专利名称：一种水溶性银杏叶提取物的制备工艺的制作方法银杏(ginkgo，拉丁名Ginkgobiloba)别名白果，公孙树、鸭脚树、蒲扇，属裸子植物。银杏叶作为药用已有800余年的历史，早在宋朝我国民间就使用银杏叶治疗哮喘和支气管炎。银杏制剂与银杏类保健食品可谓是当今世界市场上最热门的植物产品之一。自上世纪60年代，德、法两国科学家率先从银杏的树叶里提取出具有抗心脑血管疾病的成分 (银杏黄酮与银杏内酯)以后，以“梯保宁”和“金纳多”为代表的银杏制剂在国际医药市场上声誉鹊起。据美国经济学家估计全球各种银杏制剂加上形形色色的银杏保健食品与含银杏提取物成分的化妆品等，目前的世界市场总销售额已超过50亿美元。银杏内酯是银杏叶提取物的主要有效成分之一，具有抑制血小板聚集、抑制血栓形成、保护血管内皮细胞、扩张冠状动脉等作用，为强血小板活化因子(PAF)拮抗剂。银杏内酯中有多个成分，均为强血小板活化因子拮抗剂，是银杏叶中特殊生理活性的关键成分， 每个内酯所起的作用均不同。其中银杏内酯B的PAF (血小板活化因子)的选择性抗PAF的活性最强，其次为银杏内酯A，其次为银杏内酯C;而银杏内酯A有抗焦虑作用，而银杏内酯 B和C则并未有抗焦虑作用，因此在银杏提取物中保证各内酯含量是非常重要的。但在实际生产中，由于相关提供工艺的不成熟，造成了各银杏制剂中虽然总内酯达到相关标准要求， 但不同内酯含量相差很大，如《HPLC-ELSD法测定银杏叶提取物及其制剂中银杏内酯A、B、 C和白果内酯含量》，徐州医学院学报2008，28 (12) 790-794中检测出各厂家生产的银杏叶提取物均符合药典标准，但分内酯含量相差很大，有的内酯则未检测到。如按这类银杏叶提取物制成相关制剂的话，可能造成产品质量不一，药效相差很大，不能保证用药安全有效。在银杏叶提取物中，由于银杏内酯水溶性较差特别是银杏内酯A和内酯B水溶性更小，用常规工艺技术分离的水溶性银杏叶提取物，在不添加任何助溶剂、增溶剂的情况下，银杏内酯含量较低，尤其是GB和GA的含量显著下降，或银杏酸含量偏高。目前常规水溶性银杏叶提取物的内酯含量在6-7%左右，其冷水(25 °C )溶解度在5%左右，质量难以进一步提高，产品应用受限。目前，市场上的银杏叶提取物主要通过树脂法、溶剂萃取法等制备方法，经检索， 目前已有超过90件涉及银杏叶提取物的专利申请，例如“CN101524380”一种银杏叶提取物的制备工艺、“CN101422493” 一种银杏叶提取物的制备方法及其应用等，这些申请主要属于普通银杏叶提取物的制备方法，而针对水溶性银杏叶提取物制备工艺的专利申请，主要有4篇申请号为02113533. 9的专利介绍了一种“水溶性银杏叶提取物的生产工艺”，该工艺从银杏叶开始提取，所得粗品采用单纯的大孔树脂吸附纯化技术，由于银杏黄酮和银杏内酯对树脂的吸附性差异较大，且苦内酯的水溶性较差，因此，采用该工艺难以保证银杏内酯的含量及提取物的水溶性。申请号为CN200510003243. 1的专利介绍了“一种水溶性银杏叶提取物的生产 方法”，该工艺将GBE粗品采用水或稀醇搅拌提取，滤液加明胶水溶液沉淀的方式，来制备水溶性银杏叶提取物，由于银杏内酯在水或稀醇溶液中溶解性较差，加之明胶的沉淀作用，因此，采用该工艺制备水溶性提取物，对有效成分尤其是银杏内酯的损失较大，工艺的可控性较差，难以获得稳定的符合一定含量规格的水溶性银杏叶提取物；申请号为200810060422. 2的专利介绍了 “一种水溶性银杏叶提取物的生产工艺”，该工艺以银杏叶为原料制备得到普通提取物后，采用乙醇溶解，多次加热提取，浓缩后，再用纯化水多次加热提取，提取液冷却过滤，干燥即得，该工艺需要多次加热提取，对有效成分黄酮有一定损失，同时单纯的醇提、水提对有效成分银杏内酯尤其是银杏内酯B和银杏内酯C的损失较大，无法保证成品中银杏内酯B > 0. 9%、银杏内酯Ol. 2%的注射用原料的要求，同时鞣质含量也难以达到要求；申请号为201010117094. 2的专利介绍了“一种水溶性银杏提取物的制备方法”，该工艺采用乙酸乙酯提取、C2-C8烷烃脱酸并结合聚酰胺型树脂纯化制备而得，按此工艺制备水溶性提取物，其缺陷在于乙酸乙酯提取及C2-C8烷烃脱酸的生产化技术要求较高，银杏黄酮和内酯分别制备，其成品得率较低，且混合干燥后，其内酯的水溶性无法得到保证，此工艺操作较复杂，产业化要求较高，成本较大。
本发明的目的在于提供一种克服现有技术缺陷，提供一种生产工艺简便、安全高效、产品质量高且稳定、水溶性好、成品得率高、成本低的可供注射用的低酸水溶性银杏叶提取物的制备工艺。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案包括本发明提供一种低酸水溶性银杏叶提取物的制备工艺，以普通银杏叶为原料，经丙酮水混合溶液提取后，浓缩，加水稀释，冷沉，过滤，滤液经大孔吸附树脂梯度洗脱，并通过高醇度乙醇醇沉和水提冷沉，最终制备得到符合注射用要求的低酸水溶性银杏叶提取物，其总黄酮醇苷含量> 27%，总内酯含量为9%-12%，其中银杏内酯A含量> 2. 1%，银杏内酯B含量彡0. 9%，银杏内酯C含量彡1. 2%，且分内酯比GA =GB :GC接近7 :3 :4，水溶性彡10%，工艺恒稳性好。本发明具体步骤如下步骤1，丙酮水混合溶液提取以粉碎后银杏叶为原料，用一定量浓度为50-70%丙酮水混合溶液提取2-3次，合并提取液，浓缩至无丙酮，得浓缩液，其中丙酮含量小于5%。由于银杏叶质量对提取的效果有较大影响，因此本发明所述的银杏叶质量明确为总黄酮醇苷含量> 0. 4%、总内酯含量> 0. 25%。所述用一定量浓度为50-70%丙酮水混合溶液提取2-3次，优选条件为用6_8倍量浓度为60%丙酮水混合溶液提取2次。步骤2，水稀释，冷沉浓缩液加纯化水稀释至密度为1. 0-1. lg/mL(温度50°C )，冷沉(0-10°C) 8-12小时，过滤，得澄清滤液。优选稀释至密度为1. 02-1. 06g/mL。加纯化水稀释后水溶液冷沉不但易于过滤，同时冷沉还能起到去除部分银杏酸的效果。步骤3，大孔吸附树脂梯度洗脱步骤2的澄清滤液上大孔吸附树脂，先水洗，然后以低浓度乙醇预洗，再以适量50-80%乙醇洗脱，取乙醇洗脱液，浓缩，得无醇稠膏I。所述低浓度乙醇以10-15%乙醇为佳；所述50-80%乙醇洗脱，优选为60-65%乙醇；最优选为65%乙醇洗脱。大孔吸附树脂为选自HPD750、HPD417、DA201、YWD13C、AB-8、D101型大孔吸附树脂之一；优选为HPD750大孔吸附树脂。步骤4，高醇度乙醇醇沉取无醇稠膏I，加8-10倍量95%乙醇溶解，至醇度大于 80%，放冷，过滤，浓缩滤液，得无醇稠膏II。优选为至醇度为80-85%。步骤5，水提冷沉取无醇稠膏II，加入10-20倍量纯化水，加热提取0. 5_2h，冷却至室温，冷藏(0-10°C ) 24-48h，冷沉液过滤，浓缩，干燥即得水溶性银杏叶提取物。优选加入15倍量纯化水，加热提取0. 5-lh。优选冷藏时间为24_30h。所述的干燥优选为减压干燥、冷冻干燥、喷雾干燥或微波干燥之一。本发明水溶性银杏叶提取物的制备工艺，步骤3中，水洗，低浓度乙醇预洗，可以去除部分单糖、氨基酸、脂肪酸等大分子类成分，以及银杏酸等杂质成分；50-80%乙醇洗脱，可以富集银杏黄酮及内酯等大部分有效成分，这是本发明的突出特点之一。步骤4为高醇度乙醇醇沉，一般认为该工艺不合理，本发明通过多次实践表明，通过醇沉，控制条件，可去除部分可能影响样品水溶性的大分子类成分，尤其是单糖、多糖类成分，同时又不损失银杏黄酮、内酯等有效成分，达到进一步富集有效成分的目的。该方案克服了技术偏见，解决了水溶性银杏叶提取物的质量问题。步骤5为水提后冷沉，一方面可使得部分难溶性银杏内酯成分尽可能多的得以保留，保证产品质量，同时又可充分去除其他水不容性杂质，使产品达到良好水溶性的目的。本发明提出的一种水溶性银杏叶提取物的制备工艺，具有如下优点1.按本发明方法制备所得产品，总黄酮醇苷含量>27%;总内酯含量为9%_12%，其中银杏内酯A含量彡2. 1%，银杏内酯B含量彡0. 9%，银杏内酯C含量彡1. 2%，且分内酯比GA =GB GC接近7 3 :4，工艺恒稳性好；水溶性彡10% ；银杏酚酸彡lppm，可作为注射用原料。2.本发明方法不添加任何助溶剂或增溶剂，具有生产工艺简便，产品质量高且稳定，成品得率高，成本低，经济效益好的优点。具体实施方案下面的实施例，用于进一步说明和描述本发明，但并不意味着本发明仅限于此。实施例中取值为本发明所述范围的任一具体数值，均为可实施。
以下实施例中所用的银杏叶原料为总黄酮醇苷含量> 0. 4%、总内酯含量> 0. 25%的普通银杏叶，银杏叶及提取物中银杏黄酮、银杏内酯和银杏酸的含量测定方法见《中国药典》银杏叶、银杏叶提取物的相关项目；水溶性指标测定方法见《中国药典》凡例溶解度项。实施例1
取粉碎后银杏叶5kg，加入35kg 60%丙酮水混合溶液，回流提取2次，合并2次提取液， 浓缩至无丙酮；加水稀释至密度为1.04g/mL (50°C)，放冷，冷沉(0-10°C)8小时，过滤，得澄清滤液；滤液上HPD750大孔吸附树脂，纯化水预洗2BV，10%乙醇预洗2BV，再以65%乙醇2BV洗脱，取乙醇洗脱液，浓缩得无醇稠膏I ；取无醇稠膏I，加约8倍量95%乙醇溶解，醇度约81%，放冷，过滤，浓缩滤液，得无醇稠膏II ；取无醇稠膏II，加入15倍量纯化水，加热提取0. 5h，冷却至室温，冷藏(0-10°C ) 24h，冷沉液过滤，浓缩，减压干燥，即得水溶性银杏叶提取物。按中国药典法测定，其银杏总黄酮醇苷含量为28.5%、总内酯含量9.5%、银杏内酯 A含量2. 5%，银杏内酯B含量1. 06%,银杏内酯C含量1. 41%，分内酯比GA :GB :GC接近7 3 4 ；水溶性> 10%;银杏酚酸< lppm，不含有蛋白质和鞣质。实施例2
取粉碎后银杏叶5kg，加入35kg 60%丙酮水混合溶液，回流提取2次，合并2次提取液，浓缩至无丙酮；加水稀释至密度为1.05g/mL，放冷，冷沉(0-10°C)10小时，过滤，得澄清滤液；滤液上HPD750大孔吸附树脂，纯化水预洗2BV，15%乙醇预洗2BV，再以65%乙醇2BV 洗脱，取乙醇洗脱液，浓缩得无醇稠膏I ；取无醇稠膏I，加约10倍量95%乙醇溶解，醇度约 85%，放冷，过滤，浓缩滤液，得无醇稠膏II ；取无醇稠膏II，加入15倍量纯化水，加热提取 1. Oh,冷却至室温，冷藏(0-10°C )30h,冷沉液过滤，浓缩，冷冻干燥，即得水溶性银杏叶提取物。按中国药典法测定，其银杏总黄酮醇苷含量为30. 2%、总内酯含量10. 8%、银杏内酯A含量3. 0%，银杏内酯B含量1. 28%，银杏内酯C含量1. 70%,分内酯比GA :GB :GC接近7
34 ；水溶性> 10% ；银杏酚酸< lppm，不含有蛋白质和鞣质。实施例3
取粉碎后银杏叶50kg，加入300kg 60%丙酮水混合溶液，回流提取2次，合并2次提取液，浓缩至无丙酮；加水稀释至密度为1.05g/mL，放冷，冷沉(0-10°C)8小时，过滤，得澄清滤液；滤液上HPD750大孔吸附树脂，纯化水预洗2BV，10%乙醇预洗2BV，再以65%乙醇2BV 洗脱，取乙醇洗脱液，浓缩得无醇稠膏I ；取无醇稠膏I，加约8量95%乙醇溶解，醇度约82%， 放冷，过滤，浓缩滤液，得无醇稠膏II ；取无醇稠膏II，加入10倍量纯化水，加热提取0. 5h， 冷却至室温，冷藏(O-IO0C ) 24h，冷沉液过滤，浓缩，喷雾干燥，即得水溶性银杏叶提取物。按中国药典法测定，其银杏总黄酮醇苷含量为28. 9%、总内酯含量9. 9%、银杏内酯 A含量2. 7%，银杏内酯B含量1. 16%，银杏内酯C含量1. 54%，分内酯比GA =GB :GC接近7 :3
4；水溶性> 10%;银杏酚酸< lppm，不含有蛋白质和鞣质。实施例4
取粉碎后银杏叶50kg，加入350kg 60%丙酮水混合溶液，回流提取2次，合并2次提取液，浓缩至无丙酮；加水稀释至密度为1.04g/mL，放冷，冷沉(0-10°C)10小时，过滤，得澄清滤液；滤液上HPD750大孔吸附树脂，纯化水预洗2BV，15%乙醇预洗2BV，再以65%乙醇2BV 洗脱，取乙醇洗脱液，浓缩得无醇稠膏I ；取无醇稠膏I，加约10倍量95%乙醇溶解，醇度约 84%，放冷，过滤，浓缩滤液，得无醇稠膏II ；取无醇稠膏II，加入10倍量纯化水，加热提取 1. Oh,冷却至室温，冷藏(0-10°C )30h,冷沉液过滤，浓缩，微波干燥，即得水溶性银杏叶提取物。按中国药典法测定，其银杏总黄酮醇苷含量为39.8%、总内酯含量10.4%、银杏内酯A含量2. 9%，银杏内酯B含量1. 28%，银杏内酯C含量1. 69%，分内酯比GA :GB :GC接近7 3 4 ；水溶性> 10% ；银杏酚酸< lppm，不含有蛋白质和鞣质。
实施例5
对不同批次市售水溶性银杏叶提取物和按本发明工艺制备的水溶性银杏叶提取物对比进行质量分析，结果如下表1
表1不同批次水溶性银杏叶提取物质量分析


本发明涉及一种水溶性银杏叶提取物的制备工艺，以普通银杏叶为原料，经丙酮水混合溶液提取后，经浓缩，加水稀释，冷沉，过滤，滤液经大孔吸附树脂梯度洗脱，并通过高醇度乙醇醇沉和水提冷沉，浓缩，干燥，得到水溶性银杏叶提取物，其总黄酮醇苷含量≥27%；总内酯含量为9%-12%，其中银杏内酯A含量≥2.1%，银杏内酯B含量≥0.9%，银杏内酯C含量≥1.2%，且分内酯比GA∶GB∶GC接近7∶3∶4；水溶性≥10%；银杏酚酸≤1ppm，可作为注射用原料。本发明方法具有生产工艺简便，产品质量高且稳定，成品得率高，成本低，经济效益好的优点。