专利名称：一种多肽——人蛋白激酶35和编码这种多肽的多核苷酸的制作方法 自真核生物中鉴别的一类最大的已知蛋白超家族由蛋白激酶组成(这儿使用超家族以区别于较小 较为密切相关通常已被归为一个家族的亚型)，该家族成员都有一段保守的催化核心，蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶以及蛋白酪氨酸激酶的保守催化核心相同。这些酶利用ATP(或GTP)的γ-磷酸酯以生成磷酸单酯，并把蛋白(丝氨酸及苏氨酸上)的乙醇基团与/或蛋白(酪氨酸上)的酚基作为磷酸酯受体。真核生物蛋白激酶可分为四大类1)ACG类，包括环核苷酸依赖家族(PKA与PKG)，蛋白激酶C(PKC)家族，β-肾上腺素能受体激酶(βARK)家族，核糖体S6激酶家族及其他密切相关的；2)CaMK类，包括由钙/钙调蛋白调控的蛋白激酶家族，Snfl/AMPK家族，及其他密切相关的；3)CMGC类，包括细胞周期蛋白依赖激酶，Erk(MAP)激酶家族，糖原合成酶3(GSK3)家族，酪蛋白激酶II家族，Clk(类似Cdk的激酶)家族，及其他密切相关的；4)‘保守的’蛋白酪氨酸激酶(PTK)类。该超家族又可分为两个主要的亚门蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶以及蛋白酪氨酸激酶。真核生物蛋白激酶的激酶功能域传递催化活性。蛋白激酶因其同源激酶功能域(亦被称为催化功能域)而相关，该区域有250-300个氨基酸残基。激酶功能域的作用可分为三类1)结合并定向作为具有二价阳离子(通常是Mg2+或Mn2+)复合物的ATP(或GTP)磷酸酯供体；2)结合并定向蛋白(或肽)底物；以及3)转移ATP(或GTP)的γ-磷酸酯至蛋白底物的受体羟基残基(丝氨酸，苏氨酸，或酪氨酸)。激酶功能域被进一步分为12个更小的亚功能域，并定义为从未被大的氨基酸插入打断并含有保守残基特征序列模式的区域。有十二个功能域残基因在超家族中被视为是恒定不变的，而明显意味其在酶功能中具有重要作用，它们是亚功能域I中的甘氨酸50及甘氨酸52，亚功能域II中的赖氨酸72，亚功能域III中的谷氨酸91，亚功能域VIB中的天冬酰胺171及天冬氨酸166，亚功能域VII中的天冬氨酸184及甘氨酸186，亚功能域VIII中的谷氨酸208，亚功能域IX中的天冬氨酸220及甘氨酸225，亚功能域XI中的精氨酸280。在亚功能域VIB，VIII，及IX中发现的氨基酸残基特征序列模式在不同蛋白激酶家族的各成员中尤为高度保守。激酶功能域的同源性意味着它们都折叠成拓扑结构相似的3维核心结构并根据一个普遍的机制传递磷酸转移。蛋白激酶催化核心结构的一般拓扑结构可以PKA-Cα类蛋白激酶为代表。PKA-Cα类蛋白激酶的激酶功能域折叠成两部分结构。较小的一部分，NH2-端部分，含有亚结构域I-IV，主要参与核苷酸固定兼定向。这一部分具有显著反向平行的β-片层结构，这在核苷酸结合的蛋白质中是较为独特的。较大的COOH-端部分，含有亚结构域VIA-XI，主要对结合肽底物及启动磷酸转移起作用，其内含物是显著的α-螺旋。亚结构域V残基有两片。两片中间较深的裂缝作为催化位点被识别。另外四种真核蛋白激酶超家族成员-细胞周期蛋白依赖的激酶2(Cdk2)，p42MAP激酶(Erk2)，颤动激酶，以及酪蛋白激酶I的激酶功能域被发现折叠成两部分结构，拓扑结构上与PKA-Cα催化核心极为相似。然而，在Cdk2及Erk2结构中的亚结构域VIII对应的区域中发现了显著差异，说明这些是非活性状态的酶结构。颤动结构也属于非活性酶，但它是因位于激酶功能域的COOH-端侧的自身抑制肽序列的存在而失活，并向背面折叠到两片之间的活性位点的裂缝中去。这条肽链迫使两个片层几乎朝对方旋转30°，在这一构像中，失活的颤动与无PKI的PKA-Cα的开放构像更为相似。在颤动及Cdk2中亚功能域III中的α-螺旋C均采用一种不同于PKA-Cα中螺旋C的位置。本模板是从蛋白激酶的催化区域的十二个亚功能域中选择了两段构建特征序列模式，第一个区域位于催化域的N-端，亚功能域I，是一段富含甘氨酸的序列，在涉及ATP结合的赖氨酸残基附近。它含有一共有序列的基序Gly-x-G1y-x-x-Gly-x-Val，激酶功能域NH2-端结合位点在基序中第一个甘氨酸上游的第七个位置，该位置上通常可找到疏水性残基。亚功能域I残基折叠成β-链-转角-β-链结构围绕β-链1与2，这一结构作为可弯曲的片层或夹子覆盖并定位ATP不可转移的磷酸酯而作用。丝氨酸53，苯丙氨酸54，以及甘氨酸55的主链酰胺与ATPβ-磷酸氧形成氢键。亮氨酸49及缬氨酸57形成疏水袋，它把ATP的腺嘌呤环围住。第二个区域位于催化域的中心，含有一保守的天冬氨酸残基，对于酶的催化活性极为重要，即亚功能域VI。亚功能域VIA折叠成大的疏水性α-螺旋E，延伸穿过功能域两部分中大的部分。螺旋E中没有残基直接与MgATP或肽底物作用；因而这部分分子主要作为支撑结构来作用。亚功能域VIB折叠成带间插环的小的疏水性β-链6与7。其中包括两个不变的残基(在PKA-Cα中为天冬氨酸166及天冬酰胺171)，它们位于相同的基序组氨酸-精氨酸-天冬氨酸-亮氨酸-赖氨酸-X-X-天冬酰胺之中(HRDLKxxN)。间插环被认为是催化环，因为环中的天冬氨酸166作为催化基质出现，接受磷酸转移机制过程中底物的羟基基团中的质子。环中的赖氨酸168(在保守的蛋白酪氨酸激酶中由精氨酸取代)可能有助于通过中合转移过程中的γ-磷酸酯负离子便于磷酸转移。天冬酰胺171的侧链通过与天冬氨酸的主链羰基形成氢键有助于稳固催化环，它还螯合桥连ATP的α-及γ-磷酸酯的次级Mg2+离子。谷氨酸170的羰基与一个ATP核糖体羟基基团形成氢键。谷氨酸170还通过与肽识别共有序列的第二个精氨酸形成离子对而参与结合底物。由于如上所述蛋白激酶35蛋白在机体重要功能中起重要作用，而且相信这些调节过程中涉及大量的蛋白，因而本领域中一直需要鉴定更多参与这些过程的蛋白激酶35蛋白，特别是鉴定这种蛋白的氨基酸序列。新蛋白激酶35蛋白编码基因的分离也为研究确定该蛋白在健康和疾病状态下的作用提供了基础。这种蛋白可能构成开发疾病诊断和/或治疗药的基础，因此分离其编码DNA是非常重要的。
本发明的一个目的是提供分离的新的多肽——人蛋白激酶35以及其片段、类似物和衍生物。本发明的另一个目的是提供编码该多肽的多核苷酸。
本发明的另一个目的是提供含有编码人蛋白激酶35的多核苷酸的重组载体。
本发明的另一个目的是提供含有编码人蛋白激酶35的多核苷酸的基因工程化宿主细胞。
本发明的另一个目的是提供生产人蛋白激酶35的方法。
本发明的另一个目的是提供针对本发明的多肽——人蛋白激酶35的抗体。
本发明涉及一种分离的多肽，该多肽是人源的，它包含具有<210>2氨基酸序列的多肽、或其保守性变体、生物活性片段或衍生物。较佳地，该多肽是具有<210>2氨基酸序列的多肽。
本发明另外涉及一种含有本发明多核苷酸的载体，特别是表达载体；一种用该载体遗传工程化的宿主细胞，包括转化、转导或转染的宿主细胞；一种包括培养所述宿主细胞和回收表达产物的制备本发明多肽的方法。
本发明还涉及一种能与本发明多肽特异性结合的抗体。
本发明还涉及一种筛选的模拟、激活、拮抗或抑制人蛋白激酶35蛋白活性的化合物的方法，其包括利用本发明的多肽。本发明还涉及用该方法获得的化合物。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
本发明提供了一种多肽——人蛋白激酶35，其基本上是由<210>2所示的氨基酸序列组成的。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括人蛋白激酶35的片段、衍生物和类似物。如本发明所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的人蛋白激酶35相同的生物学功能或活性的多肽。本发明多肽的片段、衍生物或类似物可以是(I)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；或者(II)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代包含取代基；或者(III)这样一种，其中成熟多肽与另一种化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或者(IV)这样一种，其中附加的氨基酸序列融合进成熟多肽而形成的多肽序列(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)通过本文的阐述，这样的片段、衍生物和类似物被认为在本领域技术人员的知识范围之内。
本发明提供了分离的核酸(多核苷酸)，基本由编码具有<210>2氨基酸序列的多肽的多核苷酸组成。本发明的多核苷酸序列包括<210>1的核苷酸序列。本发明的多核苷酸是从人胎脑组织的cDNA文库中发现的。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与<210>1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本发明所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有<210>2的蛋白质或多肽，但与<210>1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码<210>2的成熟多肽的多核苷酸包括只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”是指包括编码此多肽的多核苷酸和包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述描述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片断、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的多核苷酸(两个序列之间具有至少50％，优选具有70％的相同性)。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加用变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与<210>2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的核酸片段。如本发明所用，”核酸片段”的长度至少含10个核苷酸，较好是至少20-30个核苷酸，更好是至少50-60个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段也可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码人蛋白激酶35的多核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的编码人蛋白激酶35的特异的多核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离多核苷酸。这些技术包括但不局限于1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源的多核苷酸序列，和2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的多核苷酸片段。
本发明的DNA片段序列也能用下列方法获得1)从基因组DNA分离双链DNA序列；2)化学合成DNA序列以获得所述多肽的双链DNA。
上述提到的方法中，分离基因组DNA最不常用。DNA序列的直接化学合成是经常选用的方法。更经常选用的方法是cDNA序列的分离。分离感兴趣的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录，形成质粒或噬菌体cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术，试剂盒也可从商业途径获得(Qiagene)。而构建cDNA文库也是通常的方法(Sambrook，et a1.，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。还可得到商业供应的cDNA文库，如Clontech公司的不同cDNA文库。当结合使用聚合酶反应技术时，即使极少的表达产物也能克隆。
可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的基因。这些方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(2)标志基因功能的出现或丧失；(3)测定人蛋白激酶35的转录本的水平；(4)通过免疫学技术或测定生物学活性，来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用，也可多种方法联合应用。
在第(1)种方法中，杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分同源，其长度至少10个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸。此外，探针的长度通常在2000个核苷酸之内，较佳的为1000个核苷酸之内。此处所用的探针通常是在本发明的基因序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用作探针。DNA探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。
在第(4)种方法中，检测人蛋白激酶35基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如Western印迹法，放射免疫沉淀法，酶联免疫吸附法(ELISA)等。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的多核苷酸序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本发明的基因，或者各种DNA片段等的多核苷酸序列可用常规方法如双脱氧链终止法(Sanger et al.PNAS，1977，745463-5467)测定。这类多核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列，测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或直接用人蛋白激酶35编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
本发明中，编码人蛋白激酶35的多核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有本发明所述多核苷酸的重组载体。术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含编码人蛋白激酶35的DNA序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA表达的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体/转录调控元件(如启动子、增强子等)和选择性标记基因。
本发明中，编码人蛋白激酶35的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该多核苷酸或重组载体的基因工程化宿主细胞。术语“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等。
用本发明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，或者常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
通过常规的重组DNA技术，利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的人蛋白激酶35(Science，1984；2241431)。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码人人蛋白激酶35的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
在步骤(2)中，根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在步骤(3)中，重组多肽可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法包括但并不限于常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的多肽以及该多肽的拮抗剂、激动剂和抑制剂可直接用于疾病治疗，例如，可治疗恶性肿瘤、肾上腺缺乏症、皮肤病、各类炎症、HIV感染和免疫性疾病等。
真核生物中由蛋白激酶组成一类最大的已知蛋白超家族，该家族成员都有一段保守的催化核心，蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶以及蛋白酪氨酸激酶的保守催化核心相同。该超家族又可分为两个主要的亚门蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶以及蛋白酪氨酸激酶。本模板是从蛋白激酶的催化区域的十二个亚功能域中选择了两段构建特征序列模式，第一个区域位于催化域的N-端，亚功能域I，是一段富含甘氨酸的序列，在涉及ATP结合的赖氨酸残基附近。第二个区域位于催化域的中心，含有一保守的天冬氨酸残基，对于酶的催化活性极为重要，即亚功能域VI。
由于胰岛素受体、类胰岛素生长因子受体、肝细胞生长因子受体、神经生长因子受体、巨嗜细胞集落刺激因子受体、表皮生长因子受体、血小板生长因子受体、血管内皮生长因子受体均属酪氨酸蛋白激酶活性的受体，具有极重要的生理功能。丝氨酸/苏氨酸激酶受体的TGF-β效应是通过抑制其它生长因子的效应来抑制细胞增殖、刺激细胞外基质的合成、刺激骨髓形成、胚胎发育、趋化反应等。
由此可见，本发明的蛋白激酶35的表达异常将产生各种疾病尤其是内分泌疾病、胚胎发育紊乱、免疫系统疾病、各种肿瘤等，这些疾病包括但不限于内分泌疾病尿崩症，性早熟症，巨人症和肢端肥大症，催乳素过高血症(溢乳-闭经综合症)，垂体性综合征，成人垂体机能减退症(Simmonds-Sheehan综合症)，垂体性侏儒症，垂体瘤(泌乳素瘤)，单纯性甲状腺肿，甲状腺炎，甲状腺功能亢进症，甲状腺功能减退症，甲状旁腺机能亢进症，甲状旁腺机能减退症，肾上腺皮质功能亢进症如皮质醇增多症(Cushing)、原发性醛固酮增多症，肾上腺皮质功能减退症如急性肾上腺皮质功能减退症、慢性肾上腺皮质功能减退症，肾上腺肿瘤，糖尿病，胰岛素瘤，胃泌素瘤，卵巢病经前期紧张症，经绝期综合征，卵巢发育不全，闭经，男性性腺功能减退症，男性性早熟胚胎发育紊乱腭裂、面斜裂、颈囊、颈瘘、肢体缺如、肢体分化障碍、消化管闭锁或狭窄、回肠憩室、脐瘘、先天性脐疝、先天性无神经节性巨结肠、喉气管狭窄或闭锁、气管食管瘘、透明膜病、先天性肺囊肿、肺膨胀不全、多囊肾、异位肾、马碲肾、双输尿管、脐尿瘘、隐 、先天性腹股沟疝、双子宫、阴道闭锁、尿道下裂、两性畸形、房间隔缺损、室间隔缺损、动脉干分隔异常、主动脉或肺动脉狭窄、肺动脉狭窄、动脉导管未闭、神经管缺陷、先天性脑积水、虹膜缺损、先天性白内障、先天性青光眼或白内障免疫系统疾病类风湿性关节炎、慢性活动性肝炎、急性前葡萄膜炎、淋球菌感染后关节炎、免疫复合物型肾小球肾炎、淋球菌感染后心肌炎，系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、多发性肌炎、重症肌无力、格林-巴利综合症、自身免疫性溶血性贫血、免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性间质性肾炎、自身免疫性胃炎、自身免疫性甲状腺疾病、吞噬细胞缺乏的免疫缺陷病、补体系统缺陷病，Down综合症，再生障碍性贫血，获得性免疫缺陷综合症，支气管哮喘、阿斯匹林哮喘、变应性鼻炎、过敏性支气管肺曲霉菌病、过敏性肺炎、弥漫性肺间质纤维化、结节病、荨麻疹、特异性皮炎各种肿瘤胃癌、肝癌、肺癌、食管癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、甲状腺肿瘤、子宫肌瘤、成神经细胞瘤、星形细胞瘤、室管膜瘤、胶质细胞瘤、结肠癌、恶性组织细胞病、黑色素瘤、畸胎瘤、肉瘤、肾上腺癌、膀胱癌、骨癌、骨肉瘤、骨髓瘤、骨髓癌、脑癌、子宫癌、子宫内膜癌、胆囊癌、结肠癌、胸腺肿瘤鼻腔及鼻窦肿瘤、鼻咽癌、喉癌、气管肿瘤、胸膜间皮瘤、纤维瘤、纤维肉瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、平滑肌瘤。
本发明的蛋白激酶35的表达异常还将产生某些遗传性，血液性疾病等。
本发明也提供了筛选化合物以鉴定提高(激动剂)或阻遏(拮抗剂)人蛋白激酶35的药剂的方法。激动剂提高人蛋白激酶35刺激细胞增殖等生物功能，而拮抗剂阻止和治疗与细胞过度增殖有关的紊乱如各种癌症。例如，能在药物的存在下，将哺乳动物细胞或表达人蛋白激酶35的膜制剂与标记的人蛋白激酶35一起培养。然后测定药物提高或阻遏此相互作用的能力。
人蛋白激酶35的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失物和类似物等。人蛋白激酶35的拮抗剂可以与人蛋白激酶35结合并消除其功能，或是抑制该多肽的产生，或是与该多肽的活性位点结合使该多肽不能发挥生物学功能。
在筛选作为拮抗剂的化合物时，可以将人蛋白激酶35加入生物分析测定中，通过测定化合物对人蛋白激酶35和其受体之间相互作用的影响来确定化合物是否是拮抗剂。用上述筛选化合物的同样方法，可以筛选出起拮抗剂作用的受体缺失物和类似物。能与人蛋白激酶35结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，一般应对人蛋白激酶35分子进行标记。
本发明提供了用多肽，及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞作为抗原以生产抗体的方法。这些抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。本发明还提供了针对人蛋白激酶35抗原决定簇的抗体。这些抗体包括(但不限于)多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。
多克隆抗体的生产可用人蛋白激酶35直接注射免疫动物(如家兔，小鼠，大鼠等)的方法得到，多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。制备人蛋白激酶35的单克隆抗体的技术包括但不限于杂交瘤技术(Kohler and Milstein.Nature，1975，256495-497)，三瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术，EBV-杂交瘤技术等。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产(Morrison etal，PNAS，1985，816851)。而已有的生产单链抗体的技术(U.S.Pat No.4946778)也可用于生产抗人蛋白激酶35的单链抗体。
抗人蛋白激酶35的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人蛋白激酶35。
与人蛋白激酶35结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。
抗体还可用于设计针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人蛋白激酶35高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭人蛋白激酶35阳性的细胞。
本发明中的抗体可用于治疗或预防与人蛋白激酶35相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断人蛋白激酶35的产生或活性。
本发明还涉及定量和定位检测人蛋白激酶35水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人蛋白激酶35水平，可以用作解释人蛋白激酶35在各种疾病中的重要性和用于诊断人蛋白激酶35起作用的疾病。
本发明的多肽还可用作肽谱分析，例如，多肽可用物理的、化学或酶进行特异性切割，并进行一维或二维或三维的凝胶电泳分析，更好的是进行质谱分析。
编码人蛋白激酶35的多核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于人蛋白激酶35的无表达或异常/无活性表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计用于表达变异的人蛋白激酶35，以抑制内源性的人蛋白激酶35活性。例如，一种变异的人蛋白激酶35可以是缩短的、缺失了信号传导功能域的人蛋白激酶35，虽可与下游的底物结合，但缺乏信号传导活性。因此重组的基因治疗载体可用于治疗人蛋白激酶35表达或活性异常所致的疾病。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将编码人蛋白激酶35的多核苷酸转移至细胞内。构建携带编码人蛋白激酶35的多核苷酸的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.)。另外重组编码人蛋白激酶35的多核苷酸可包装到脂质体中转移至细胞内。
多核苷酸导入组织或细胞内的方法包括将多核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。
抑制人蛋白激酶35 mRNA的寡核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。
编码人蛋白激酶35的多核苷酸可用于与人蛋白激酶35的相关疾病的诊断。编码人蛋白激酶35的多核苷酸可用于检测人蛋白激酶35的表达与否或在疾病状态下人蛋白激酶35的异常表达。如编码人蛋白激酶35的DNA序列可用于对活检标本进行杂交以判断人蛋白激酶35的表达状况。杂交技术包括Southem印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用人蛋白激酶35特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测人蛋白激酶35的转录产物。
检测人蛋白激酶35基因的突变也可用于诊断人蛋白激酶35相关的疾病。人蛋白激酶35突变的形式包括与正常野生型人蛋白激酶35 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。该序列会特异性地针对某条人染色体具体位置且并可以与其杂交。目前，需要鉴定染色体上的各基因的具体位点。现在，只有很少的基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标记物可用于标记染色体位置。根据本发明，为了将这些序列与疾病相关基因相关联，其重要的第一步就是将这些DNA序列定位于染色体上。
简而言之，根据cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
体细胞杂合细胞的PCR定位法，是将DNA定位到具体染色体的快捷方法。使用本发明的寡核苷酸引物，通过类似方法，可利用一组来自特定染色体的片段或大量基因组克隆而实现亚定位。可用于染色体定位的其它类似策略包括原位杂交、用标记的流式分选的染色体预筛选和杂交预选，从而构建染色体特异的cDNA库。
将cDNA克隆与中期染色体进行荧光原位杂交(FISH)，可以在一个步骤中精确地进行染色体定位。此技术的综述，参见Verma等，Human Chromosomesa Manual ofBasic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritance inMan(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。
接着，需要测定患病和未患病个体间的cDNA或基因组序列差异。如果在一些或所有的患病个体中观察到某突变，而该突变在任何正常个体中未观察到，则该突变可能是疾病的病因。比较患病和未患病个体，通常涉及首先寻找染色体中结构的变化，如从染色体水平可见的或用基于cDNA序列的PCR可检测的缺失或易位。根据目前的物理作图和基因定位技术的分辨能力，被精确定位至与疾病有关的染色体区域的cDNA，可以是50至500个潜在致病基因间之一种(假定1兆碱基作图分辨能力和每20kb对应于一个基因)。
可以将本发明的多肽、多核苷酸及其模拟物、激动剂、拮抗剂和抑制剂与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。
本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒，容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起，可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示，该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外，本发明的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用。
药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。人蛋白激酶35以有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的人蛋白激酶35的量和剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。


下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1是本发明蛋白激酶35在142-196共54个氨基酸和结构域蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶以及蛋白酪氨酸激酶的氨基酸序列同源性比较图。上方序列是蛋白激酶35，下方序列是结构域蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶以及蛋白酪氨酸激酶。相同氨基酸在两个序列间用单字符氨基酸表示，相似氨基酸用“+”表示。
图2为分离的人蛋白激酶35的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)。35kDa为蛋白质的分子量。箭头所指为分离出的蛋白条带。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人蛋白激酶35的克隆用异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎脑总RNA。用Quik mRNA Isolation Kit(Qiegene公司产品)从总RNA中分离poly(A)mRNA。2ug poly(A)mRNA经逆转录形成cDNA。用Smart cDNA克隆试剂盒(购自Clontech)将cDNA片段定向插入到pBSK(+)载体(Clontech公司产品)的多克隆位点上，转化DH5α，细菌形成cDNA文库。用Dye terminate cycle reaction sequencing kit(Perkin-Elmer公司产品)和ABI 377自动测序仪(Perkin-Elmer公司)测定所有克隆的5′和3′末端的序列。将测定的cDNA序列与已有的公共DNA序列数据库(Genebank)进行比较，结果发现其中一个克隆0286G05的cDNA序列为新的DNA。通过合成一系列引物对该克隆所含的插入cDNA片段进行双向测定。结果表明，0286G05克隆所含的全长cDNA为1823bp(如<210>1所示)，从第179bp至1147bp有一个969bp的开放阅读框架(ORF)，编码一个新的蛋白质(如<210>2所示)。我们将此克隆命名为pBS-0286G05，编码的蛋白质命名为人蛋白激酶35。
实施例2cDNA克隆的同源检索将本发明的人蛋白激酶35的序列及其编码的蛋白序列，用Blast程序(Basiclocal Alignment search tool)[Altschul，SF et al.J.Mol.Biol.1990；215403-10]，在Genbank、Swissport等数据库进行同源检索。本发明的蛋白激酶35在142-196与结构域蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶以及蛋白酪氨酸激酶有同源，同源结果示于图1，同源率为20％，得分为10.85；阈值为10.21。
实施例3用RT-PCR方法克隆编码人蛋白激酶35的基因用胎脑细胞总RNA为模板，以oligo-dT为引物进行逆转录反应合成cDNA，用Qiagene的试剂盒纯化后，用下列引物进行PCR扩增Primer15’-GGAGGGTTCGAATTGCAACGGCAG-3’Primer25’-CAAAGTGTCCTTTATTCTTTATCA-3’Primer1为位于<210>1的5’端的第1bp开始的正向序列；Primer2为<210>1的中的3’端反向序列。
扩增反应的条件在50μl的反应体积中含有50mmol/L KCl，10mmol/LTris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司产品)。在PE9600型DNA热循环仪(Perkin-Elmer公司)上按下列条件反应25个周期94C 30sec；55C 30sec；72℃ 2min。在RT-PCR时同时设β-actin为阳性对照和模板空白为阴性对照。扩增产物用QIAGEN公司的试剂盒纯化，用TA克隆试剂盒连接到pCR载体上(Invitrogen公司产品)。DNA序列分析结果表明PCR产物的DNA序列与<210>1所示的1-1823bp完全相同。
实施例4Northern印迹法分析人蛋白激酶35基因的表达用一步法提取总RNA[Anal.Biochem 1987，162，156-159]。该法包括酸性硫氰酸胍苯酚-氯仿抽提。即用4M异硫氰酸胍-2 5mM柠檬酸钠，0.2M乙酸钠(pH4.0)对组织进行匀浆，加入1倍体积的苯酚和1/5体积的氯仿-异戊醇(49∶1)，混合后离心。吸出水相层，加入异丙醇(0.8体积)并将混合物离心得到RNA沉淀。将得到的RNA沉淀用70％乙醇洗涤，干燥并溶于水中。用20μg RNA，在含20mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸钠-1mM EDTA-2.2M甲醛的1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳。然后转移至硝酸纤维素膜上。用α-32P dATP通过随机引物法制备32P-标记的DNA探针。所用的DNA探针为图1所示的PCR扩增的人蛋白激酶35编码区序列(14bp至970bp)。将32P-标记的探针(约2×106cpm/ml)与转移了RNA的硝酸纤维素膜在一溶液中于42℃杂交过夜，该溶液包含50％甲酰胺-25mM KH2PO4(pH7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鲑精DNA。杂交之后，将滤膜在1×SSC-0.1％SDS中于55℃洗30min。然后，用Phosphor Imager进行分析和定量。
实施例5重组人蛋白激酶35的体外表达、分离和纯化根据<210>1和图1所示的编码区序列，设计出一对特异性扩增引物，序列如下Primer35’-CATGCTAGCATGGAAGGGATCAGTAATTTCAAGAC-3’Primer45’-CATGGATCCCTAGACATCTGTTTCCAGAGCTTCAA-3’此两段引物的5’端分别含有NheI和BamHI酶切位点，其后分别为目的基因5’端和3’端的编码序列，NheI和BamHI酶切位点相应于表达载体质粒pET-28b(+)(Novagen公司产品，Cat.No.69865.3)上的选择性内切酶位点。以含有全长目的基因的pBS-0286G05质粒为模板，进行PCR反应。PCR反应条件为总体积50μl中含pBS-0286G05质粒10pg、引物Primer-3和Primer-4分别为10pmol、Advantage polymerase Mix(Clontech公司产品)1μl。循环参数94℃ 20s，60C30s，68℃ 2min，共25个循环。用NheI和BamHI分别对扩增产物和质粒pET-28(+)进行双酶切，分别回收大片段，并用T4连接酶连接。连接产物转化用氯化钙法大肠杆细菌DH5α，在含卡那霉素(终浓度30μg/ml)的LB平板培养过夜后，用菌落PCR方法筛选阳性克隆，并进行测序。挑选序列正确的阳性克隆(pET-0286G05)用氯化钙法将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plySs(Novagen公司产品)。在含卡那霉素(终浓度30μg/ml)的LB液体培养基中，宿主菌BL21(pET-0286G05)在37℃培养至对数生长期，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续培养5小时。离心收集菌体，经超声波破菌，离心收集上清，用能与6个组氨酸(6His-Tag)结合的亲和层析柱His.Bind Quick Cartridge(Novagen公司产品)进行层析，得到了纯化的目的蛋白人蛋白激酶35。经SDS-PAGE电泳，在35kDa处得到一单一的条带(图2)。将该条带转移至PVDF膜上用Edams水解法进行N-端氨基酸序列分析，结果N-端15个氨基酸与<210>2所示的N-端15个氨基酸残基完全相同。
实施例6抗人蛋白激酶35抗体的产生用多肽合成仪(PE公司产品)合成下述人蛋白激酶35特异性的多肽NH2-Met-Glu-Gly-Ile-Ser-Asn-Phe-Lys-Thr-Pro-Ser-Lys-Leu-Ser-Glu-COOH将该多肽分别与血蓝蛋白和牛血清白蛋白耦合形成复合，方法参见AVrameas，et al.Immunochemistry，1969；643。用4mg上述血蓝蛋白多肽复合物加上完全弗氏佐剂免疫家兔，15天后再用血蓝蛋白多肽复合物加不完全弗氏佐剂加强免疫一次。采用经15μg/ml牛血清白蛋白多肽复合物包被的滴定板做ELISA测定兔血清中抗体的滴度。用蛋白A-Sepharose从抗体阳性的家兔血清中分离总IgG。将多肽结合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用亲和层析法从总IgG中分离抗多肽抗体。免疫沉淀法证明纯化的抗体可特异性地与人蛋白激酶35结合。
序列表<110>上海博德基因开发有限公司<120>一种多肽--人蛋白激酶35和编码这种多肽的多核苷酸<130>0286G05<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1823<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(179)..(1147)<223>
<400>1ggagggttcg aattgcaacg gcagctaccg ggcgtatgtg ttggtgctag aggcagctgc60agggtctcgc tgggggccgc tcgggaccaa ttttgaagag gtacttggcc acgacttatt120ttcacctccg acctttcctt ccaggcggtg agactctgga ctgagagtgg ctttcaca 178atg gaa ggg atc agt aat ttc aag aca cca agc aaa tta tca gaa aaa 226Met Glu Gly Ile Ser Asn Phe Lys Thr Pro Ser Lys Leu Ser Glu Lys1 5 10 15aag aaa tct gta tta tgt tca act cea act ata aat atc ccg gcc tct 274Lys Lys Ser Val Leu Cys Ser Thr Pro Thr Ile Asn Ile Pro Ala Ser20 25 30ccg att atg cag aag ctt ggc ttt ggt act ggg gta aat gtg tac cta 322Pro Ile Met Gln Lys Leu Gly Phe Gly Thr Gly Val Asn Val Tyr Leu35 40 45atg aaa aga tct cca aga ggt ttg tct cat tct cct tgg gct gta aaa 370Met Lys Arg Ser Pro Arg Gly Leu Ser His Ser Pro Trp Ala Val Lys50 55 60aag att aat cct ata tgt aat gat cat tat cga agt gtg tat caa aag 418Lys Ile Asn Pro Ile Cys Asn Asp His Tyr Arg Ser Val Tyr Gln Lys
65 70 75 80aga cta atg gat gaa gct aag att ttg aaa agc ctt cat cat cca aac 466Arg Leu Met Asp Glu Ala Lys Ile Leu Lys Ser Leu His His Pro Asn85 90 95att gtt ggt tat cgt gct ttt act gaa gcc agt gat ggc agt ctg tgt 514Ile Val Gly Tyr Arg Ala Phe Thr Glu Ala Ser Asp Gly Ser Leu Cys100 105 110ctt gct atg gaa tat gga ggt gaa aag tct cta aat gac tta ata gaa 562Leu Ala Met Glu Tyr Gly Gly Glu Lys Ser Leu Asn Asp Leu Ile Glu115 120 125gaa cga tat aaa gcc agc caa gat cct ttt cca gca gcc ata att tta 610Glu Arg Tyr Lys Ala Ser Gln Asp Pro Phe Pro Ala Ala Ile Ile Leu130 135 140aaa gtt gct ttg aat atg gca aga ggg tta aag tat ctg cac caa gaa 658Lys Val Ala Leu Asn Met Ala Arg Gly Leu Lys Tyr Leu His Gin Glu145 150 155 160aag aaa ctg ctt cat gga gac ata aag tct tca aat gtt gta att aaa 706Lys Lys Leu Leu His Gly Asp Ile Lys Ser Ser Asn Val Val Ile Lys165 170 175ggc gat ttt gaa aca att aaa atc tgt gat gta gga gtc tct cta cca 754Gly Asp Phe Glu Thr Ile Lys Ile Cys Asp Val Gly Val Ser Leu Pro180 185 190ctg gat gaa aat atg act gtg act gac cct gag gct tgt tac att ggc 802Leu Asp Glu Asn Met Thr Val Thr Asp Pro Glu Ala Cys Tyr Ile Gly195 200 205aca gag cca tgg aaa ccc aaa gaa gct gtg gag gag aat ggt gtt att 850Thr Glu Pro Trp Lys Pro Lys Glu Ala Val Glu Glu Asn Gly Val Ile210 215 220act gac aag gca gac ata ttt gcc ttt ggc ctt act ttg tgg gaa atg 898Thr Asp Lys Ala Asp Ile Phe Ala Phe Gly Leu Thr Leu Trp Glu Met225 230 235 240
atg act tta tcg att cca cae att aat ctt tca aat gat gat gat gat 946Met Thr Leu Ser Ile Pro His Ile Asn Leu Set Asn Asp Asp Asp Asp245 250 255gaa gat aaa act ttt gat gaa agt gat ttt gat gat gaa gca tac tat 994Glu Asp Lys Thr Phe Asp Glu Ser Asp Phe Asp Asp Glu Ala Tyr Tyr260 265 270gca gcc ttg gga act agg cca cct att aat atg gaa gaa ctg gat gaa 1042Ala Ala Leu Gly Thr Arg Pro Pro Ile Asn Met Glu Glu Leu Asp Glu275 280 285tca tac cag aaa gta att gaa ctc ttc tct gta tgc act aat gaa gac 1090Ser Tyr Gln Lys Val Ile Glu Leu Phe Ser Val Cys Thr Asn Glu Asp290 295 300cct aaa gat cgt cct tct gct gca cac att gtt gaa gct ctg gaa aca 1138Pro Lys Asp Arg Pro Set Ala Ala His Ile Val Glu Ala Leu Glu Thr305 310 315 320gat gtc tag tgatcatctc agctgaagtg tggcttgcgt aaataactgt 1187Asp Valttattccaaa atatttacat agttactatc agtagttatt agactctaaa attggcatat 1247ttcaggacca tagtttcttg ttaacatatg gataactatt tctaatatga aatatgctta 1307tattggctat aagcacttgg aattgtactg ggttttctgt aaagttttag aaactagcta 1367cataagtact ttgatactgc tcatgctgac ttaaaacact agcagtaaaa cgctgtaaac 1427tgtaccatta aattgaatgc cattactttt attaatgatc tttcttaaat attctatatt 1487ttaatggatc tactgacatt agcactttgt acagtacaaa ataaagtcta catttgttta 1547aaacactgaa ccttttgctg atgtgtttat caaatgataa ctggaagctg aggagaatat 1607gcctcaaaaa gagtagctcc ttggatactt cagactctgg ttacagattg tcttgatctc 1667ttggatctcc tcagatcttc tttggttttt gctttaattt attaaatgta ttttccatac 1727tgagtttaaa atttattaat ttgtacctta agcatttccc agctgtgtaa aaacaataaa 1787actcaaatag gatgataaag aataaaggac actttg 1823<210>2<211>322<212>PRT
<213>Homo sapiens<400>2Met Glu Gly Ile Ser Asn Phe Lys Thr Pro Ser Lys Leu Ser Glu Lys1 5 10 15Lys Lys Ser Val Leu Cys Ser Thr Pro Thr Ile Asn Ile Pro Ala Ser20 25 30Pro Ile Met Gln Lys Leu Gly Phe Gly Thr Gly Val Asn Val Tyr Leu35 40 45Met Lys Arg Ser Pro Arg Gly Leu Ser His Ser Pro Trp Ala Val Lys50 55 60Lys Ile Asn Pro Ile Cys Asn Asp His Tyr Arg Ser Val Tyr Gln Lys65 70 75 80Arg Leu Met Asp Glu Ala Lys Ile Leu Lys Ser Leu His His Pro Asn85 90 95Ile Val Gly Tyr Arg Ala Phe Thr Glu Ala Ser Asp Gly Ser Leu Cys100 105 110Leu Ala Met Glu Tyr Gly Gly Glu Lys Ser Leu Asn Asp Leu Ile Glu115 120 125Glu Arg Tyr Lys Ala Ser Gln Asp Pro Phe Pro Ala Ala Ile Ile Leu130 135 140Lys Val Ala Leu Asn Met Ala Arg Gly Leu Lys Tyr Leu His Gln Glu145 150 155 160Lys Lys Leu Leu His Gly Asp Ile Lys Ser Ser Asn Val Val Ile Lys165 170 175Gly Asp Phe Glu Thr Ile Lys Ile Cys Asp Val Gly Val Ser Leu Pro180 185 190Leu Asp Glu Asn Met Thr Val Thr Asp Pro Glu Ala Cys Tyr Ile Gly195 200 205Thr Glu Pro Trp Lys Pro Lys Glu Ala Val Glu Glu Asn Gly Val Ile210 215 220Thr Asp Lys Ala Asp Ile Phe Ala Phe Gly Leu Thr Leu Trp Glu Met225 230 235 240
Met Thr Leu Ser Ile Pro His Ile Asn Leu Ser Asn Asp Asp Asp Asp245 250 255Glu Asp Lys Thr Phe Asp Glu Ser Asp Phe Asp Asp Glu Ala Tyr Tyr260 265 270Ala Ala Leu Gly Thr Arg Pro Pro Ile Asn Met Glu Glu Leu Asp Glu275 280 285Ser Tyr Gln Lys Val Ile Glu Leu Phe Ser Val Cys Thr Asn Glu Asp290 295 300Pro Lys Asp Arg Pro Ser Ala Ala His Ile Val Glu Ala Leu Glu Thr305 310 315 320Asp Val


本发明公开了一种新的多肽——人蛋白激酶35，编码此多肽的多核苷酸和经DNA重组技术产生这种多肽的方法。本发明还公开了此多肽用于治疗多种疾病的方法，如恶性肿瘤，血液病，HIV感染和免疫性疾病和各类炎症等。本发明还公开了抗此多肽的拮抗剂及其治疗作用。本发明还公开了编码这种新的蛋白激酶35的多核苷酸的用途。