专利名称：通过丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶akt诱导血管内皮生长因子(vegf)的制作方法血管发生血管发生是导致新血管发育的生物学过程。该过程包含多种细胞-细胞、细胞-基质、和细胞-细胞因子相互作用(Melillo等人，1997，新血管研究(Cardiovascular Research)35480-489；Lewis等人，1997，新血管研究(Cardiovascular Research)35490-497)。新血管网络的形成在成年生物体中通常是罕见的。但是，新血管结构可于多种病理性状况下发生，包括局部缺血、发炎、创伤愈合、肿瘤生长、糖尿病性视网膜病变、类风湿性关节炎、牛皮癣、和慢性创伤。治疗性血管发生包括使用适当的血管发生性生长因子精确的刺激新血管发育。因此，治疗性血管发生可用于治疗多种局部缺血状况或刺激创伤愈合。局部缺血状况可影响心脏、下肢、皮瓣、外周神经、骨、或移植物。局部缺血状况包括脑血管缺血、肾缺血、肺缺血、四肢缺血、外周动脉疾病、间歇性跛行、缺血性心肌病、和心肌缺血(WO97/14307)。已证明，多种因子具有血管发生性活性。这些因子包括碱性和酸性成纤维细胞生长因子(bFGF和aFGF)、FGF-5(美国专利5,661,133)、内皮细胞生长因子(Pu等人，1993，循环(Circulation)88208-2156)、促血管生成素(angiopoietin)、和VEGF(评论参阅Melillo等人，1997；和Lewis等人，1997)。还有人提出，血管发生对于实体瘤及其转移的生长和维持而言是必需的(美国专利5,854,205)。为了刺激血管发生，肿瘤可上调多种血管发生性因子(包括VEGF)的生成。VEGF血管内皮细胞生长因子是一类血管发生性多肽，也是血小板衍生的生长因子蛋白质家族的成员。这些蛋白质是糖基化阳离子二聚体，分子量约为46-48kDa。与其它血管发生性因子相比，VEGF的前面有天然信号序列，因而能够由完整细胞分泌。VEGF的其它名称包括血管通透因子(VPF)和c-fos诱导的生长因子(FIGF)。已鉴定了VEGF的几种形式，包括VEGF121(美国专利5,219,739)、VEGF165(美国专利5,332,672)、VEGF189(美国专利5,240,848)、VEGF206、VEGF-2(WO95/24473和WO96/39515)、VEGF-B(美国专利5,607,918和5,840,693)、和VEGF-D(WO97/12972)。已显示，VEGF的多种形式在缺血组织中促进血管内皮细胞的有丝分裂，并增强侧副血管的形成和血流。过渡金属离子(诸如CoCl2)显示增强VEGF基因的表达并刺激血管形成(美国专利5,480,975)。AktAKT蛋白是在凋亡(程序化细胞死亡)中发挥作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。最近，已研究了细胞存活/死亡的调控所包括的两种细胞内信号途径。凋亡刺激激酶1(ASK1)的激活在多种细胞类型中导致凋亡(Ichijo等人，1997)，而包含磷酸肌醇3-激酶(PI3K)和Akt的途径导致细胞保护作用。已证明，ASK1活性是由肿瘤坏死因子-α(TNFα)治疗或Fas连接诱导的(Ichijo等人，1997；和Chang等人，1998)。ASK1显性失活突变体的过度表达抑制由TNFα或Fas连接诱导的凋亡，说明ASK1在TNFα或Fas连接诱导的凋亡过程中发挥重要作用。ASK1诱导凋亡的分子机制尚不清楚。已显示，ASK1的异位表达导致多种应激所激活信号途径的激活，诸如可介导ASK1所诱导凋亡的MKK4/JNK和MKK6/p38途径(Ichijo等人，1997)。PI3K/Akt途径对于调控细胞存活/死亡而言似乎也是重要的(Kulik等人，1997；Franke等人，1997；Kauffmann-Zeh等人，1997；Hemmings，1997；和Dudek等人，1997)。存活因子，诸如血小板衍生的生长因子(PDGF)、神经生长因子(NGF)、和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)，在多种状况下通过诱导PI3K活性而促进细胞存活(Kulik等人，1997；和Hemmings，1997)。激活的PI3K导致磷脂酰肌醇(3，4，5)-三磷酸(PtdIns(3，4，5)-P3)的生成，继而磷脂酰肌醇(3，4，5)-三磷酸结合含AH/PH结构域的丝氨酸/苏氨酸激酶Akt并诱导其活性(Franke等人，1995；Hemmings，1997b；Downward，1998；和ALessi等人，1996)。PI3K的特异抑制剂或Akt显性失活突变体消除这些生长因子或细胞因子促进存活的活性。另外，组成性的活性PI3K或Akt突变体的引入在细胞通常经历凋亡性细胞死亡的条件下促进细胞存活(Kulik等人，1997；和Dudek等人，1997)。这些观察结果证明，PI3K/Akt途径在细胞存活/凋亡的调控中发挥重要作用。文献中已鉴定了人Akt蛋白激酶的两种异构体，Akt1和Akt2(Staal，1987)。美国临时申请60/125,108中描述了人Akt的第三种形式，命名为Akt3。Nakatani等人(1999，生物化学和生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)257906-910)描述了Akt的另一种异构体。还鉴定了大鼠Akt序列(Konishi等人，1995)。
已显示，人Akt1的C末端第473位丝氨酸对于它的调控是必需的(Stokeo等人，1997；和Stephens等人，1998)。生长因子刺激后，PI3K激活。PI3K的产物PtdIns(3，4，5)-P结合Akt1，并引起Akt1由细胞质转移至细胞质内膜附近，在此第308位苏氨酸和第473位丝氨酸发生磷酸化(Downward，1998)。这些残基的磷酸化对于Akt1的激活是重要的。已显示，最近鉴定的蛋白激酶PDK1负责第308位苏氨酸的磷酸化，而磷酸化第473位丝氨酸的激酶尚未鉴定(Stokeo等人，1997；和Stephens等人，1998)。基因疗法基因疗法包括通过将遗传信息引入患者(诸如引入患者受影响的细胞或器官)来校正缺陷或异常(突变、异常表达、等等)。可在体外将这种遗传信息引入细胞，然后再将经修饰细胞重新引入身体；或者，直接在体内引入适当位点。在这方面，文献中已描述了细胞转染和基因转移的不同技术(参阅Roemer和Friedman，1992，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)208211)，包括“裸露DNA”的转染和包含DNA与DEAE-dextran(Pagano等人，1967，病毒学杂志(J.Virol.)1891)、DNA与核蛋白(Kaneda等人，1989，科学(Science)243375)、DNA与脂质(Felgner等人，1987，美国国家科学院进展(PNAS)847413)的复合物、使用脂质体(Fraley等人，1980，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)25510431)、等等的多种技术。最近，使用病毒作为基因转移载体的应用有希望代替物理转染技术。在这方面，已测试了不同病毒感染某些细胞群体的能力，包括逆转录病毒、疱疹病毒、腺伴随病毒、和腺病毒。
已有人提出用于血管发生的基因疗法，具体采用VEGF编码序列(Melillo等人，1997；和Lewis等人，1997)。在兔后肢局部缺血模型中，将含VEGF165cDNA的质粒动脉内或肌肉内施用增加了侧副血流(Tsurumi等人，1996，循环(Circulation)943281-3290；Takeshita等人，1996，生物化学和生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)227628-635)。在这种模型中，含人VEGF121、VEGF165、和VEGF189cDNA的质粒也显示具有血管发生性活性(Takeshita等人，1996，实验室研究(Lab Invest.)75487-501；和WO97/14307)。相似的，含VEGF165编码序列的复制缺陷型腺病毒在小鼠中可诱导新血管形成(Muhlhauser等人，1995，循环研究(Circ.Res.)771077-1086)。在人类患者中，含VEGF165序列的质粒显示在缺血的四肢(Isner等人，1996，柳叶刀(Lancet)348370-374)和心脏(参阅《时代》(Time)杂志，1999年1月11日，第68-73页)中诱导血管发生。
本发明涉及用于刺激血管发生的另一种方法，其中并不是直接施用VEGF编码序列。更具体的说，申请人出乎意料的发现，VEGF生成是由Akt蛋白诱导的。因此，本发明致力于通过将Akt蛋白引入细胞来刺激细胞内的VEGF表达。细胞优选存在于患有局部缺血状况的患者体内，其结果是患者体内有益的侧副血管形成。
本文对任何参考文献的引用不应当解释为对这些参考文献作为本申请的“现有技术”的许可。
发明概述本发明涉及用于刺激细胞内VEGF表达的方法和组合物。更具体的说，申请人出乎意料的发现，Akt蛋白能够刺激VEGF表达。在最优选的方面，细胞存在于患有局部缺血状况的患者体内，而且结果是患者体内有益的侧副血管形成。
因此，本发明的第一个目标涉及通过对细胞施用Akt蛋白从而在细胞内诱导VEGF表达的方法。蛋白质可以是任何Akt蛋白。Akt蛋白优选人Akt蛋白。Akt蛋白更优选人Akt1、Akt2、或Akt3。
施用Akt蛋白后生成的VEGF可以是能够刺激血管发生的任何形式的VEGF。VEGF优选VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206、VEGF-2、VEGF-B、和VEGF-D。
一方面，对细胞施用Akt蛋白。在优选的实施方案中，对细胞施用编码Akt蛋白且可操作连接表达控制序列的核酸。核酸可以是质粒或病毒的一部分。优选的病毒载体是逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、和痘苗病毒。
可以单独施用Akt蛋白或编码Akt蛋白的核酸，或者与过渡金属离子和/或血管舒张剂联合施用。也可以与编码第二种血管发生性因子且可操作连接表达控制序列的核酸一起施用Akt蛋白或编码Akt蛋白的核酸。优选的血管发生性因子包括VEGF、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、内皮细胞生长因子、或促血管生成素。另一方面，可以对细胞施用超过一种形式的Akt蛋白。
本发明还涉及通过对患有局部缺血状况患者施用Akt蛋白从而在患者细胞内诱导VEGF表达的方法。局部缺血状况可以是脑血管缺血、肾缺血、肺缺血、四肢缺血、心肌缺血、或者缺血性、特发性、或肥大性心肌病。蛋白质可以是任何Akt蛋白。Akt蛋白优选Akt1、Akt2、或Akt3。
施用Akt蛋白后生成的VEGF可以是能够刺激血管发生的任何形式的VEGF。VEGF优选VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206、VEGF-2、VEGF-B、和VEGF-D。
一方面，对患者施用Akt蛋白。在优选的实施方案中，对患者施用编码Akt蛋白且可操作连接表达控制序列的核酸。核酸可以是质粒或病毒的一部分。优选的病毒载体是逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、和痘苗病毒。在最优选的实施方案中，通过穿心外膜手术施用或通过使用导管的经皮投递将编码Akt蛋白的核酸直接施用于心脏组织。
可以对患者单独施用Akt蛋白或编码Akt蛋白的核酸，或者与过渡金属离子和/或血管舒张剂联合施用。也可以与编码第二种血管发生性因子且可操作连接表达控制序列的核酸一起对患者施用Akt蛋白或编码Akt蛋白的核酸。优选的血管发生性因子包括VEGF、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、内皮细胞生长因子、或促血管生成素。另一方面，可以对细胞施用超过一种形式的Akt蛋白。
本发明还涉及包含编码Akt蛋白的核酸、过渡金属离子和/或血管舒张剂、和制药学可接受载体的药物组合物。核酸可以是质粒或病毒载体的一部分。优选的病毒载体是逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、和痘苗病毒。
另一方面，本发明涉及通过在患有肿瘤的患者体内抑制Akt活性水平由此抑制VEGF生成从而在患者体内抑制血管发生的方法。可以通过在反义核酸在胞内条件下与Akt mRNA发生杂交的条件下将Akt反义核酸引入患者细胞从而降低Akt水平。还可以通过以足以结合并灭活Akt的水平将特异结合Akt的胞内结合蛋白(诸如单链Fv抗体，scFv)引入患者细胞内从而降低Akt水平。在另一个实施方案中，可以通过施用编码Akt的显性失活形式的核酸从而降低Akt活性。优选直接对肿瘤细胞施用反义核酸、胞内结合蛋白或其编码核酸、或者显性失活Akt突变体。
图的简述

图1激活的Akt3突变体的构建图1A激活的Akt3的示意图。在同一读码框内，在人Akt3的全长编码序列的N端融合来自人Src基因的肉豆蔻酸化信号(Myr)，在C端融合HA标签(HA)(见实施例)。
图1B激活的Akt3在HEK293细胞内的异位表达。用CMV6-MyrAkt3HA或仅用表达质粒CMV6转染HEK293细胞。转染后24小时，制备细胞裂解物，并用抗HA抗体进行免疫印渍。
图1C激活的Akt3具有Akt活性。用激活的Akt3(MyrAkt3HA)的表达质粒或仅用表达载体CMV6转染HEK293细胞。转染后24小时，制备细胞裂解物，并用抗HA抗体进行免疫沉淀。以由GSK3衍生的肽作为底物，测量免疫沉淀物的Akt3激酶活性。Bkgd来自未转染细胞的背景水平；CMV6用CMV6转染的细胞；Akt3cak用组成性激活的Akt3的表达质粒(CMV6-MyrAkt3HA)转染的细胞。图2在HeLa细胞中Akt增加VEGF165的分泌用激活的小鼠Akt1(Akt1)或激活的人Akt3(Akt3)的表达质粒或者仅用CMV6载体转染HeLa细胞。转染后1天，给细胞换成低有丝分裂原培养基(DMEM-0.5％FBS)。16小时后，收集培养基用于VEGF ELISA测定法。A道用0.4μg CMV6载体DNA转染的细胞(6孔组织培养板)；Akt1道用0.4μg CMV6-mAkt1cak表达质粒转染的细胞(6孔组织培养板)；Akt3道用激活人Akt3的表达质粒(Akt3)转染的细胞(6孔组织培养板)。图3在人冠脉平滑肌细胞和人骨骼肌细胞中Akt增加VEGF165的表达图3A以3×108VP/ml(VP病毒颗粒)的浓度，用绿色荧光蛋白(AV-GFP)、组成性有活性的小鼠Akt1(AV-mAkt1cak)、或组成性有活性的人Akt3(AV-hAkt3cak)的重组腺病毒，感染人骨骼肌细胞(HSKMC)过夜。感染后1天，收集培养基，并通过ELISA测定法测量培养基中的VEGF水平。
图3B以3×108VP/ml的浓度，用AV-GFP、AV-mAkt1cak、或AV-hAkt3cak，感染人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)过夜。感染后1天，收集培养基，并通过针对人VEGF的ELISA测定法测量培养基中的VEGF水平。
图3C以3×108VP/ml的浓度，用指定病毒感染HCASMC过夜。作为对照，将未感染细胞转变成缺氧条件。1天后，由这些细胞分离总RNA，并通过Northern印渍分析检测VEGF表达。图4在大鼠心肌细胞中Akt增加VEGF表达以3×107VP/ml的浓度，用绿色荧光蛋白(AV-GFP)、组成性有活性的小鼠Akt1(AV-mAkt1cak)、或组成性有活性的人Akt3(AV-hAkt3cak)的重组腺病毒，感染新生心肌细胞过夜。作为对照，对未感染细胞进行24小时缺氧处理。感染后1天，分离总RNA，并通过Northern印渍分析检测VEGF表达。
发明详述本发明有利的提供了用于在细胞内刺激VEGF表达的方法和组合物。因此，通过提供用于在缺血组织内刺激侧副血管形成的方法和设备，本发明能够治疗患者的局部缺血性疾病。更具体的说，本文显示Akt蛋白能刺激血管发生性蛋白质VEGF的表达。因此，本发明的第一个目标涉及通过将Akt蛋白引入细胞从而在细胞内刺激VEGF表达。在优选的方面，对患者施用编码Akt蛋白的核酸。
本发明还涉及通过对患有局部缺血状况患者施用Akt蛋白来治疗患者。优选对患者施用编码Akt蛋白的核酸，结果是患者缺血组织内有益的侧副血管形成。
下文各部分将更详细的阐明本发明的各个方面。分成多个部分的这种组织形式意欲促进对本发明的理解，而绝非意欲限制本发明。定义下文定义的术语用于整篇说明书，应该有助于理解本发明的范围和实践。
在特定的实施方案中，术语“大约”或“大致”指指定数值或范围的20％以内，优选10％以内，更优选5％以内。
“核酸”指包含共价连接的亚单位核苷酸的聚合化合物。核酸包括多核糖核酸(RNA)和多脱氧核糖核酸(DNA)，二者可以是单链或者双链。DNA包括cDNA、基因组DNA、合成DNA、和半合成DNA。
“基因”指编码多肽的核苷酸集群，包括cDNA和基因组DNA核酸。
重组DNA分子”指经历了分子生物学操作的DNA分子。
“载体”指用于将核酸转移至宿主细胞内的任何方法。载体可以是复制子，它可附着另一种DNA片段从而使所附着片段得以复制。“复制子”指作为体内DNA自主复制单位使用即能够在其自身控制下进行复制的任何遗传元件，如质粒、噬菌体、粘粒、染色体、或病毒。术语“载体”包括用于在体外、离体、或体内将核酸引入细胞的病毒和非病毒方法。病毒载体包括逆转录病毒、腺伴随病毒、痘病毒、杆状病毒、痘苗病毒、单纯疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、和腺病毒载体，下文将更详细的阐明。非病毒载体包括质粒、脂质体、带电脂质(细胞转染剂)、DNA-蛋白质复合物、和生物聚合物。除了核酸，载体还可以包含一种或多种调控区，和/或可用于选择、测量、和监测核酸转移结果(转移至哪种组织、表达持续时间、等等)的可选择标记物。
“克隆载体”是复制子，诸如质粒、噬菌体、或粘粒，它可附着另一种DNA片段从而使所附着片段得以复制。克隆载体可以是能在一种细胞类型中复制而在另一种细胞中表达(“穿梭载体”)。
“盒”指能够插入载体特异限制位点的DNA片断。DNA片断编码目的多肽，而盒及限制位点的设计要保证将盒插入正确转录和翻译的读码框。
当已将外源或异源DNA引入细胞内时，就说细胞已被所述DNA转染。当所转染的DNA引起表型改变时，就说细胞已被外源或异源DNA“转化”。转化的DNA可整合(共价连接)到组成细胞基因组的染色体DNA中。
“核酸分子”指核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷、或胞苷；RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式，或其任何磷酸酯类似物，诸如硫代磷酸酯和硫酯，可以是单链形式或双链螺旋。双链DNA-DNA、DNA-RNA、和RNA-RNA螺旋是可能的。术语“核酸分子”，特别是DNA或RNA分子，仅指分子的一级结构和二级结构，而并未将其限制于任何特定三级结构。因此，该术语包括(但不限于)线性或环状DNA分子(如限制片段)、质粒、和染色体中的双链DNA。在对特定双链DNA分子结构的讨论中，本文可根据正常惯例描述序列，即只给出沿DNA非转录链(即序列与mRNA同源的链)的5’至3’方向的序列。“重组DNA分子”指经历了分子生物学操作的DNA分子。
当单链形式的核酸分子在适当的温度和离子强度条件下能够与其它核酸分子退火时，就说核酸分子与另一种核酸分子(诸如cDNA、基因组DNA、或RNA)是“可杂交的”(参阅Sambrook等人，同上)。温度和离子强度条件决定了杂交的“严谨性”。对于初步筛选同源核酸，可使用对应Tm为55℃的低严谨性杂交条件，如5x SSC/0.1％ SDS/0.25％奶/无甲酰胺；或30％甲酰胺/5x SSC/0.5％ SDS。中严谨性杂交条件对应较高Tm，如40％甲酰胺/5x或6x SCC。高严谨性杂交条件对应最高Tm，如50％甲酰胺/5x或6x SCC。杂交要求两种核酸包含互补序列，当然，取决于杂交的严谨性，碱基之间的错配还是有可能的。对于核酸杂交而言，适当的严谨性取决于核酸长度和互补程度，变数是本领域众所周知的。两种核苷酸序列之间的相似或同源程度越高，具有这两种序列的核酸的杂交Tm值就越高。核酸杂交的相对稳定性(对应较高Tm)以如下顺序降低RNARNA、DNARNA、DNADNA。对于长度超过100个核苷酸的杂合物，已经推导了用于计算Tm的方程(参阅Sambrook等人，同上，9.50-0.51)。对于与较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更加重要，而寡核苷酸的长度决定了它的特异性(参阅Sambrook等人，同上，11.7-11.8)。优选的是，可杂交核酸的最小长度为至少大约10个核苷酸，优选至少大约15个核苷酸，更优选至少大约20个核苷酸。
在特定的实施方案中，术语“标准杂交条件”指Tm为55℃，并采用上文提出的条件。在优选的实施方案中，Tm为60℃；在更优选的实施方案中，Tm为65℃。
用于此处时，术语“寡核苷酸”指通常至少18个核苷酸长且可与编码Akt的基因组DNA分子、cDNA分子、或mRNA分子杂交的核酸。可标记寡核苷酸，如用32P-核苷酸或已共价缀合标记物(诸如生物素)的核苷酸。在一个实施方案中，标记后的寡核苷酸可用作探针以检测Akt编码核酸的存在。在另一个实施方案中，寡核苷酸(可标记其中之一或二者)可用作PCR引物，用于克隆Akt的全长或片段，或用于检测Akt编码核酸的存在。在还有一个实施方案中，本发明的寡核苷酸可与AktDNA分子形成三股螺旋。一般说来，可合成制备寡核苷酸，优选使用核酸合成仪。因此，可用非天然存在的磷酸酯类似键(诸如硫酯键等)制备寡核苷酸。
DNA“骗码序列”指当置于适当调节序列的控制之下时，在体外或体内细胞中将转录并翻译成多肽的双链DNA序列。5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子决定了编码序列的边界。编码序列可以包括(但不限于)原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列、甚至合成DNA序列。若编码序列意欲在真核细胞中表达，则多腺苷酸化信号和转录终止序列通常将位于编码序列的3’端。
转录和翻译控制序列是DNA调节序列，诸如提供编码序列在宿主细胞的表达的启动子、增强子、终止子、等等。在真核细胞中，多腺苷酸化信号也是控制序列。
“启动子序列”指能结合细胞内RNA聚合酶并起始下游(3’方向)编码序列转录的DNA调控区。为了对本发明进行说明，启动子序列限定为在3’末端为转录起始位点，并向上游(5’方向)延伸，包括起始超过背景的可检测水平的转录所必需的最小数目碱基或元件。在启动子序列中可找到转录起始位点(可方便的确定，例如通过核酸酶S1作图)，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。
当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA时，然后它被剪接(若编码序列包含内含子)，并翻译成由编码序列编码的蛋白质，就说编码序列在细胞中处于转录和翻译控制序列的“控制之下”。
用于此处时，术语“同源”指具有“共同进化起源”的蛋白质之间的相互关系，包括来自超家族的蛋白质(如免疫球蛋白超家族)和来自不同物种的同源蛋白质(如肌球蛋白轻链等)(Reeck等人，1987，细胞(Cell)50667)。这种蛋白质(及其编码基因)具有序列同源性，反映在它们的序列具有高度的相似性。
因此，术语“序列相似性”指具有或不具有共同进化起源的蛋白质的核酸或氨基酸序列之间的相同或一致程度(参阅Reeck等人，同上)。但是，在普通用法及本申请中，当用诸如“高度的”之类副词修饰时，术语“同源的”可以指序列相似性而非共同进化来源。
在特定的实施方案中，当两种DNA序列确定长度的至少大约50％(优选至少大约75％，最优选至少大约90％或95％)核苷酸匹配时，就说这两种DNA序列是“基本同源的”或“基本相似的”。使用可由序列数据库获得的标准软件比较序列，或者在例如为具体系统确定的严谨性条件下进行Southern杂交实验，由此可以鉴定基本同源的序列。适当杂交条件的确定属于本领域技术范围之内。参阅例如Maniatis等人，同上；《DNA克隆》(DNA Cloning)，第1和2卷，同上；《核酸杂交》(Nucleic Acid Hybridization)，同上。
“反义核酸”指与有义序列互补的核苷酸序列。反义核酸可用于下调或阻断由有义链编码的多肽的表达。
转录和翻译控制序列指提供编码序列在宿主细胞中的表达的DNA调控序列，如启动子、增强子、终止子、等等。在真核细胞中，多腺苷酸化信号是另一类控制序列。
“信号序列”包含于表达在细胞表面的蛋白质编码序列的开始。该序列编码信号肽，位于成熟多肽的N端，指导宿主细胞转运多肽。术语“转运信号序列”在本文中用于指这类信号序列。可找到与多种真核和原核生物天然蛋白质有关的转运信号序列，而且常常在两类生物体中都发挥功能。
“调控区”指调控第二种核酸序列表达的核酸序列。调控区可包括天然负责特定核酸表达的序列(同源区)，或者可包括来源不同却负责不同蛋白质或甚至合成蛋白质表达的序列(异源区)。特别的，序列可以是以特异或非特异方式、可诱导或非可诱导方式，刺激或抑制基因转录的真核或病毒基因的序列或衍生序列。调控区包括复制起点、RNA剪接位点、启动子、增强子、转录终止序列、指导多肽进入靶细胞分泌途径的信号序列、和启动子。
来自“异源来源”的调控区指与表达的核酸非天然相连的调控区。异源调控区包括来自不同物种的调控区、来自不同基因的调控区、杂合调控序列、和非天然存在而由本领域普通技术人员设计的调控序列。
“异源”DNA指非天然存在于细胞中或细胞染色体位点的DNA。异源DNA优选包括对细胞而言是外源的基因。
“同源重组”指将外源DNA序列插入另一种DNA分子，如将载体插入染色体。载体优选靶向用于同源重组的特异染色体位点。对于特异同源重组，载体将包含与染色体序列同源的足够长区域，从而得以互补结合并将载体掺入染色体。较长的同源区和较高程度的序列相似性可增加同源重组的效率。
“多肽”指包含共价连接的氨基酸残基的聚合混和物。氨基酸具有如下一般结构 根据侧链R，将氨基酸分成7组(1)脂肪族侧链，(2)含羟基OH的侧链，(3)含硫原子的侧链，(4)含酸性基团或酰胺基团的侧链，(5)含碱性基团的侧链，(6)含芳香环的侧链，和(7)脯氨酸，在这种氨基酸中侧链与氨基融合。本发明的多肽优选地包含至少大约14个氨基酸。
“蛋白质”指在活细胞中发挥结构性或功能性作用的多肽。
多肽或蛋白质的“变体”指由多肽或蛋白质衍生且保留该多肽或蛋白质的至少一种生物学特性的任何类似物、片段、衍生物、或突变体。自然界中可能存在多肽或蛋白质的不同变体。这些变体可以是特征为编码蛋白质的结构基因核苷酸序列中存在差异的等位基因变异，或者可以包括不同剪接或翻译后修饰。熟练技术人员能够产生具有一处或多处氨基酸替代、删除、添加、或取代的变体。这些变体可包括，但不限于，(a)用保守或非保守氨基酸替代了一个或多个氨基酸残基的变体，(b)向多肽或蛋白质添加了一个或多个氨基酸的变体，(c)一个或多个氨基酸包含取代基的变体，和(d)多肽或蛋白质融合了另一种多肽(诸如血清清蛋白)的变体。本领域普通技术人员知道用于获得这些变体的技术，包括基因(遏制、删除、突变、等等)、化学、和酶技术。
若这些等位基因变异、类似物、片段、衍生物、突变体、和修饰(包括其它mRNA剪接形式和其它翻译后修饰形式)导致保留多肽任何生物学特性的多肽衍生物，则意欲将它们包括于本发明的范围之内。
“异源蛋白质”指细胞中非天然产生的蛋白质。
当超过大约40％的氨基酸相同或超过大约60％的氨基酸相似(功能相同)时，就说这两种氨基酸序列是“基本同源的”或“基本相似的”。优选通过使用例如GCG(Genetics Computer Group，GCG包程序手册，第7版，麦迪逊，威斯康星)累积程序进行比对来鉴定相似或同源序列。
术语“对应”在本文中用于指相似或同源序列，无论测量相似性或同源性的分子的确切位置是否相同或相似。核酸或氨基酸序列比对可包含间隔物。因此，术语“对应”指序列相似性，而非氨基酸残基或核苷酸碱基的编号。编码Akt蛋白的基因本发明涵盖Akt蛋白或多肽，或者编码Akt蛋白或多肽的核酸在细胞中刺激VEGF表达的应用。Akt优选人Akt3蛋白或多肽，包括Akt的全长或天然存在形式或其能够刺激VEGF表达的任何片段。用于此处时，“Akt”指Akt多肽，而“akt”指编码Akt多肽的基因。
本领域知道多种小鼠和人Akt序列(参阅Coffer等人，1991，欧洲生化杂志(Eur.J.Biochem.)201475-481；Jones等人，1991，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)884171-4175；Bellacosa等人，1993，癌基因(Oncogene)8745-754；GenBank编号M63167、X61037、和X65687；和美国临时申请号60/125,108)。Akt优选人Akt1(SEQ ID NO11)、Akt2(SEQ ID NO12)、或Akt3(SEQID NO2)。本发明的优选Akt包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列。本发明的优选核酸编码SEQ ID NO2、SEQ ID NO11、或SEQ ID NO12所示氨基酸序列。核酸更优选包含SEQ ID NO1所示序列。Akt还可衍生自非人来源。
根据本发明，可采用本领域技术范围之内的传统分子生物学技术、微生物学技术、和重组DNA技术。文献中充分解释了这些技术。参阅例如Sambrook、Fritsch、和Maniatis，《分子克隆实验室手册》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第2版，1989，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(本文“Sambrook等人，1989)；《DNA克隆实践方法》(DNA CloningA Practical Approach)，第1和2卷，D.N.Glover编，1985；《寡核苷酸合成》(OligonucleotideSynthesis)，M.J.Gait编，1984；《核酸杂交》(Nucleic AcidHybridization)，B.D.Hames和S.J.Higgins编，1985；《转录和翻译》(Transcription And Translation)，B.D.Hames和S.J.Higgins编，1984；《动物细胞培养》(Animal Cell Culture)，R.I.Freshney编，1986；《固定化细胞和酶》(Immobilized Cells And Enzymes)，IRL出版社，1986；B.Perval，《分子克隆实践指南》(A Practical GuideTo Molecular Cloning)，1984；F.M.Ausubel等人编，《分子生物学现行方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley& Sons公司，1994。
可以由任何来源(特别是人cDNA或基因组文库)分离编码Akt的基因(无论是基因组DNA还是cDNA)。如上文所述，本领域众所周知用于获得akt基因的常用方法(参阅Sambrook等人，1989，同上)。
因此，任何动物细胞潜在的可作为核酸来源用于akt基因的分子克隆。可通过本领域知道的标准流程由克隆的DNA(如DNA“文库”)获得所述DNA，优选由高水平表达该蛋白质的组织(如心、胰、和骨骼肌cDNA)制备的cDNA文库；通过化学合成；通过cDNA克隆；或者通过由预定细胞纯化的基因组DNA或其片段的克隆获得该DNA(参阅例如Sambrook等人，1989，同上；D.M.Glover编，1985，《DNA克隆实践方法》(DNA CloningA Practical Approach)，第1和2卷，MRL出版有限公司，牛津，英国)。除了编码区，由基因组DNA衍生的克隆可包含调控区和内含子DNA区；由cDNA衍生的克隆将不包含内含子序列。无论来源是什么，应将基因分子克隆到合适载体中用于扩增基因。
一旦制得该DNA片段，即可以大量方法实现对含预定akt基因的特定DNA片段的鉴定。例如，可通过与标记探针的核酸杂交筛选DNA片段(Benton和Davis，1977，科学(Science)196180；Grunstein和Hogness，1975，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)723961)。这些与探针基本同源的DNA片段将发生杂交。如上文所述，同源程度越高，则可使用越严谨的杂交条件。在特定的实施方案中，使用Northern杂交条件鉴定akt基因的mRNA剪接变体。
可根据基因特性进行进一步的选择，如基因是否编码具有本文公开的Akt蛋白的等电性质、电泳性质、氨基酸组成、或部分氨基酸序列的蛋白质产物。因此，可通过基于其表达产物的物理学、化学或免疫学特性的测定法检测该基因的存在与否。例如，可根据它们产生的蛋白质是否具有与Akt相似或相同的电泳迁移、等电聚焦或非平衡pH凝胶电泳行为、蛋白水解消化图谱、或抗原特性来选择cDNA克隆或杂交选择正确mRNA的DNA克隆。在特定的实施方案中，针对人Akt特异表位产生的多克隆抗体识别表达的蛋白质。
本发明还涉及编码Akt能够刺激VEGF表达的等位基因变体、剪接变体、类似物、和衍生物的基因(如cDNA)的应用。Akt衍生物和类似物的生成和应用属于本发明范围之内。这些变体、类似物、衍生物、和同源物应保留刺激VEGF表达的能力。
通过替代、添加、或删除改变编码核酸序列以提供功能相当的分子，由此可制备Akt衍生物。优选制备相对于天然Akt而言功能活性增强或升高的衍生物。
由于核苷酸编码序列的简并性，编码与akt基因基本相同的氨基酸序列(包括含单个氨基酸变异的氨基酸序列)的其它DNA序列也可应用于本发明的实践。这些包括，但不限于，等位基因、来自其它物种的同源基因、和含全部或部分akt基因的核苷酸序列，所述核苷酸序列通过用编码原序列相同氨基酸残基的不同密码子替代而改变，由此产生沉默的变化。同样的，本发明的akt衍生物包括，但不限于，从一级氨基酸序列上看含全部或部分Akt蛋白氨基酸序列的那些，它们包括用序列中导致保守氨基酸替代的残基来替代功能相当的氨基酸残基而被改变的序列。例如，可用极性相似的另一氨基酸替代序列中的一个或多个氨基酸残基，它可用作功能同等物，产生沉默的改变。序列中氨基酸的替代物可选自该氨基酸所属类型的其它成员。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、和甲硫氨酸。含芳香环结构的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸、和酪氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、和组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。预期这样的改变不会影响聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的表观分子量或等电点。
特别优选的替代是-用赖氨酸取代精氨酸，反之亦然，从而保持正电荷；-用谷氨酸取代天冬氨酸，反之亦然，从而保持负电荷；-用丝氨酸取代苏氨酸，从而保持游离羟基；和-用谷氨酰胺取代天冬酰胺，从而保持游离CONH2。
还可引入氨基酸替代，以便用具有特别优选特性的氨基酸进行替代。例如，可引入半胱氨酸以添加可能与其它半胱氨酸形成二硫键的位点。可引入组氨酸作为特别有催化活性的位点(即组氨酸可作为酸或碱，是生化催化中最常用的氨基酸)。也可引入脯氨酸，因为它具有特殊的平面结构，该结构在蛋白质结构中可诱导β-转角。
可通过本领域知道的多种方法产生编码本发明Akt衍生物和类似物的基因。导致它们产生的操作可于基因或蛋白质水平进行。例如，可通过本领域知道的许多策略中的任一种修饰克隆的Akt基因序列(Sambrook等，1989，同上)。可用限制性内切酶在适当位点切割此序列，根据需要还可进行其它酶促修饰、分离、和体外连接。产生编码Akt衍生物或类似物的基因时，应小心确保修饰后的基因保留在与Akt基因相同的翻译读码框内，而在编码所需活性的基因区内不被翻译终止信号打断。
另外，Akt编码核酸序列可在体外或在体内突变以产生和/或破坏翻译、起始、和/或终止序列，或产生编码区中的变异和/或形成新的限制性内切酶位点或破坏原先存在的位点，从而便于进一步的体外修饰。这些突变优选增强突变Akt基因产物的功能活性。可使用本领域知道的任何诱变技术，包括，但不限于，体外定点诱变(C.Hutchinson等人，1978，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2536551；Zoller和Smith，1984，DNA 3479-488；Oliphant等人，1986，基因(Gene)44177；Hutchinson等人，1986，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)83710)、TAB?接头(Pharmacia)的使用，等等。PCR技术优选用于定位诱变(参阅Higuchi，1989，“用PCR加工DNA”，在《PCR技术DNA扩增的原理和应用》(PCR TechnologyPrinciples andApplicaiton for DNA Amplification)中，H.Erlich编，Stockton出版社，第6章，第61-70页)。
然后可将鉴定和分离后的DNA序列插入合适的克隆载体。可使用本领域知道的大量的载体-宿主系统。可用的载体包括，但不局限于，质粒或修饰后的病毒，但是载体系统必须与所使用的宿主细胞相容。载体的实例包括，但不限于，大肠杆菌噬菌体，诸如λ衍生物，或质粒，诸如pBR322衍生物或pUC质粒衍生物，如pGEX载体、pmal-c、pFLAG、等等。可通过将DNA片段连接到具有互补粘端的克隆载体内来实现克隆载体中的插入。但是，若克隆载体中不存在用于片段化DNA的互补限制性位点，则可酶促修饰DNA分子的末端。或者，可通过将核苷酸序列(接头)连接到DNA末端来产生任何预定位点；这些连接的接头可包含编码限制性内切酶识别序列的特殊化学合成寡核苷酸。可经转化、转染、感染、电穿孔、等等将重组分子引入宿主细胞，从而产生基因序列的许多拷贝。克隆的基因优选包含于穿梭载体质粒中，以供在克隆细胞(如大肠杆菌)中扩增，而且在需要时便于纯化用于随后插入适当的表达细胞系。例如，穿梭载体是能在超过一种类型的生物体中复制的载体，可通过连接来自大肠杆菌质粒的序列与来自酵母2μ质粒的序列制备既能在大肠杆菌中复制又能在酿酒酵母中复制的穿梭载体。Akt多肽的表达可将编码Akt或其抗原性片段、衍生物、或类似物以及它的功能活性衍生物(包括嵌合蛋白质)的核苷酸序列插入适当的表达载体，即包含转录和翻译插入的蛋白质编码序列所必需的元件的载体。本文将这些元件称为“启动子”。因此，本发明核酸在本发明表达载体中可操作连接启动子。cDNA和基因组序列都可克隆并在这些调控序列的控制下表达。表达载体还优选包含复制起点。
可在重组表达载体上提供必需的转录和翻译信号，或者可由编码Akt和/或其侧翼区的天然基因提供。在一个优选的实施方案中，使用心脏特异启动子和/或特异趋向心脏细胞的载体将Akt的表达限制于心肌细胞。
潜在的宿主-载体系统包括，但不限于，感染了病毒(如痘苗病毒、腺病毒、等)的哺乳动物细胞系统；感染了病毒(如杆状病毒)的昆虫细胞系统；微生物，诸如含酵母载体的酵母；或用噬菌体、DNA、质粒DNA、或粘粒DNA转化的细菌。载体的表达元件在强度和特异性上都有所变化。取决于所用的宿主-载体系统，可使用大量合适的转化和翻译元件中的任一种。
在通过重组整合编码序列后，可在染色体上表达重组Akt蛋白或其功能片段、衍生物、嵌合构建物、或类似物。在这点上，可使用大量扩增系统中的任一种来实现高水平的稳定基因表达(参阅Sambrook等人，1989，同上)。
可在适当的细胞培养基中在供细胞表达Akt的条件下培养包含含Akt编码核酸的重组载体的细胞。上述用于将DNA片段插入克隆载体的任何方法都可用于构建包含具有适当转录/翻译控制信号和蛋白质编码序列的基因的表达载体。这些方法可包括体外重组DNA和合成技术，以及体内重组(遗传重组)。
可将编码Akt多肽的核酸可操作连接任何调控区(即本领域已知的启动子/增强子)并受其控制，但是这些调控元件必须在选择用于表达的宿主靶肿瘤处是有功能的。调控区可包含用于在宿主细胞中功能转录的启动子区，以及位于目的基因3’端且提供转录终止信号和多聚腺苷酸化位点的区域。所有这些元件构成了表达盒。
可用于本发明的启动子包括组成性启动子和可调控(可诱导)启动子。启动子有可能天然负责核酸的表达。它也可来自异源来源。具体而言，它可以是真核或病毒基因的启动子序列。例如，它可以是由预定感染的细胞基因组衍生的启动子序列。同样的，它可以是由病毒基因组衍生的启动子序列，诸如腺病毒(E1A和MLP)、巨细胞病毒、或劳氏肉瘤病毒。另外，可通过添加激活或调控序列或者能够发生组织特异或优势表达的序列来修饰启动子(烯醇化酶和GFAP启动子等等)。此外，当核酸不包含启动子序列时，可以插入启动子序列。
可用于实践本发明的启动子包括遍在启动子(如HPRT、波形蛋白、肌动蛋白、微管蛋白)、中间丝启动子(如桥粒蛋白、神经丝、角蛋白、GFAP)、治疗性基因启动子(如MDR型、CFTR、因子VIII)、组织特异启动子(如平滑肌细胞中的肌动蛋白启动子)、在分裂的细胞中优先激活的启动子、应答刺激的启动子(如类固醇激素受体、视黄酸受体)、四环素调控的转录调节物、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、逆转录病毒LTR启动子、金属硫蛋白启动子、SV40启动子、腺病毒Ela启动子、和腺病毒主要晚期启动子(MLP)。WO96/01313、US5,168,062、和5,385,839(收入本文作为参考)中描述了四环素调控的转录调节物和CMV启动子。
更具体的说，可通过本领域已知的任何启动子/增强子元件控制Akt蛋白的表达，但是这些调控元件在选择用于表达的宿主中必须是有功能的。可用于控制基因表达的启动子包括，但不限于，SV40早期启动子区(Benoist和Chambon，1981，自然(Nature)290304-310)、劳氏肉瘤病毒3’长末端重复片段中所含的启动子(Yamamoto等人，1980，细胞(Cell)22787-797)、疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner等人，1981，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)781441-1445)、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等人，1982，自然(Nature)29639-42)；原核表达载体，诸如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等人，1978，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)753727-3731)或tac启动子(DeBoer等人，1983，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)8021-25)；也可参阅“来自重组细菌的有用蛋白质”(1980，科技美国人(Scientific American)24274-94)；来自酵母或其它真菌的启动子元件，诸如Gal4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子；和展示组织特异性并已用于转基因动物的动物转录控制区在胰腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等人，1984，细胞(Cell)38639-646；Ornitz等人，1986，冷泉港生物学季度讨论会(Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.)50399-409；MacDonald，1987，肝脏病学(Hepatology)7425-515)；在胰腺β-细胞内有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan，1985，自然(Nature)315115-122)、在淋巴细胞内有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等人，1984，细胞(Cell)38647-658；Adames等人，1985，自然(Nature)318533-538；Alexander等人，1987，细胞分子生物学(Mol.Cell.Biol.)71436-1444)、在睾丸、乳房、淋巴、和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(Leder等人，1986，细胞(Cell)45485-495)、在肝中有活性的清蛋白基因控制区(Pinkert等人，1987，基因和发育(Gene andDevel.)1268-276)、在肝中有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等人，1985，细胞分子生物学(Mol.Cell.Biol.)51639-1648；Hammer等人，1987，科学(Science)23553-58)、在肝中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等人，1987，基因和发育(Gene and Devel.)1161-171)、在骨髓细胞中有活性的β珠蛋白基因控制区(Mogram等人，1985，自然(Nature)315338-340；Kollias等人，1986，细胞(Cell)4689-94)、在脑的少突胶质细胞中有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区(Readhead等人，1987，细胞(Cell)48703-712)、在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链2基因控制区(Sani，1985，自然(Nature)314283-286)、和在下丘脑中有活性的促性腺释放激素基因控制区(Mason等人，1986，科学(Science)2341372-1378)。
优选的是，或使用心脏特异启动子或使用特异趋向心脏细胞的载体，将Akt的表达限制于心肌细胞。
可通过5种常用方法鉴定包含Akt蛋白编码核酸的表达载体(a)目的质粒DNA或特异mRNA的PCR扩增，(b)核酸杂交，(c)选择标记基因功能的存在或缺失，(d)用适当的限制性内切酶进行分析，和(e)插入序列的表达。在第一种方法中，可通过PCR扩增核酸以检测扩增产物。在第二种方法中，可用探针通过核酸杂交检测插入表达载体的外源基因的存在，所用探针含与插入的标记基因同源的序列。在第三种方法中，可以外源基因插入载体而引起的某些“选择标记”基因功能(如，β-半乳糖苷酶活性、胸苷激酶活性、对抗生素的抗性、转化表型、杆状病毒中包涵体的形成，等等)的存在或丢失为基础鉴定并选择重组载体/宿主系统。在另一个实施例中，若编码Akt的核酸插入载体的“选择标记”基因序列中，则通过选择标记基因功能的缺失可鉴定含Akt插入片段的重组体。在第四种方法中，通过适当的限制酶消化鉴定重组表达载体。在第五种方法中，假如表达蛋白质呈现功能活性构象，那么可通过测定重组体所表达的基因产物的活性、生化或免疫学特征来鉴定重组表达载体。
多种宿主/表达载体组合可用于表达Akt DNA序列。例如，有用的表达载体可包括染色体、非染色体、和合成的DNA序列片段。合适的载体包括SV40衍生物和已知的细菌质粒，如大肠杆菌质粒colE1、pCR1、pBR322、pMa1-C2、pET、pGEX(Smith等人，1988，基因(Gene)6731-40)、pMB9及其衍生物，诸如RP4等质粒；噬菌体DNA，如噬菌体1的大量衍生物，如NM989，和其它噬菌体DNA，如M13和丝状单链噬菌体DNA；诸如2μm质粒等酵母质粒或其衍生物；可用于真核细胞的载体，诸如可用于昆虫或哺乳动物细胞的载体；由质粒与噬菌体DNA联合衍生的载体，诸如经修饰而应用噬菌体DNA或其它表达控制序列的质粒；等等。
例如，在杆状病毒表达系统中，既可使用非融合型转移载体，诸如，但不限于，pVL941(BamHI克隆位点；Summers)、pVL1393(BamHI、SmaI、XbaI、EcoRI、NotI、XmaIII、BglII、和PstI克隆位点；Invitrogen)、pVL1392(BglII、PstI、NotI、XmaIII、EcoRI、XbaI、SmaI、和BamHI克隆位点；Summers和Invitrogen)、和pBlueBacIII(BamHI、BglII、PstI、NcoI、和HindIII克隆位点，可用蓝/白重组体筛选；Invitrogen)；又可使用融合型转移载体，诸如，但不限于，pAc700(BamHI和KpnI克隆位点，其中BamHI识别位点开始于起始密码子；Summers)、pAc701和pAc702(与pAc700相同，具有不同的阅读框架)、pAc360(多角体蛋白起始密码子下游36bp处有BamHI克隆位点；Invitrogen(195))、和pBlueBacHisA、B、C(三种不同的阅读框架，具有BamHI、BglII、PstI、NcoI、和HindIII克隆位点，用于ProBond纯化的N-末端肽和蓝/白斑重组体筛选；Invitrogen(220))。
本发明试图使用的哺乳动物表达载体包括，含可诱导启动子诸如二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子的载体，如包含DHFR表达载体的任何表达载体，或DHFR/氨甲喋呤共扩增载体，诸如pED(PstI、SalI、SbaI、SmaI、和EcoRI克隆位点，该载体既表达克隆基因又表达DHFR，参阅Kaufman，1991，分子生物学现行方案(Current Protocols inMolecular Biology)16.12)。或者，谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸磺基肟共扩增载体，诸如pEE14(HindIII、XbaI、SmaI、SbaI、EcoRI、和BclI克隆位点，其中载体表达谷氨酰胺合成酶和克隆基因；Celltech)。在另一个实施方案中，可使用在Epstein Barr病毒(EBV)控制下指导游离体基因表达的载体，诸如pREP4(BamHI、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII、和KpnI克隆位点，组成性劳氏肉瘤病毒长末端重复片段(RSV-LTR)启动子、潮霉素选择标记；Invitrogen)、pCEP4(BamHI、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII、和KpnI克隆位点，组成性人巨细胞病毒(hCMV)立即早期基因、潮霉素选择标记；Invitrogen)、pMEP4(KpnI、PvuI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI、和BamHI克隆位点，可诱导的金属硫蛋白IIa基因启动子、潮霉素选择标记；Invitrogen)、pREP8(BamHI、XhoI、NotI、HindIII、NheI、和KpnI克隆位点，RSV-LTR启动子、组氨醇选择标记；Invitrogen)、pREP9(KpnI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI、和BamHI克隆位点，RSV-LTR启动子、G418选择标记；Invitrogen)、和pEBVHis(RSV-LTR启动子、潮霉素选择标记、可通过ProBond树脂纯化并用肠激酶切割的N-末端肽；Invitrogen)。用于本发明的可选择哺乳动物表达载体包括pRc/CMV(HindIII、BstXI、NotI、SbaI、和ApaI克隆位点，G418选择；Invitrogen)、pRc/RSV(HindIII、SpeI、BstXI、NotI、和XbaI克隆位点，G418选择；Invitrogen)、等等。本发明使用的牛痘病毒哺乳动物表达载体(参阅Kaufman，1991，同上)包括，但不限于，pSC11(SmaI克隆位点，TK-和β-gal筛选)、pMJ601(SalI、SmaI、AflI、NarI、BspMII、BamHI、ApaI、NheI、SacII、KpnI、和HindIII克隆位点；TK-和β-gal筛选)、和pTKgptF1S(EcoRI、PstI、SalI、AccI、HindIII、SbaI、BamHI和Hpa克隆位点，TK或XPRT选择)。
本发明也可使用酵母表达系统来表达Akt蛋白。例如，非融合型pYES2载体(XbaI、SphI、ShoI、NotI、GstXI、EcoRI、BstXI、BamHI、SacI、KpnI、和HindIII克隆位点；Invitrogen)或融合型pYESHisA、B、C(XbaI、SphI、ShoI、NotI、BstXI、EcoRI、BamHI、SacI、KpnI、和HindIII克隆位点，用ProBond树脂纯化并用肠激酶切割的N-末端肽；Invitrogen)，只提及这两种可用于本发明的载体。
一旦鉴定并分离了特定的重组DNA分子，可使用本领域已知的几种方法进行扩增。一旦建立了合适的宿主系统和生长条件，就可增殖和制备一定量的重组表达载体。如上所述，可用的表达载体包括，但不限于，下列载体或其衍生物人或动物病毒，诸如牛痘病毒或腺病毒；昆虫病毒，诸如杆状病毒；酵母载体；噬菌体载体(如λ)，以及质粒和粘粒DNA载体，这里只提到其中一些。
另外，可选择能够调节插入序列的表达或以预期的特异方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。不同的宿主细胞的蛋白质翻译和翻译后加工及修饰具有其特征性及特异性机制。可选择适当的细胞系或宿主系统以保证所表达外源蛋白质的预期修饰和加工。酵母中的表达可产生生物学活性产物。真核细胞中的表达可提高“自然”折叠的可能性。此外，哺乳动物细胞中的表达可为重建或建立Akt活性提供工具。而且，不同的载体/宿主表达系统可不同程度影响加工反应，诸如蛋白水解切割。
通过本领域已知方法，将载体引入预期宿主细胞中，如转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂转染(溶酶体融合)、基因枪、或DNA载体转移器(参阅如Wu等人，1992，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)267963-967；Wu和Wu，1988，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)26314621-14624；Hartmut等人，加拿大专利申请2,012,311，1990年3月15日提交)。
如上所述，通过收集培养液或溶解包涵体，如用去污剂处理，若需要还可以用超声波法或其它机械方法，可获得可溶形式的蛋白质。使用多种技术可分离溶解的或可溶的蛋白质，诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、等电聚焦、双向凝胶电泳、层析法(如离子交换、亲和、免疫亲和、和大小排阻柱层析)、离心、差异溶解度、免疫沉淀、或用于蛋白质纯化的任何其它标准技术。基因疗法和转基因载体如上所述，本发明涉及Akt蛋白刺激VEGF表达的能力，VEGF是一种诱导血管发生的蛋白质。因此，本发明包括通过对患有局部缺血状况患者施用编码Akt蛋白的核酸而进行的基因疗法。局部缺血状况可包括脑血管缺血、肾缺血、肺缺血、四肢缺血、外周动脉疾病、间歇性跛行、心肌缺血、或者缺血性、特发性、或肥大性心肌病。
适当掺入载体中的Akt编码核酸，以及包含它们的药物组合物，可用于治疗缺血组织。它们可用于在体内在任何类型的缺血组织中转移并表达基因，尤其是心脏。此外，依照待治疗的病理学，可进行靶向治疗(具体而言，就是，可通过选择的载体确定趋向特定组织的转移，并通过选择的特定启动子确定表达)。本发明的核酸或载体可有利的用于在人或动物中，在体内或在细胞内，产生能够刺激VEGF蛋白表达的Akt蛋白。本发明由此有可能特异的、局部的、且有效的治疗局部缺血。
可单独施用编码Akt蛋白的核酸，或者与编码血管发生性因子的核酸联合。已知的血管发生性因子包括碱性和酸性成纤维细胞生长因子(bFGF和aFGF)、FGF-5(美国专利5,661,133)、内皮细胞生长因子(Pu等人，1993，循环(Circulation)88208-2156)、促血管生成素、和VEGF(评论参阅Melillo等人，1997；和Lewis等人，1997)。已鉴定了VEGF的几种形式，包括VEGF121(美国专利5,219,739)、VEGF165(美国专利5,332,672)、VEGF189(美国专利5,240,848)、VEGF206、VEGF-2(WO95/24473和WO96/39515)、VEGF-B(美国专利5,607,918和5,840,693)、和VEGF-D(WO97/12972)。编码Akt蛋白的核酸还可与过渡金属离子联合施用，诸如CoCl2，它显示可增强VEGF基因的表达并刺激血管形成(美国专利5,480,975)。
如上所述，“载体”是用于将本发明核酸转移至宿主细胞的任何工具。优选的载体是病毒载体，诸如逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、和腺伴随病毒。由此，用病毒载体或通过直接引入DNA，体内、离体或体外引入编码Akt蛋白或多肽的基因。通过将转基因载体靶向特异细胞可实现靶组织中的表达，诸如用病毒载体或受体配基，或用组织特异的启动子，或二者结合使用。
通常用于体内靶向和治疗流程的病毒载体是基于DNA的载体和逆转录病毒载体。本领域已知用于构建和使用病毒载体的方法(参阅Miller和Rosman，1992，生物技术(BioTechniques)7980-990)。优选的病毒载体是复制缺陷型的，即它们在靶细胞中不能自主复制。一般而言，本发明范围内使用的复制缺陷型病毒载体基因组缺少至少一个病毒在感染细胞中复制所必需的区域。这些区域可用本领域技术熟练人员已知的任何技术或删除(全部或部分)或使其无功能。这些技术包括完全去除、替代(用其它序列，特别是插入的核酸)、部分删除、或向必需(对复制而言)区添加一个或多个碱基。使用遗传操作技术或通过诱变剂处理，可在体外(在分离DNA上)或原位进行这些技术。优选复制缺陷型病毒保留包装病毒颗粒所必需的基因组序列。
DNA病毒载体包括减毒的或缺陷型DNA病毒，诸如，但不限于，单纯疱疹病毒(HSV)、乳头瘤病毒、Epstein Barr病毒(EBV)、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、牛痘病毒、等等。优选完全或几乎完全缺失病毒基因的缺陷型病毒。缺陷型病毒在引入细胞后无复制能力，因而不会导致可能产生的病毒感染。使用缺陷型病毒载体得以施用于特异、局部区域的细胞，而不用担心该载体会感染其它细胞。因此可特异靶向特殊组织。具体载体的例子包括，但不限于，缺陷型疱疹病毒1(HSV1)载体(Kaplitt等人，1991，分子细胞神经科学(Molec.Cell.Neurosci.)2320-330)、缺失糖蛋白L基因的缺陷型疱疹病毒载体(专利发表物RD371005A)、或其它缺陷型疱疹病毒载体(国际专利发表物WO94/21807，发表于1994年9月29日；国际专利发表物WO92/05263，发表于1994年4月2日)；减毒型腺病毒载体，诸如Stratford-Perricaudet等人描述的载体(1992，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)90626-630；也可参阅La Salle等人，1993，科学(Science)259988-990)；以及缺陷型腺伴随病毒载体(Samulski等人，1987，病毒学杂志(J.Virol.)613096-3101；Samulski等人，1989，病毒学杂志(J.Virol.)633822-3828；Lebkowski等人，1988，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)83988-3996)。
体内施用时，优选将适当的免疫抑制治疗与病毒载体(如腺病毒载体)结合使用，以避免病毒载体和感染细胞的免疫失活。例如，可施用诸如白介素-12(IL-12)、干扰素-γ(IFN-γ)、或抗CD4抗体等免疫抑制细胞因子来阻断对病毒载体的体液或细胞免疫应答(参阅如Wilson，1995，自然医学(Nature Medicine))。另外，采用经改造表达最小数量抗原的病毒载体是有利的。
自然的，本发明涵盖载体的投递，它将表达治疗有效量的Akt用于基因疗法。用于本文的术语“治疗有效量”指足以改善宿主的临床显著局部缺血状况的量。腺病毒载体在优选的实施方案中，载体是腺病毒载体。腺病毒是真核DNA病毒，经修饰后可将本发明的核酸有效投递至多种细胞类型中。存在多种血清型的腺病毒。在本发明范围内，优选使用这些血清型中的2型或5型人腺病毒(Ad2或Ad5)或动物来源的腺病毒(参阅WO94/26914)。可用于本发明范围内的那些动物来源的腺病毒包括犬、牛、鼠(例如May1，Beard等人，1990，病毒学(Virology)7581)、羊、猪、禽、和猿(例如SAV)来源的腺病毒。优选的动物来源腺病毒是犬腺病毒，更优选CAV2腺病毒(如Manhattan或A26/61株(ATCC VR-800))。
优选的本发明复制缺陷型腺病毒载体包含ITR、衣壳化序列、和目的核酸。更优选的是，至少腺病毒的E1区是非功能性的。E1区中的删除优选为Ad5腺病毒序列的第455-3329位核苷酸(PvuII-BglII片段)或第382-3446位核苷酸(HinfII-Sau3A片段)。也可修饰其它区域，特别是E3区(WO95/02697)、E2区(WO94/28938)、E4区(WO94/28152、WO94/12649、和WO95/02697)、或晚期基因L1-L5中的任一个。
在一个优选实施方案中，腺病毒载体在E1区有删除(Ad1.0)。EP185,573中公开了E1-删除的腺病毒的例子，该专利全文引入本文作为参考。在另一个优选实施方案中，腺病毒载体在E1和E4区有删除(Ad3.0)。WO95/02697和WO96/22378(收入本文作为参考)公开了E1/E4-删除的腺病毒的例子。在还有一个优选实施方案中，腺病毒载体在E1区有删除，并在其中插入了E4区和核酸序列(参阅FR94 13355，收入本文作为参考)。
通过本领域技术熟练人员已知的任何技术，可制备本发明复制缺陷型重组腺病毒(Levero等人，1991，基因(Gene)101195；EP185 573；Graham，1984，欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)32917)。具体而言，可通过腺病毒与其中携带目的DNA序列的质粒之间的同源重组进行制备。在腺病毒与质粒共转染进入适当细胞系后进行同源重组。采用的细胞系应优选(i)是所述元件可转化的，且(ii)包含能与复制缺陷型腺病毒部分基因组互补的序列，它优选以整合形式存在于细胞系中，从而避免发生重组的风险。如专利申请WO94/26914和WO95/02697所述，可用的细胞系例子是人胚胎肾细胞系293(Graham等人，1997，普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)3659)，它包含整合在其基因组中的Ad5腺病毒左手部分基因组(12％)，和能弥补E1和E4功能的细胞系。使用本领域普通技术人员众所周知的标准分子生物学技术回收并纯化重组腺病毒。腺伴随病毒载体腺伴随病毒(AAV)是相对较小的DNA病毒，它们能以稳定的定位方式整合到感染细胞的基因组中。它们能感染广谱的细胞而不影响细胞生长、形态、或分化，且它们看上去不涉及人的病理学。AAV基因组已被克隆、测序、并表征。它包含大约4700个碱基，且两末端含有约145个碱基的反向末端重复(ITR)区，作为病毒的复制起点。基因组的剩余部分分成两个具衣壳化功能的基本区基因组的左手部分，含涉及病毒复制和病毒基因表达的rep基因；基因组的右手部分，含编码病毒衣壳蛋白的cap基因。
已描述了来自AAV的载体用于在体外和在体内转移基因的应用(参阅WO91/18088；WO93/09239；US4,797,368、US5,139,941、EP488 528)。这些发表物描述了多种AAV衍生的构建物，其中rep和/或cap基因被删除并由目的基因取代，和这些构建物在体外(进入培养细胞)或在体内(直接进入生物体)用于转移所述目的基因的应用。通过将含目的核酸序列且该序列侧翼有两AAV反向末端重复(ITR)区的质粒与携带AAV衣壳化基因(rep和cap基因)的质粒共转染到感染了人辅助病毒(例如腺病毒)的细胞系中，可制备本发明复制缺陷型重组AAV。然后通过标准技术纯化产生的AAV重组体。
因此，本发明还涉及AAV衍生的重组病毒，其基因组包含编码Akt3且侧翼为AAV ITR的核酸序列。本发明还涉及包含编码Akt3且侧翼为两AAV ITR的核酸序列的质粒。这些质粒可用于转移核酸序列，在适当的情况中，可将质粒掺入脂质体载体(假病毒)。逆转录病毒载体在另一个实施方案中，可将基因引入逆转录病毒载体中，例如参阅Anderson等人，美国专利5,399,346；Mann等人，1983，细胞(Cell)33153；Temin等人，美国专利4,650,764；Temin等人，美国专利4,980,289；Markowitz等人，1988，病毒学杂志(J.Virol.)621120；Temin等人，美国专利5,124,263；EP453242，EP178220；Bernstein等人，1985，遗传工程学(Genet.Eng.)7235；McCormick，1985，生物技术(BioTechnlogy)3689；国际专利发表物WO95/07358，Dougherty等人于1995年3月16日发表；和Kuo等人，1993，血液学(Blood)82845。逆转录病毒是感染分裂细胞的整合病毒。逆转录病毒基因组包含两个LTR、一个衣壳化序列、和三个编码区(gag、pol、和env)。在重组逆转录病毒载体中，gag、pol、和env基因通常全部或部分删除，并以异源目的核酸序列取代。可由不同类型的逆转录病毒构建这些载体，诸如HIV、MoMuLV(“鼠莫罗尼白血病病毒”)、MSV(“鼠莫罗尼肉瘤病毒”)、HaSV(“Harvey肉瘤病毒”)、SNV(”脾脏坏死病毒”)、RSV(“劳氏肉瘤病毒”)、和弗兰德病毒(Friendvirus)。WO95/02697公开了缺陷型逆转录病毒载体。
一般而言，为了构建含核酸序列的重组逆转录病毒，首先构建含LTR、衣壳