防治糖尿病的药物化合物及其制备方法

李鹏程, 邢荣娥, 刘松, 于华华

2004年2月4日

2003年7月5日

2003年7月5日

中国科学院海洋研究所

A61P3/10GK1472218SQ0313878

制备 糖尿病 防治 化合物 药物

1.一种防治糖尿病的药物化合物，其包括甲壳低聚糖硫酸酯和/或壳聚糖硫酸酯，其特征在于两该化合物的典型结构式为 其中n为聚合度3～600，R1为SO3Na或H，R2为SO3Na或H或Ac，R1与R2同为H或Ac者除外；该化合物的活性基团——硫酸酯基(OSO3-)的含量为40.73～45.71％；其中，淡黄色棉花状的甲壳低聚糖硫酸酯分子量为1～6KD，淡黄色棉花状的壳聚糖硫酸酯分子量为30～100KD2.根据权利要求1所述防治糖尿病的药物化合物，其特征在于所述的甲壳低聚糖硫酸酯，其聚合度3～15；所述的壳聚糖硫酸酯，其聚合度100～6003.根据权利要求1或2所述防治糖尿病药物的制备方法，其特征在于所述的甲壳低聚糖硫酸酯的制备步骤如下(1)酯化试剂的制备将一定量N，N-二甲基甲酰胺(DMF)置入三口瓶中，经冰盐浴冷却后，搅拌下缓慢滴加适量氯磺酸，始终保持反应体系温度小于5℃；(2)称取定量的壳聚糖原料；(3)加适量的2％乙酸溶液，将该原料充分溶解；(4)将上述充分溶解的原料，放于微波炉中加热反应数分钟；(5)将上述加热反应的原料，用2N的NaOH溶液中和至中性，再放置一段时间；(6)将中和至中性的上述料液进行抽滤；(7)取滤饼进行烘干，所得的淡黄色固体物质；再粉碎烘干的该物质，测其分子量，该物质即为较低分子量的甲壳低聚糖；(8)取适量上述粉碎烘干的产物，加入适量甲酰胺溶剂；(9)将上述混合物，搅拌均匀后，加入适量甲酸或二氯乙酸，混合均匀后；(10)再加入一定量磺化剂DMF·SO3，搅拌均匀后；(11)再在40～60℃温度下，搅拌反应1～2h；(12)将上述反应液再加入3倍体积的95％乙醇，当出现大量白色絮状沉淀时，放置4℃冷藏柜中沉化30min，得到的沉淀物即是甲壳低聚糖硫酸酯的粗产品；(13)将上述沉淀物进行抽滤，取滤饼；(14)将上述滤饼再用水溶解，然后加2N的NaOH溶液中和至中性；(15)将上述溶液用透析袋进行透析，除盐后取透析液；或使用超滤方法除盐，取截留溶液；(16)再将上述溶液，浓缩至1/10体积；(17)将上述浓缩液放于冰柜中冻结，然后冷冻干燥得淡黄色棉花状物质；(18)粉碎该棉花状物质，测定其含硫量及分子量，取符合规定的低分子量1～6 KD的甲壳低聚糖硫酸酯作为防治糖尿病的药物4.根据权利要求3所述防治糖尿病药物的制备方法，其特征在于所述的(1)中的DMF与氯磺酸的体积比为10～5∶1；所述的(3)中的2％乙酸溶液的量与(2)中壳聚糖的体积重量比为6～30∶1(V/W)；所述的(4)在微波炉中反应到100℃，反应时间3～6min；所述的(7)中的淡黄色固体物质的分子量为9.21×103～3.86×104道尔顿；所述的(8)中取适量烘干产物与适量甲酰胺溶剂的体积重量比为15～50∶1(V/W)；所述的(9)中加入88％的浓甲酸量与(8)中的混合物的体积比为1∶3～10(V/V)；所述的(10)中加入磺化剂DMF·SO3的量为50～100ml；所述的(11)中的搅拌反应，是在大气气氛下常压反应的；所述的(15)中的透析袋是用1和8KD的两种膜包，所截取透析液是截留1～6KD分子量大小的产物5.根据权利要求1或2所述防治糖尿病的药物的制备方法，其特征在于所述的壳聚糖硫酸酯的制备步骤如下(1)酯化试剂的制备将一定量的DMF置入三口瓶中，经冰盐浴冷却后，搅拌下缓慢滴加适量氯磺酸，始终保持反应体系温度小于5℃；(2)取适量壳聚糖原料，加入适量甲酰胺溶剂；(3)将上述混合物，搅拌均匀后，加入适量甲酸或二氯乙酸，混合均匀后；(4)再加入一定量磺化剂DMF·SO3，搅拌均匀后；再在40～60℃温度下，搅拌反应1～2h；(5)将上述反应液再加入3倍体积的95％乙醇，当出现大量白色絮状沉淀时，放置4℃冷藏柜中沉化30min，得到的沉淀物即是壳聚糖硫酸酯的粗产品；(6)将上述沉淀物进行抽滤，取滤饼；(7)将上述滤饼再用水溶解，然后加2N的NaOH溶液中和至中性；(8)将上述溶液用透析袋进行透析，除盐后取透析液；或使用超滤方法除盐取截留溶液；(9)再将上述溶液，浓缩至1/10体积；(10)将上述浓缩液放于冰柜中冻结，然后冷冻干燥得淡黄色棉花状物质——壳聚糖硫酸酯；(11)粉碎该棉花状物质，测定其含硫量及分子量，取符合规定分子量30～100KD的壳聚糖硫酸酯作为防治糖尿病的药物6.根据权利要求5所述防治糖尿病药物的制备方法，其特征在于所述的(1)中DMF与氯磺酸的体积比为10～5∶1；所述的(2)中的取适量壳聚糖原料的量与适量甲酰胺溶剂的比为15～50∶1(V/W)；所述的(3)中加入88％浓甲酸量为3～10ml；所述的(4)中加入磺化剂DMF·SO3的量为50～100ml其中的搅拌反应是在大气气氛下常压反应的；所述的(8)中所用的透析袋是用截留分子量最低限为1.2KD的透析袋，进行透析脱盐

本发明涉及海洋药物的研究与开发，具体讲是一种降低血糖海洋药物——防治糖尿病的药物化合物及其制备方法，其属于海洋生物技术领域(二).背景技术众所周知，高血糖是糖尿病的一个重要特征糖尿病是一种常见的内分泌代谢紊乱性疾病，其是由于胰岛素分泌绝对或相对不足引起糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱，出现持续性的高血糖状态糖尿病的久病者常伴发动脉硬化，心血管，肾脏，眼病及神经系统等慢性并发症，严重者威胁生命，其发病率高，并发症多，严重影响人们的身体健康全世界有糖尿病患者1.25亿人，我国的糖尿病患者已达4000万人，并还有上升趋势，世界卫生组织将糖尿病列为世界三大疑难病之一当前临床上常用于治疗糖尿病的降糖药物主要有两种，一种是磺脲类，一种是双胍类其中，磺脲类药物主要是通过刺激胰岛素分泌，从而降低血糖水平有一种消渴丸药物，就是目前市场上常用的治疗糖尿病的药物，其主药成分优降糖属磺脲类降血糖药比法国施维雅药厂生产的第二代药达美康，其降糖作用高，具有剂量小、作用快、疗效高、持续时间长、副作用轻等优点但是，这种药物在人体内有蓄积作用，这就增加了肝、肾等内脏器官的负荷，尤其对老年人和肝、肾功能不全者，更是不适应的，此外还易发生低血糖鉴于糖尿病对人体健康的危害极大，而目前市场上尚无十分理想的治疗糖尿病的药物，人们一直在努力以寻求治疗糖尿病的最佳途径经过研究发现壳聚糖具有一定的降血糖作用，推测其作用机理在于壳聚糖能刺激胰岛β细胞合成、分泌及释放胰岛素，并降低胰岛α细胞分泌胰高血糖素，同时作用于肝脏，抑制肝糖元异生和体内糖分的吸收，减少糖输出，并增强周围组织对糖的利用而降低血糖，还可能会增加胰岛素受体和葡萄糖受体，提高胰岛素敏感性，加强生物活性，使受体后的抵抗减弱，抑制细胞内氧化酶系统而致组织缺氧，增强葡萄糖代谢，加速其利用，从而降低血糖众所周知，壳聚糖是自然界大量存在的一类天然生物多糖，无毒，具有很多生物活性，如抗肿瘤、增强免疫力等，但壳聚糖不溶于水的性质限制了它的应用现有技术中对壳聚糖硫酸酯(CSB)研究的主要内容有壳聚糖硫酸酯(CSB)含硫量较低，硫酸酯基含量小于33％因壳聚糖不溶于水，很多人用非均相反应，这就造成壳聚糖利用率很低现又有人研究，用均相反应，但其所使用的酸溶剂为二氯乙酸此酸溶剂价格高(94元/500ml)，虽然可增加壳聚糖的利用率，但总成本未见起色还有人，在N2气氛下反应2～8h制备壳聚糖硫酸酯(CSB)，其方可使壳聚糖硫酸酯(CSB)的含硫酸酯基量仅达到32.7％；还有人主要研究壳聚糖硫酸酯(CSB)的抗凝血活性，抗艾滋病方面应用，而对其降血糖方面功效，还未见报道(三)技术内容本发明的目的是要提供一种降血糖的海洋药材，即一种防治糖尿病的药物化合物及其制备方法由于研究发现，壳聚糖经磺化后所得壳聚糖硫酸酯(CSB)衍生物，具有与肝素类似的结构，并具有强聚阴离子性质，因而引起了广大学者的关注因此对壳聚糖进行化学改性和修饰，以扩大其应用范围，已成为当今的热门本发明的防治糖尿病的药物化合物具有与肝素类似结构和强聚阴离子性质，已研究其除了具有抗凝、抗栓和抗病毒等作用外，且对人体无毒副作用，有望在深层次研究而被开发利用，为人类造福本发明的防治糖尿病的药物化合物的两种多糖硫酸酯的活性含硫量要高，壳聚糖原料利用率高；所用制备材料与前人所用的相比，要性能价格比高；两种多糖硫酸酯首次作为降血糖的海洋药物方面的应用由于受活性基团硫酸酯基及其分子量的影响，该防治糖尿病的药物化合物在抗血糖、调血脂、增强免疫力、抗凝血等方面显示出的活性本防治糖尿病的药物化合物的制备方法要采用均相反应，简单易行，操作成本低，污染少，原料利用率高本发明的任务是有以下技术方案完成的，研制了一种防治糖尿病的药物化合物，其包括甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)和/或壳聚糖硫酸酯(CSB)，其特征在于两该化合物的典型结构式为 其中n为聚合度3～600，R1为SO3Na或H，R2为SO3Na或H或Ac，R1与R2同为H或Ac者除外；该化合物的活性基团——硫酸酯基(OSO3-)的含量为40.73～42.21％；其中，淡黄色棉花状的甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)分子量为1～6KD，淡黄色棉花状的壳聚糖硫酸酯(CSB)分子量为30～100KD所述的甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)，其聚合度3～15；所述的壳聚糖硫酸酯(CSB)，其聚合度100～600所述防治糖尿病药物的甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)的制备步骤如下(1)酯化试剂的制备一定量的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)置与三口瓶中，经冰盐浴冷却后，搅拌下缓慢滴加适量氯磺酸，始终保持反应体系温度小于5℃；(2)称取定量的壳聚糖原料；(3)加适量的2％乙酸溶液，将原料充分溶解；(4)将上述充分溶解的原料，放于微波炉中反应数分钟；(5)将上述加热反应的原料，用2N的NaOH溶液中和至中性，再放置一段时间；(6)将中和至中性的上述料液进行抽滤；(7)取滤饼进行烘干，所得的淡黄色固体物质；再粉碎烘干的该物质，测其分子量，该物质即为较低分子量的甲壳低聚糖；(8)取适量上述粉碎烘干的产物，加入适量甲酰胺溶剂；(9)将上述混合物，搅拌均匀后，加入适量甲酸或二氯乙酸，混合均匀后；(10)再加入一定量磺化剂DMF·SO3，搅拌均匀后；(11)再在40～60℃温度下，搅拌反应1～2h；(12)将上述反应液再加入3倍体积的95％乙醇，当出现大量白色絮状沉淀时，放置4℃冷藏柜中沉化30min，得到的沉淀物即是甲壳低聚糖硫酸酯的粗产品；(13)将上述沉淀物进行抽滤，取滤饼；(14)将上述滤饼再用水溶解，然后加2N的NaOH溶液中和至中性；(15)将上述溶液用透析袋进行透析，除盐后取透析液；或使用超滤方法除盐，取截留溶液；(16)再将上述溶液，浓缩至1/10体积；(17)将上述浓缩液放于冰柜中冻结，然后冷冻干燥得淡黄色棉花状物质；(18)粉碎该棉花状物质，测定其含硫量及分子量，取符合规定的低分子量1～6KD的甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)作为防治糖尿病的药物本发明的防治糖尿病药物制备方法的甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)的制备步骤中所述的(1)中的DMF与氯磺酸的体积比为10～5∶1；所述的(3)中的2％乙酸溶液的量与(2)中壳聚糖的体积重量比为6～30∶1(V/W)；所述的(4)在微波炉中反应到100℃，反应时间3～6min；所述的(7)中的淡黄色固体物质的分子量为9.21×103～3.86×104道尔顿；所述的(8)中取适量烘干产物与适量甲酰胺溶剂的体积重量比为15～50∶1(V/W)；所述的(9)中加入88％的浓甲酸量与(8)中的混合物的体积比为1∶3～10(V/V)；所述的(10)中加入磺化剂DMF·SO3的量为50～100ml；所述的(11)中的搅拌反应，是在大气气氛下常压反应的；所述的(15)中的透析袋是用1和8KD的两种膜包，所截取透析液是截留1～6KD分子量大小的产物本发明的防治糖尿病药物的制备方法的所述的壳聚糖硫酸酯(CSB)的制备步骤如下(1)酯化试剂的制备将一定量的DMF置入三口瓶中，经冰盐浴冷却后，搅拌下缓慢滴加适量氯磺酸，始终保持反应体系温度小于5℃；(2)取适量壳聚糖原料，加入适量甲酰胺溶剂；(3)将上述混合物，搅拌均匀后，加入适量甲酸或二氯乙酸，混合均匀后；(4)再加入一定量磺化剂DMF·SO3，搅拌均匀后；再在40～60℃温度下，搅拌反应1～2h；(5)将上述反应液再加入3倍体积的95％乙醇，当出现大量白色絮状沉淀时，放置4℃冷藏柜中沉化30min，得到的沉淀物即是壳聚糖硫酸酯的粗产品；(6)将上述沉淀物进行抽滤，取滤饼；(7)将上述滤饼再用水溶解，然后加2N的NaOH溶液中和至中性；(8)将上述溶液用透析袋进行透析，除盐后取透析液；或使用超滤方法除盐取截留溶液；(9)再将上述溶液，浓缩至1/10体积；(10)将上述浓缩液放于冰柜中冻结，然后冷冻干燥得淡黄色棉花状物质——壳聚糖硫酸酯；(11)粉碎该棉花状物质，测定其含硫量及分子量，取符合规定分子量30～100KD的壳聚糖硫酸酯(CSB)作为防治糖尿病的药物本发明的防治糖尿病药物的制备方法中的壳聚糖硫酸酯(CSB)的制备步骤中，所述的(1)中DMF与氯磺酸的体积比为10～5∶1；所述的(2)中的取适量壳聚糖原料的量与适量甲酰胺溶剂的比为1 5～50∶1(V/W)；所述的(3)中加入88％浓甲酸量为3～10ml；所述的(4)中加入磺化剂DMF·SO3的量为50～100ml其中的搅拌反应是在大气气氛下常压反应的；所述的(8)中所用的透析袋是用截留分子量最低限为1.2KD的透析袋，进行透析脱盐本发明的甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)和/或壳聚糖硫酸酯(CSB)作为制备降血糖海洋药物的应用是本发明的另一重要保护范围本发明的防治糖尿病的药物化合物，其包括甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)和/或壳聚糖硫酸酯(CSB)，这两种防治糖尿病药物的试验积极效果如下(A)甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)的毒理学试验1.实验动物实验动物昆明种小鼠，体重18-22克，雌雄各半，由山东省新药药理研究中心实验动物室提供，合格证号970102饲养条件室温18-22℃，小鼠每笼5只，自由摄水摄食，饲料为颗粒鼠料，由山东省新药药理研究中心实验动物室提供试验方法预试验表明，本品毒性较低，难以测出LD50，故进行其小鼠一日内最大耐受量测定2.给药方式2.1i.g给药样品甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)溶液配制25g/100ml，给药量0.4ml/10g，取健康昆明种小鼠20只，雌雄各半，试验前12小时禁食不禁水，第二日按0.4ml/10g体重i.g CSA混悬液，于800am ig一次，药后立即观察动物反应情况，并记录动物行为活动、呼吸、精神状态、大小便性状及颜色、被毛、鼻、眼、口腔分泌物和死亡情况，连续观察7天2.2i.p给药选择样品CSA，配制溶液浓度12.5g/100ml，给药量0.2ml/10g，取健康昆明种小鼠20只，雌雄各半，试验前12小时禁食不禁水，第二日按0.2ml/10g体重i.p混悬液，于800am i.p一次，药后立即观察动物反应情况，并记录动物行为活动、呼吸、精神状态、大小便性状及颜色、被毛、鼻、眼、口腔分泌物和死亡情况，连续观察7天3实验结果3.1.CSA.ig给药后小鼠行为活动、呼吸、精神状态、大小便性状及颜色、被毛、鼻、眼、口腔等均未见明显异常，连续观察7天未见明显变化，第7天处死并剖检部分小鼠，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等主要脏器均无肉眼可见异常表明CSA小鼠ig给药的一日最大耐受量大于10g/kg，本品一次用药无明显毒性作用3.2.CSA i.p给药后小鼠活动立即增加，十分钟后动物逐渐出现扭体，活动减少，一小时后扭体症状消失，动物开始出现俯卧，闭目不动，直至药物后八小时仍少动，药后第二天动物恢复正常连续观察7天未见明显变化，第7天处死并剖检部分小鼠，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等主要脏器均无肉眼可见异常表明CSA小鼠i.p给药的一日最大耐受量大于2.5g/kg，本品一次用药无明显毒性作用该样品的原料壳聚糖天然无毒，具有生物相容性并在体内降解，经磺化引入SO42-，结构类似肝素，与其它含SO42-的天然多糖一样，其毒副作用小经过我们的实验证明CSA毒副作用小，可见甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)作为新药开发是可行的(B)壳聚糖硫酸酯(CSB)(CSB)的降血糖试验11.实验动物昆明种小鼠，体重24-28克，雌雄各半，由山东省新药药理研究中心实验动物室提供，合格证号9701022.主要药品试剂及设备淡黄色粉末CSA用0.5％羧甲基纤维素钠溶液配成所需浓度混悬液Lab-500型全自动生化分析法，由南京桃园应用生物技术有限公司生产血糖试剂盒(葡萄糖氧化酶法)，由北京中生生物工程高技术公司生产，批号9811293.试验分组及高血糖症造型取小鼠6组，各组小鼠经尾静脉注射四氧嘧啶70mg/kg造成高血糖模型，72h后测定空腹血糖水平结果表明，四氧嘧啶可造成小鼠血糖显著升高然后分别给药igCSA、CSB 300mg/kg和1000mg/kg，阳性对照组消渴丸组1250mg/kg，阴性对照组给等体积的0.5％羧甲基纤维素钠溶液分别与给药后2、4、6、12和24h测定血糖水平，甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)能明显抑制四氧嘧啶所致小鼠血糖升高，见表1表1壳低聚糖硫酸酯对四氧嘧啶所致小鼠高血糖的影响 注x±s，n＝10，各对照组比较，*1p＜0.001，*2p＜0.01从上表可以看出，甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)低高剂量组对四氧嘧啶所致的小鼠高血糖有明显的抑制作用，高剂量组比低剂量组抑制率高，说明高低剂量组之间有明显的量效关系它们抑制血糖的效果要比对照组消渴丸好，抑制率比消渴丸高高分子量壳聚糖硫酸酯(CSB)由表中可以看出，它的降血糖效果比低分子量壳聚糖硫酸酯(CSB)的效果好，也表现出明显的量效关系说明分子量是影响降血糖活性的一重要因素四氧嘧啶能选择性地破坏胰岛β细胞，而壳聚糖硫酸酯(CSB)对四氧嘧啶所致的血糖升高有明显的抑制作用，这表明壳聚糖硫酸酯(CSB)可能减弱四氧嘧啶对胰岛β细胞的损伤或改善受损伤的β细胞的功能从而具有抗四氧嘧啶所致血糖升高的效果(C)甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)的调节血糖试验21.实验动物Wistar大鼠，体重200-300克，雌雄各半由山东省新药药理中心实验动物室提供，合格证号9701022.试验分组及高血糖症造型将小鼠随机分成6组，每组10只阳性对照组ig优降糖25mg/kg，阴性对照组给等体积的0.5％羧甲基纤维素钠溶液，其余四组分别ig CSA、CSB300mg/kg和1000mg/kg与给药后4h，各组小鼠ip肾上腺素0.02mg/kg，于注射后1h断头取血测血糖结果表明甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)300mg/kg和1000mg/kg可明显抑制肾上腺素的升高血糖作用，见表2表2壳聚糖硫酸酯(CSB)对肾上腺素引起血糖升高的影响 从上表可以看出，甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)低高剂量组对肾上腺素所致的小鼠高血糖有明显的抑制作用，高剂量组比低剂量组抑制率高，说明高低剂量组之间有明显的量效关系它们抑制血糖的效果要比对照组优降糖好，抑制率比优降糖高由表中还可以看出高分子量壳聚糖硫酸酯(CSB)降血糖效果比低分子量甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)效果好，也表现出明显的量效关系说明分子量是影响降血糖活性的一重要因素肾上腺素能促进肝糖原和肌糖原的分解而引起血糖升高，甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)能拮抗肾上腺素的升血糖作用，可能与抑制糖原分解有关本发明所述甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)的制备步骤(9)中与所述壳聚糖硫酸酯(CSB)的制备步骤(3)中所加入的酸溶剂都是88％的浓甲酸(本发明的实施例中优选使用88％的浓甲酸5ml)使用该酸溶剂时不用除水及其它杂质，简化了工艺程序，节约了干燥成本选择甲酸还由于甲酸的价格(10元/500ml)远远低于二氯乙酸(94元/500ml)，用此酸溶剂所进行的均相反应，所得产物的含硫量和产率均与用二氯乙酸相当，而且其性格价能比大大提高了在本领域技术中使用甲酸作为酸溶剂还未见有报道本发明所述甲壳低聚糖硫酸酯(CSA)的制备步骤(11)中与所述壳聚糖硫酸酯(CSB)的制备步骤(4)中的搅拌反应，是在大气气氛下常压进行反应的此项改进与前人“在N2气氛下反应2～8h”的技术相比，其方法更简单易行，而且节省了能源(四)附图及其实施例，本发明的保护范围不仅局限于以下实施例中本发明的实施例结合附图进一步说明如下