专利名称：一种稳定的蛋白药物制剂及其制备方法人白细胞介素11 (Interleukin 11，IL-11)是与许多造血细胞相互作用的细胞因 子，最早是从IL-Ia刺激的哺乳动物骨髓细胞系PU-34的条件培养基中被鉴别的活性物质，可长期维持培养的血细胞的生存，随后从人胚胎成纤维细胞系中克隆到IL-llcDNA。天然的IL-Il成熟蛋白含178个氨基酸，分子量19Kd ;不含半胱氨酸，因而缺少ニ硫键，但蛋白的结构却相当稳定；没有糖基化修饰；富含脯氨酸(12% )，亮氨酸(23% )及正电荷残基(14% )，等电点为11.7。rhIL-11是由多种细胞产生并与多种细胞作用的细胞因子。rhIL-11可与其它因子协同作用刺激人的粒细胞，红细胞及巨核细胞的前体细胞生长，最終导致血小板数量的増加。除了造血细胞，rhIL-11还作用于其它细胞，具有促进消化道上皮损伤的恢复、调节脂肪细胞分化等多种生物活性。1997年，美国Genetic Institute公司(GI)生产的重组人白细胞介素-ll(rhlL-ll)获准上市，用于防止化疗引起的再生性血小板减少症。GI于1993年获得IL-Il基因(专利号US5215895)，1997年补充了该专利(专利号US5700664)，1998年获得生产方法发明专利(专利号US5760189)，这些专利都在美国申请。但是作为蛋白药物，rhIL-11其稳定性还是无法与常规化学药物相比(Panayotatos ;Nikos，1998，US 5846935)，其稳定性在长期贮存时还是会受到多种环境因素的影响，例如对温度，氧和紫外线高度敏感。由于这些因子的作用，可能发生多种物理或化学变化。物理变化包括降解、聚集(可溶与不可溶的聚体)；化学变化包括水解、氧化、脱酸氨作用等(Manning, et al. ,Phrmaceutical Research6 :903-918 (1989))。这些物理、化学变化，会导致rhIL-11在贮存期间不能保证其稳定性，产生ー些相关物质，从而导致以下影响一方面由于实际给药剂量的变化而影响疗效，另一方面因有关物质产生会引起副反应的产生。US6270757和US7033992公开了ー种包含rhIL-11和甘氨酸的制剂处方，该申请未进入中国。目前，已上市产品均采用类似专利公开的处方0. 5 5mg/ml的IL-Il蛋白、IOmM磷酸钠缓冲液(pH = 7. 0)ヽ2. 3%甘氨酸(w/v)，lml/瓶的装量装于2ml的西林瓶中被冻干。这种冻干制剂的处方可以解决rhIL-11蛋白的水解、氧化、降解等问题，但其复溶后会有絮状沉淀或纤维状物质产生，有时会有乳光现象，根据2010版中国药典第三部附录VB的可见异物检测方法检测是不合格的。这些可见异物的存在，会产生ー时难以发现的、潜在的严重危害，例如炎症反应，毛细血管堵塞等。因此，研究出一种既能使rhIL-11蛋白稳定，又能消除可见异物，并适合于实际临床使用的药物制剂是极其有意义的。但是，到目前为止，尚未有这方面的研究报道。本发明涉及的就是此方面内容。
本发明的ー个目的是提供ー种包含rhIL-11的新的药物制剂，使其既能保持长期稳定性，井能保证冻干药物制剂在复溶后溶液的澄明度。药剂中可见异物形成的通常由下列原因引起物理振荡和溶液中蛋白质分子的相互作用以及在贮存小瓶中液-气界面上蛋白质分子的相互作用。人们认为蛋白质分子吸附在气-液界面上，其疏水基团向空气中伸展而亲水基团浸在水相中。一旦在表面这样排布，蛋白质分子便容易聚集、形成颗粒和沉淀。人们还认为在诸如由于运输或其它过程中发生 的振动而导致界面的伸缩过程中，吸附于气-液和固-液界面的蛋白质发生进ー步的构象变化。这种振荡能引起蛋白质缠结、聚集、形成颗粒并最終与其它吸附的蛋白质沉淀。另外，蛋白质在冻干过程中由于预冻速率、升温速率等冻干曲线エ艺的影响导致可见异物产生。可见异物形成可以通过向含有蛋白质的组合物中掺入表面活性剂以降低溶液-空气界面的表面张カ来控制。采用表面活性剂和乳化剂的传统药物稳定方法集中于在表面活性剂分子中同时含有疏水和亲水性分子基团的两亲本质。因此该技术表明，通过选择适当的表面活性剂作为相容剂可制得诸如水包油或油包水型不混溶分子的稳定溶液。用poloxamer 188 (PLURONIC F-68, BASF Vyadotte Corp.，Parsippany, NJ)对豆油进行的稳定的乳化作用便是ー个实例。另ー个实例是用聚山梨酯80(吐温-80,polysorbate_80)来乳化水溶液中的油溶性维生素A、E和K以通过ロ服或血管途径给药。由Krantz等人的エ作，“糖醇-X X VIII.对吐温80的毒理学、药效学及临床观察”(Bull, of the School ofMed.，U. of MD. ,36,48(1951))为将聚山梨酯(polysorbate)列为ー种药物成分奠定了エ作基础，其USP/NF要求已发表在美国药典X X II上。但是，出于对临床应用安全性的考虑，使能混入用于注射入人体的非肠道组合物的表面活性剂的类型与特性受到限制。通常公认的具有使用历史并列入美国药典X X II的表面活性剂包括泊洛沙姆188 (poloxamer 188)和polysorbate聚合物。但是，由下述的实施例证明，它们中任何ー种在1%及更低浓度下単独使用时，均不能对rhIL-11药物组合提供完全的稳定作用。増大表面活性剂的浓度会出现毒副作用増加的危险，溶血的较早产生以及中性白细胞与血小板的可观察到的变化，而中性白细胞与血小板均參与血液补体的活化。当poloxamerl88在有限的剂量下用作血液代用品并在血流中被稀释10倍时，poloxamer 188在允许的非肠道溶液中的最高安全浓度为2. 7 %。类似地，已批准用于非肠道溶液20多年的吐温80在100毫升或更大的溶液体积中的使用浓度很少高于0. I %。Krantz等(见上)鉴定狗在0. I %的polysorbate浓度下90分钟时出现溶血。新生儿死亡与吐温80的使用浓度高于1%有夫。因此，本领域需要能提供改进的蛋白蛋稳定稳定性的药物组合物，该组合物中只包含那些被认为是安全的并包括在制定规章的权威批准的商用非肠道药中的成分。本发明发现poloxamer 188表面活性剂与polysorbate (优选吐温-20或吐温-80)表面活性剂联合应用可提高rhIL-11冻干制剂复溶后的澄明度，使可见异物检测合格，同时保证了冻干制剂的稳定性。本发明特别提供了 rhIL-11的增溶/稳定方法。在rhIL-11药剂稳定性 研究过程中，选取了可见异物检测，反相高效液相色谱分析作为考察指标，来观察不同制剂处方对可见异物与蛋白稳定性的作用。这些方法均可从《中国药典》(2010年版)获得。通过以上各因素研究，发明人最終提供了ー种rhIL-11药物新制剂，其包含以下组分0. 5-5mg/ml重组人白细胞介素-11，缓冲剂，等渗调节剂和表面活性剤，所述的表面活性剂含有 0. 01 I (w/v)的 poloxamer 188 和 0. 005 0. I (w/v)的polysorbate (聚山梨酉旨)，所述制剂的pH为6. 0-8. O。本发明特别针对下面发现两种特定类型的表面活性剂的结合与其中任何ー种表面活性剂单独使用相比，使药物组合物的蛋白质稳定性有令人吃惊的改迸。特别是发现含有poloxamer 188表面活性剂与polysorbate (优选吐温-80或吐温-20)表面活性剂的混合物的药物组合物可改善蛋白质药剂的稳定性和对凝聚、颗粒形成及沉淀的抑制作用。与任何一种单独使用相比这两种类型表面活性剂的结合使用提供了改善的稳定性及对表面变性、凝聚、颗粒形成及沉淀的抑制作用。上述制剂中，用于稳定含有rhIL-11蛋白质的溶液时poloxamerl88的重量浓度(w/v)范围为0.01% 1%，优选为0. 1% 0.6%，更优选为0. I 0.3%。聚山梨酯(polysorbate)表面活性剂成分优选为吐温-80或吐温-20,更优选为吐温-80 ;重量浓度(w/v)范围为0. 005% 0. 1%，优选为0. 01 0. 06%，更优选为0. 01 0. 03%。含有0.1 0.3% (w/v) poloxamer 188及0. 01 0. 03% (w/v)吐温-80的混合物是最优选的。该混合物对防止rhIL-11的纤维状物质形成特别有用，也可用于增进其它蛋白类、多肽药物的稳定性。此poloxamer和聚山梨酯(polysorbate)表面活性剂的混合物可单独使用或与其它表面活性剂混合使用。再者，本发明不限于ー种poloxamer表面活性剂与ー种聚山梨酯(polysorbate)表面活性剂表面活性剂混合,还包括一种或多种poloxamer表面活性剂与ー种或多种聚山梨酯(polysorbate)表面活性剂混合或是与其他表面活性剂混合。上述制剂中，所述的缓冲剂为能够维持制剂在水溶液状态下pH值为6. 0-8. 0的任何一种缓冲液，可任选自磷酸缓冲液、组氨酸缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、Tris缓冲液或ニこ醇胺缓冲液等，优选磷酸缓冲液；优选缓冲液的PH为6. 5-7. 5，更优选为7. 0 ;浓度范围为1-lOOmM，优选 5-40mM，最优选为 10_20mM。制剂中，所述的等渗调节剂可选用盐(如氯化钠、氯化镁、磷酸盐等)、多元醇(如甘露醇、山梨醇、甘油等)、糖(如蔗糖、乳糖、葡萄糖等)或氨基酸类(如甘氨酸、丙氨酸、或丝氨酸等)，优选甘氨酸(甘氨酸同时能起冻干保护剂作用)；浓度范围可根据制剂溶液所需的摩尔渗透压浓度进行调节，优选为1% _4% (w/v)，更优选为2% -3% (w/v)，最优选为2.3% (w/v)。根据需要，可将上述的药物制剂制备为冻干粉针。因此，本发明还涉及ー种包含rhIL-11的冻干药物组合物，所述药物组合物在加入适量的药学上可接受稀释剂后，可还原成含0. 5-5mg/ml重组人白细胞介素-11，缓冲剂，等渗调节剂和表面活性剂的溶液，其中所述的表面活性剂含有0. 01 I (w/v)的poloxamer 188和0. 005 0. I (w/v)的polysorbate (聚山梨酯)，所述制剂溶液的pH为6. 0-8. O。上述的药物制剂冻干后的药物组成含量可按其冻干前的药物体积量換算。优选的，上述的冻干药物制剂中包含0. 5-5mg的重组人白细胞介素-ll，10-40mg的等渗调节剂，ICT6-ICT4 摩尔数的缓冲盐，0. I-IOmg 的 poloxamer 188 和 0. 05-lmg 的 polysorbate (聚山梨酷)。上述制剂中缓冲剂，等渗调节剂和表面活性剂的定义如前所述，药学上可接受的稀释剂可选择注射用水、生理盐水、低浓度葡萄糖溶液或注射用缓冲液等，优选注射用水。由于冻干前的液体制剂基本上为等张和/或等渗的，因此冻干后加入适量的注射用稀释剂能够还原形成等张或等渗溶液。进ー步地，还可在上述制剂中加入冻干保护剂来进ー步抑制可见异物的产生。可选用的冻干保护剂为糖类，例如蔗糖、海藻糖、羟こ基淀粉等，或是其混合物。优选的冻干保护剂为蔗糖，加入蔗糖可抑止聚体的产生，其重量浓度范围为0. 5 5% (w/v)，优选的浓度% 0. 5-2% (w/v),更优选的浓度为I % (w/v)。上述的含蔗糖的药物制剂可进一歩制备为冻干制剂。冻干后的药物组成含量可按其冻干前的药物体积量換算，优选的冻干组合物中还包括5mg-50mg的蔗糖，更优选包括5-20mg的鹿糖。 优选的，上述药物制剂中包含0. 5-5mg/ml重组人白细胞介素_11，I-IOOmM的磷酸缓冲剂，(w/v)的甘氨酸，0. 01 I (w/v)的 poloxamer 188 和 0. 005 0. I(w/v)的吐温-80，所述的制剂的pH为6. 0-8. O。优选的，上述药物制剂包含0. 5-5mg/ml重组人白细胞介素-11, 5_40mM的磷酸缓冲剂，2(w/v)的甘氨酸,0. 01 0. 6 (w/v)的 poloxamer 188 和 0.01% 0. 06% (w/v)的吐温-80，所述的制剂的pH为6. 0-8. O。优选的，上述药物制剂包含0. 5-5mg/ml重组人白细胞介素_11，10_20mM的磷酸缓冲剂，2(w/v)的甘氨酸,0. 01 0. 3 (w/v)的 poloxamer 188 和 0.01% 0. 03% (w/v)的吐温-80，所述的制剂的pH为6. 5-7. 5。更优选的，上述药物制剂包含0. 5-5mg/ml重组人白细胞介素_11，IOmM的磷酸缓冲剂,2. 3% (w/v)的甘氨酸，0.3% (w/v)的 poloxamer 188 和 0.02% (w/v)的吐温-80,所述的制剂的pH为7.0。根据需要，可在上述优选的药物制剂中加入为0. 5 5% (w/v)的蔗糖，优选的浓度为0. 5-2% (w/v)，更优选的浓度为1% (w/v)。根据需要，可将上述的药物制剂制备为冻干粉针，加入药学上可接受的稀释剂可将冻干制剂还原成冻干前的制剂溶液状态，例如加入注射用水溶解。上述的药物制剂冻干后的药物组成含量可按其冻干前的药物体积量換算，优选的按照临床皮下注射Iml的体积量计算，上述的冻干药物制剂中包含0. 5-5mg的重组人白细胞介素-ll，10-40mg的甘氨酸，KT6-KT4摩尔数的磷酸氢ニ钠和ニ氢钠缓冲盐，0. I-IOmg的poloxamer 188和0. 05-lmg的吐温-80。若冻干前药物制剂中加入蔗糖，在冻干后的组合物中还包括5mg-50mg的蔗糖，更优选包括5-20mg的鹿糖。其他优选范围的冻干药物制剂组成含量按此类推。可以用本领域常用技术进行冻干，例如冻干循环包括3步冷冻、初次干燥和二次干燥。在冻干过程中，制剂组分中的冻干保护剂甘氨酸或甘氨酸与蔗糖混合物可对本发明制剂中重组人白介素-11蛋白起着稳定作用，即通过在冻干的脱水期间保持蛋白质天然样构象特性。冻干后的组合物可用无菌水或合适的稀释剂重配，用于注射。由于冻干前的液体制剂基本上为等张和/或等渗的，因此冻干后加入适量的注射用水能够还原形成等张或等渗溶液。因此，本发明还提供了一种用于制备重组人白细胞介素-11冻干制剂的方法，所述方法包括以下步骤(I)制备包含0. 5-5mg/ml重组人白细胞介素-11，缓冲剂，等渗调节剂和表面活性剂的溶液，所述的表面活性剂含有0. 01% 1% (w/v)的poloxamer 188和0. 005 0. I %(w/v)的polysorbate (聚山梨酉旨)，所述制剂的pH为6. 0-8. 0 ；(2)将所述制剂溶液冻干。所述方法中各组成成分的定义和范围选择如前所述。polysorbate(聚山梨酷)可为吐温-20或吐温-80，优选吐温-80。进ー步的，所述方法步骤(I)中可加入冻干保护剂蔗糖，优选的浓度为0. 5 5%(w/v),优选的浓度为0. 5-2% (w/v),更优选的浓度为I % (w/v)。在本发明药物组合的基础上改变其中组分的浓度或加入其他物质，但对提高rhIL-11可见异物与稳定性没有显著改变，仍被视为本发明的一部分。为了进ー步阐明本发明，提供了下列例子，这些例子仅仅是为了进ー步说明本发明，并不意味着作为ー种限制。


图 I :实例 8 中处方(2. 3% Gly+10mM pB+0. 3% poloxamerl88+0. 02% Tween-80)在0个月时的反相图，反相纯度为98. 32 %。图 2 :实例 8 中处方(2. 3% Gly+10mM pB+0. 3% poloxamerl88+0. 02% Tween-80)在25°C条件下3个月时的反相图，反相纯度为98. 11%。图3 :实例 8 中处方(2. 3% Gly+10mM pB+0. 3% poloxamerl88+0. 02% Tween-80)在40°C条件下3个月时的反相图，反相纯度为97. 47%。



本发明涉及一种重组人白细胞介素-11(rhIL-11)药物新制剂，其包含以下组分0.5-5mg/ml重组人白细胞介素-11，缓冲剂，等渗调节剂和表面活性剂，所述的表面活性剂含有0.01％～1％(w/v)的poloxamer 188和0.005～0.1％(w/v)的polysorbate(聚山梨酯)，所述制剂的pH为6.0-8.0。本发明在现有技术基础上添加的poloxamer 188表面活性剂与polysorbate表面活性剂联合应用可提高rhIL-11冻干制剂复溶后的澄明度，使可见异物检测合格，同时保证了冻干制剂的稳定性。