑制MDA-231细胞增生。EGB 761?的这一作用是可逆的，甚至在采用最高浓度的EGB 761?时(图5)。以EGB 761?培养MDA-231细胞48小时，之后清洗并在不含EGB 761?的培养基中培养另外48小时，产生MDA-231增生活性的恢复。增长浓度的GKB在48小时处理之后也抑制MDA-231细胞增生(图6)。
EGB 761?和GKB并不具有与它们抑制MDA-231细胞增生同样水平的对MCF-7细胞增生的抑制作用。与MDA-231细胞比较，非-攻击性的MCF-7细胞含有极低的(＜60倍)PBR水平，如配体结合研究和mRNA分析测定的，我们检测是否EGB 761?和GKB影响MCF-7细胞增生速率与影响MDA-231细胞增生速率程度相同。图7清楚地显示EGB 761?和GKB影响MCF-7细胞增生与影响MDA-231细胞增生程度均不相同。
EGB 761?不影响MDA-231游离基水平。近来体内和体外研究证实EGB 761?(包括GKB)的萜成分具有抗氧化性能。为了确定EGB 761?的抗-增生效应是否归因于其抗氧化性，我们测定以或不以增长浓度的EGB761?处理的MDA-231细胞的游离基水平(图8)。尽管可以观察到游离基水平降低20％，但是这种效应既无统计学显著意义也不是剂量依赖性的，它表明观察到的效应并不归因于EGB 761?-引起的细胞内游离基水平的下降。
EGB 761?调节与细胞增生有关的MDA-231转录程序。以上出现的结果表明，EGB 761?和GKB抑制富含PBR和高攻击性MDA-231乳癌细胞内PBR的表达和细胞增生。非攻击性的MCF-7细胞含极低的PBR水平，并不在与MDA-231乳癌细胞的同等程度上对EGB 761?产生应答。为了检测EGB 761?(20μg/ml，48小时)对MDA-231细胞的作用是否对PBR专一，或者细胞增生中涉及的其它基因是否受这种处理的影响，我们采用代表588个不同人基因的cDNA阵列。如材料和方法项下注明的，采用基因表达与内部对照的比率校正实验变异。EGB 761?处理对每个基因产物的作用表示为对照组(未处理)细胞的％。图9和表I仅仅表示在对照组值30％以上的一致变化。
EGB 761?和GKB体内作用的生物学评价。为了评估EGB 761?和GKB在体内环境对肿瘤细胞增生和PBR表达的作用，我们采用乳房脂垫异种移植模型(参见Medina，D.，J.Mamm.Gland.Biol.Neopl.15-19，1996)。图10显示以50mg/kg EGB 761?或1mg/kg GKB治疗30天引起肿瘤大小分别减少35％(p＝0.037)和32％(p＝0.043)，测量在治疗结束后一个月进行。这些治疗并不影响动物体重(未显示数据)。考虑到关于EGB 761?和GKB对MDA-231细胞内PBR表达作用的这些体外数据，我们测试了是否EGB761?和GKB也减少MDA-231异种移植物内PBR的表达。图11(A-D)显示用于在来自载体治疗动物的MDA-231异种移植物内检测18,000分子量蛋白的PBR抗血清的辣根过氧化物酶(HRP)染色。省略苏木精复染以便区别肿瘤内PBR的核定位(19)。图11A显示肿瘤中部，这里可以轻易地观察到18,000PBR蛋白的核定位(参见箭头)。图11B显示得自载体治疗动物的肿瘤边缘内观察到的免疫染色。得自载体治疗动物的肿瘤边缘观察到的较高放大率的免疫染色如图1C所示，以非特异性抗血清治疗的对照组如图11D所示。以EGB 761?(图11E)或GKB(图11F)的治疗减少了位于在肿瘤中部发现的细胞内存在的核PBR表达。有趣地，以EGB 761?(图11G)或GKB(图11H)的治疗也消除了位于肿瘤边缘细胞内的核PBR表达。然而，在后一种情形下，可观察到胞质免疫染色(图11G和H)。在取自生长于三个独立动物内生长的异种移植物的切片中这些数据是可复现的。
注意到甚至在高浓度的EGB 761?或GKB存在下，PBR水平细胞增生和速率不会低于正常值的30％，这是令人感兴趣的。这提示需要最小量的PBR以维持膜完整和细胞功能。也应注意到甚至使用最高浓度时，EGB761?和GKB对细胞都是无毒的，因为这些化合物清除之后细胞增生恢复。这些资料表明这些化合物是抑制细胞的，而不是细胞毒素。另外的细胞毒性试验表明在同样条件下，EGB 761?和GKB都不引起明显的细胞死亡。
EGB 761?或GKB不引起MDA-231细胞内产生的活性氧物质数量的明显减少，表明它们的抗氧化性并不是形成MDA-231细胞内PBR表达和细胞增生减少的原因。这些结果表明这些化合物可以直接或间接调节PBR基因转录。
EGB 761?和GKB在高攻击性、核PBR-表达的MDA-231细胞中减少PBR表达和细胞增生，但是并不象对MDA-231细胞同样程度地作用于非攻击性MCF-7细胞，该细胞具有极低的PBR水平并且缺乏核PBR，这对PBR的存在可能是乳瘤细胞攻击性表型的决定性因子的假设提供了额外支持。此外，这种观察进一步证实EGB 761?和GKB对PBR表达定向调节作用的专一性。后面的发现使我们面对目前研究的两种关键问题其它基因的表达是否受EGB 761?调节？受EGB 761?活化或抑制的转录程序(这里PBR是级联事件的起源或部分)是否是形成MDA-231细胞增生速率改变的原因？为了解决这些问题，我们利用Atlas人cDNA表达阵列。如表I指出，采用EGB 761?提取物处理MDA-231细胞诱发588个受试基因中的36个转录表达的改变。并不令人惊奇地，绝大多数受影响的基因对于细胞增生、分化或编程性细胞死亡具有紧密的关系。或许EGB 761?对MDA-231细胞系最有效的作用是下调p120增生细胞核抗原。在乳癌患者和前列腺腺癌中p120用作预后指示剂(Periaky，L.，等，Cancer Res.，52428-436，1992；Zhuang，S.H.等，Endocrinology，1391197-1207，1998)。然而，更重要地，p120是增生细胞的免疫细胞化学标记。这种增生标记的68％下调从而确认了我们证实EGB 761?抑制MDA-231细胞增生的资料。
采用人cDNA表达阵列，我们检验EGB 761?对MDA-231细胞内588个基因表达的作用。我们发现该处理增加c-Myc原癌基因的表达和减少35个基因产物的表达，包括致癌基因(AP-1，PE-1，RhoA，n-Myc)，细胞周期调节因子(CDK2，p55CDC，PCNA p120)，信号转导调节因子(NET1，ERK2)，编程性细胞死亡有关产物(SGP-2，NIP1)受体(A2A，RXR-beta，Grb2)，转录因子(Id-2，ATF-4，ETR101，ETR-103)，生长因子(HB-EGF，HGF-样)，以及细胞粘着分子(CD19，L1CAM，整联蛋白α3，α4，α6，β5，Mac-1，β-连环蛋白)，它们与各种调节细胞增生的途径直接相关。考虑到受试化合物仅仅对表达高水平PBR的MDA-231细胞有效，这些资料显示核PBR的表达可能是肿瘤细胞获得攻击性和侵染性表型的决定因素。
表1采用Atlas人cDNA表达阵列如以下材料和方法项下所述检验EGB 761?对MDA-231基因表达的作用
Myc族的转录因子的两个成员，c-Myc和n-Myc，被发现在试验中很易改变。原癌基因c-Myc的表达增长75％，而n-Myc的表达减少74％。这两种基因均在几种类型癌症中超表达(Kim，C.J.，等，Virchows Arch.，434301-305，1999；Dang，C.V.，Mol.Cel.Biol.，191-11，1999)，并且与肿瘤细胞增生强烈相关。先前研究已经显示由酪氨酸激酶抑制剂染料木黄酮抑制的成神经细胞瘤细胞生长伴随n-Myc表达的向下调节。该资料极符合我们的细胞增生和n-Myc资料。然而，Myc的超表达伴随正常血清条件下细胞增生的刺激。c-Myc的超表达在缺乏血清或其它存活因素时诱导细胞死亡。这些资料集中起来暗示c-Myc表达的撤消同样需要其它基因表达的改变。
在我们的微阵列试验中，我们发现几种其它c-Myc-相关基因的解除管制的表达。一种这样的基因，胸腺素原α(proTα)，由c-Myc诱导。然而，proTα的表达减少79％而不是由c-Myc的向上调节可预知的升高。进一步地，其它c-Myc靶基因，例如cdc25A、细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白E的表达不受以EGB 761?处理MDA-231细胞的影响，表明c-Myc-调节的基因转录中处理特异性或细胞系特异性回路。从微阵列试验搜集的其它资料进一步支持这种假设。c-Myc转录调节在APC和β-连环蛋白控制之下。然而，这些基因在MDA-231细胞中均受EGB 761?的向下调节(分别为59和58％)，而c-Myc是向上调节。同时这些数据中的一些似乎是矛盾的，许多公布的关于c-Myc在细胞增生、分化和细胞死亡中的作用也似乎是矛盾的。
与EGB 761?改变c-Myc和Myc-相关蛋白的调节相似，微阵列试验暴露了几种信号分子的破裂。EGB 761?处理引起RhoA(各种细胞现象所涉及的编码GTP结合蛋白基因)表达减少93％，以及NET1(RhoA-特异性鸟嘌呤交换因子)表达减少55％。有趣地，已经证实RhoA在成纤维细胞内调节细胞周期蛋白E/Cdk2活性。细胞周期蛋白E/Cdk2复合体的激活对于自G1至S-期的细胞周期进程是重要的。由c-Myc亦证实了细胞周期蛋白E/Cdk2活性的调节。尽管这两种现象的重要性不是立即显而易见的，值得注意的是Cdk2的表达被EGB 761?减少了83％。
其它的信号分子亦被EGB 761?向下调节。衔接分子Grb2的表达减少70％。Grb2在细胞信号传递中通过物理连接信号转导物例如受体酪氨酸激酶至Ras/MAPK途径而起重要作用。考虑到MAPK途径，MAP/ERK族成员ERK2的表达向下调节46％，c-Jun转录因子的表达减少78％。有趣地，已经报道了EGB 761?是佛波醇酯刺激的AP-1转录因子的抑制剂。这些数据意味着EGB 761?对MDA-231细胞增生的作用伴随具有彼此功能联系的mRNA的广泛减少。
微阵列试验另一有趣的发现是几种整联蛋白的表达减少。整联蛋白是一大族的细胞间和细胞-细胞外基质粘着受体，它由两种跨膜糖蛋白亚基(一种α-亚基，一种β-亚基)组成。表I表示的所有整联蛋白以某种方式涉及细胞增生的调节。例如，整联蛋白αM是弹性蛋白酶受体的部分。ONO-5046，一种弹性蛋白酶抑制剂，抑制多瘤病毒和Kirsten肉瘤病毒-转化的BALB/c3T3细胞和Capan-1胰癌细胞的增生。此外，黑瘤、肉瘤和淋巴瘤细胞模型中，整联蛋白α4参与末梢转移瘤蓄积。强调整联蛋白起一种α和一种β-亚基杂二聚体的作用是重要的。α-或β-亚基的表达减少在调节整联蛋白受体功能中是明显重要的。
EGB 761?也可减少一些关键生长因子基因的表达，例如肝细胞生长因子样和EGF样生长因子。EGB 761?-诱导的细胞增生抑制可能是由于这些可能充当细胞生长白分泌调节因子的生长因子的减少表达。
本发明将EGB 761?和GKB提供给受体患者，其量为足以抗争所述患者体内癌症的量，或者足以(阴性或阳性地)影响上文表I所列基因产物表达的量。如果EGB 761?和GKB的剂量、给药途径等足以影响这种反应，该剂量称之为足以抗争癌症。
一种组合物如果其给药可以被受体患者耐受，称之为“药学上可接受的”。如果给药剂量是生理学上有效的，这样一种药剂称之为以“治疗有效量”给药。一种药剂如果它的存在引起受体患者生理学上可检测的变化，即是生理学上有效的。
EGB 761?和GKB可以按照已知的方法配制以制备药学上有效的组合物，这里这些原料，或者它们的功能衍生物可与药学上可接受的载体赋形剂任选地组合成混合物。例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences(第16版，Osol，A.ed.，Mack Easton PA.(1980))介绍了合适的载体和它们的制剂，包含其它的人蛋白，例如人血清白蛋白。为了形成适于有效给药的药学上可接受的组合物，这样的组合物包含有效量的上述化合物以及适量的载体赋形剂。
可以采用另外的制药方法以控制作用持续时间。通过采用聚合物复合或吸收这些化合物可获得控释制剂。通过选择适当的高分子(例如聚酯、聚氨基酸、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素或硫酸精蛋白)和高分子的浓度以及掺入方法以控制释放。另一种通过控释制剂控制作用持续时间的可能方法是掺入本发明的化合物至聚合材料颗粒中，例如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)或乙烯乙酸乙烯酯共聚物。或者，作为掺入这些药剂至聚合颗粒中的替代，在制备的高分子中包埋这些物质是可行的，例如，分别界面聚合例如羟甲基纤维素或明胶-微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊，或者以胶体给药系统，例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊或者大乳剂。Remington′s PharmaceuticalSciences(1980)公开了这样的技术。
EGB 761?和分离的GKB可通过经口、非肠道(例如，肌内，腹腔内，静脉内或皮下注射，或者植入)、鼻、阴道、直肠、舌下或局部给药途径给药，并且可以以药学上可接受的载体配制，以提供适合于每种给药途径的剂型。
适于口服给药的固体剂型包括胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在这类固体剂型中，活性化合物与至少一种惰性药学上可接受的载体例如蔗糖、乳糖或淀粉混合。在通常的实践中，这类剂型也可包括除了这类惰性稀释剂之外的另外物质，例如硬脂酸镁之类润滑剂。胶囊、片剂和丸剂的情形下，剂型也可包括缓冲剂。片剂和丸剂可再制成具有肠衣的剂型。
适于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、溶液、悬浮液、糖浆剂、酏剂，它们含有本领域通常采用的稀释剂，例如水。除了这些惰性稀释剂之外，组合物也可包含助剂，例如润湿剂、乳化和悬浮剂，及增甜、调味和香味剂。
按照本发明的适于非肠道给药的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液或乳剂。非水溶剂或载体的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和玉米油、明胶和注射用有机酯如油酸乙酯。这样的剂型也可包含例如防腐剂、润湿、乳化和分散剂之类助剂。它们可以这样灭菌，例如，经除菌滤器过滤，向组合物中掺入灭菌剂，照射组合物，或者加热组合物。它们也可制备成无菌固体组合物形式，使用前可立即溶于无菌水或其它一些注射用介质中。
适于直肠或阴道给药的组合物优选栓剂，除了活性物质之外它还包含如可可脂或栓剂蜡的赋形剂。
也可以以本领域公知的标准赋形剂制备适于经鼻或舌下给药的组合物。
本发明的组合物中EGB 761?或分离的GKB的剂量可以变化；然而，活性组分的量必需是能获得适当剂型的量。剂量选择取决于所需的治疗效果、给药途径和治疗持续时间。给药可以以单次剂量或分成多次剂量给药。EGB 761?或分离的GKB的有效剂量取决于受治疗的病情、所选择的给药途径，并且最终由主治医师或兽医确定。
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本发明涉及银杏叶提取物或分离出的银杏苦内酯B(GKB)(银杏叶提取物的一种成分)在有需要的患者细胞内减少外周型苯二氮?受体(PBR)表达的方法中的用途。进一步地,本发明涉及银杏叶提取物或分离的GKB在有需要的患者体内减少癌细胞增生的方法中的用途。更具体地,本发明涉及银杏叶提取物或分离的GKB在有需要的患者体内减少癌细胞增生的方法中的用途,其中所述的癌细胞是人乳癌细胞。甚至更具体地,本发明涉及银杏叶提取物或分离的GKB在有需要的患者内减少癌细胞增生的方法中的用途,其中所述的癌细胞是攻击和侵染性表型并且表达的PBR水平高于非攻击性癌细胞。