多肽、包含该多肽的检测器件和检测试剂盒的制作方法【技术领域】。[0002]糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)是由遗传和环境因素共同引起的一组以糖代谢紊乱为主要表现的临床综合征。胰岛素缺乏和胰岛素作用障碍单独或同时引起糖类、脂肪、蛋白质、水和电介质等的代谢紊乱，临床以慢性高血糖为主要特征。典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现，即“三多一少”症状。[0003]在欧洲糖尿病学会(EuropeanAssociation forthe Study of Diabetes,EASD) 2011 年会上，国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation, IDF)发布最新数据显示:2011年全世界糖尿病患病人数已达3.66亿，较2010年的2.85亿增加近30%。每年有460万人死于糖尿病，用于糖尿病的医疗费用高达4650亿美元。IDF主席JeanClaudeManbaya教授说:“在2011年，每7秒钟就有I人因糖尿病死亡，警钟正在敲响”。据中国之声2011年11月报道，我国已确诊的糖尿病患者人数高达9240万人，为世界第一。全国20岁以上的成人中，糖尿病发病率高达9.7%。[0004]糖尿病按其病因学分类可分为I型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病及特殊类型糖尿病。[0005]目前医院主要依据临床表现(如I型糖尿病多发于青少年时期，且有典型的“三多一少”症状，依赖于胰岛素等)区分I型和2型糖尿病，对分型不明确的糖尿病患者如成人隐匿性自身免疫性糖尿病(latent autoimmune diabetes in adults, LADA)、及确诊I型糖尿病则需要检测I型糖尿病自身抗体来辅助诊断。`
[0006]本发明的目的在于提供一种对糖尿病、特别是I型糖尿病的诊断有用的多肽、编码该多肽的核酸、包含该核酸的表达载体、导入了该表达载体的宿主细胞、抗该多肽的抗体、包含该多肽的检测器件、包含该多肽或该检测器件的检测试剂盒、以及该多肽在检测I型糖尿病中的用途、该多肽在制备用于检测I型糖尿病的试剂盒或检测器件中的用途。[0007]此外，发明人还发现，本发明的多肽对于结核病的诊断也是有用的。因此，本发明还提供用于检测结核病的多肽、编码该多肽的核酸、包含该核酸的表达载体、导入了该表达载体的宿主细胞、抗该多肽的抗体、包含该多肽的检测器件、包含该多肽或该检测器件的检测试剂盒、以及该多肽在检测结核病中的用途、该多肽在制备用于检测结核病的试剂盒或检测器件中的用途。[0008]即，本发明包含下述技术方案:
[0009]1.由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构成的多肽。
[0010]2.编码权利要求1所述的多肽的核酸。
[0011]3.包含权利要求2所述的核酸的表达载体。[0012]4.导入了权利要求3所述的表达载体的宿主细胞。
[0013]5.一种检测器件，其包括:
[0014]固体载体，以及
[0015]连接于该固体载体上的权利要求1所述的多肽。
[0016]6.根据权利要求5所述的检测器件，其中，所述固体载体是SJ改性硅胶。
[0017]7.一种检测试剂盒，其包括权利要求1所述的多肽、或者权利要求5或6所述的检测器件。
[0018]8.抗权利要求1所述的多肽的抗体。
[0019]9.权利要求1所述的多肽在制备用于检测I型糖尿病和/或结核病的试剂盒或检测器件中的用途。
[0020]将本发明的多肽应用于糖尿病(特别是I型糖尿病)和/或结核病的诊断，能够取得令人满意的效果。



[0021]图1将多肽通过化 学共价固定于SJ改性硅胶表面的示意图。
[0022]图2对化学合成的本发明的多肽进行确认的表征图谱。
[0023]图3对SJ改性硅胶(iPDMS薄膜)的制作过程进行说明的示意图。
[0024]图4对多肽微阵列化学固定过程进行说明的图。
[0025]图5说明多肽微阵列点样模式的示意图。
[0026]图6~8显示对不同血清进行检测的结果的照片。
[0027]发明的
[0028]本发明的多肽
[0029]本发明的多肽是30肽。本发明的30肽由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构成，即:MNGEE QYYAA TQLYK DPCAF QRGPA PEFSA。如实施例所示，其对I型糖尿病病人的血清呈阳性反应，而对健康正常人或非I型糖尿病且非结核病人血清呈阴性反应。因此，该30肽作为I型糖尿病的诊断工具是有用的。此外，发明人还发现，如实施例所示，本发明的30肽对结核病人的血清呈阳性反应。因此，该30肽作为结核病的诊断工具也是有用的。优选地，本发明的30肽可用作结核病并发I型糖尿病的诊断工具。
[0030]本发明的多肽在有市售的情况下，可以使用市售品，此外，还可以适宜采用⑴化学合成方法、或(2)酶反应合成方法等公知方法来获得，其中化学合成更为简便。在化学合成本发明的多肽情况下，通过使用肽合成仪合成或者半合成该多肽来进行。作为化学合成方法，可以列举出例如肽固相合成法等。这样合成的肽可以采用常规手段例如离子交换色谱、反相高效液体色谱、亲和色谱等进行纯化。这样的肽固相合成方法以及其后的肽纯化都是本【技术领域】公知的。
[0031]此外，在通过酶反应生产本发明的多肽的情况下，可以采用例如国际公开小册子W02004/011653号所述的方法。即,可以这样来生产:将一方的氨基酸或二肽的羧基末端被酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、与氨基酸处于游离状态的氨基酸(例如羧基保护的氨基酸)在肽合成酶的存在下进行反应，生成的二肽或三肽。作为肽合成酶，可以列举出:具有生成肽的能力的微生物的培养物、由该培养物分离的微生物菌体、或该微生物的菌体处理物、或该微生物来源的肽合成酶。
[0032]而且，除了上述的酶方法、化学合成方法以外，有些情况下，本发明的多肽还可能是天然存在(但未被分离出来)的。在天然存在的情况下，还可以将其分离出来。
[0033]本发明的核酸、表达载体宿主细胞，以及抗本发明的多肽的抗体
[0034]本发明还涉及编码该多肽的核酸(本发明的核酸)、包含该核酸的表达载体(本发明的表达载体)、导入了该表达载体的宿主细胞(本发明的宿主细胞)，它们优选可用于生产本发明的多肽。本发明的核酸、表达载体、宿主细胞可以采用本领域技术人员公知的方法来制备。本发明还涉及抗本发明的多肽的抗体，其可用于检测本发明的抗体。本发明的抗体可以采用本领域技术人员公知的方法来制备。
[0035]本发明的检测器件
[0036]本发明还涉及一种检测器件(本发明的检测器件)，其包括固体载体、以及连接于该固体载体上的本发明的多肽。
[0037]在本发明中，对固体载体没有特殊限制，只要是作为固体或不溶性材料(例如是可以通过过滤、沉淀、磁性分离等从反应混合物中分离的材料)的载体即可。
[0038]构成固体载体的材料包括但不限于:硅胶(聚二甲基硅氧烷，PDMS)、纤维素、特氟隆?、硝基纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、 聚丙烯、尼龙、聚偏二氟乙烯、胶乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纤维、金、钼、银、铜、铁、不锈钢、铁氧体、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚乳酸、树脂、多糖类、蛋白(白蛋白等)、碳或它们的组
人坐I=I 寸 O
[0039]固体载体的形状包括但不要限于:珠子、磁珠、薄膜、微细管、滤膜、板、微量板、碳纳米管、传感器芯片等。正如本【技术领域】公知的那样，薄膜或板等平坦的固体载体上可以设置凹坑、沟槽、滤膜底部等。
[0040]在本发明中，磁珠可以具有约25ηm约Imm范围的球体直径。在优选的实施方式中，磁珠具有约50um约IOym范围的直径。磁珠的尺寸可以根据特定的用途来进行选择。
[0041]在本发明中，由Sepharose等高交联球形琼脂糖制成的珠子具有约24 μ m约165 μ m范围的直径。优选地，高交联球形琼脂糖珠具有约24 μ m约44 μ m范围的直径。高交联球形琼脂糖珠的尺寸可以根据特定的用途来进行选择。
[0042]具有疏水性表面的固体载体的例子包括可从Polysciences, Warrington, PA或Spherotech, Liberville, IL购买的制品等聚苯乙烯胶乳珠。
[0043]二氧化硅(SiO2)-处理或二氧化硅(SiO2)基的固体载体的例子包括可从Polysciences, Warrington, PA购买的超常磁性二氧化娃珠等,其可以用于捕捉核酸(例如DNA) ο或者，还可以使用可从Dynal Biotech购买的M-280等。
[0044]具有亲水性表面的磁珠可用于捕捉增殖期的细菌细胞、核酸以及其它成分。作为该磁珠的例子，可以列举出Polysciences, Warrington, PA销售的珠子(名称:Biomag(注册商标)羧基)、或者 Bangs Laboratory, Inc.,Fishers, IN 的名称为 MC02N/2928 的珠子。或者，可以使用Dynal Biotech销售的M-270等。
[0045]在本发明的一个优选实施方式中，所述固体载体是SJ改性硅胶。苏州傯聚生物材料有限公司开发的一种硅橡胶材质的微阵列固体支撑材料(iPDMS薄膜，参见中国专利CN101265329A)。这种材料是以生物学研究常用的PDMS为基础，在其中加入特定的引发剂成份(使该材料可通过表面引发聚合反应(SIP)实现表面功能化修饰)，再经过聚乙二醇甲基丙烯酸酯(poly (oligo (ethylene glycol)methacrylate), pOEGMA)表面修饰获得的。SJ改性硅胶具有优秀的抗蛋白质非特异性吸附(Nonspecific protein adsorption, NPA)能力，可以将复杂蛋白免疫检测中的非特异性蛋白质吸附控制到接近“绝对O”水平(接近或低于仪器的检测极限)，不仅可以免除封闭和多次清洗的麻烦，还可以通过使用更强的信号扩增手段来提高蛋白质微阵列的灵敏性。而且其硅橡胶的本质赋予了该材料较强的机械性能和良好的可操作性。苏州傯聚已经成功地将SJ改性硅胶应用于11个肿瘤标志物组成的多指标联检微阵列ELISA试剂盒，实现了高通量和高灵敏的检测，证明了这种材料是一种优秀的蛋白质微阵列固体支撑材料。同时，这种材料还具有表面性质可调的特性，可以通过控制修饰反应时间在一定范围内调整其表面形貌。
[0046]本发明的多肽与固体载体的连接可以采用本领域技术人员公知的多肽与固体载体的连接方法来进行。例如，对于蛋白质/多肽与改性硅胶表面的连接而言，可以通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺[l-ethyl-3- (3-dimethyl am1-nopropyl)carbodiimide, EDC]和N-羟基玻拍酸亚胺(N-hydroxysuccinimide, NHS)的反应将改性娃胶表面高分子链上的羧基(-C00H)基团改为活化基团，该活化基团可与蛋白/多肽上所带的氨基(-NH2)反应从而实现将蛋白/多肽固定于固体载体表面(参见图1)。
[0047]对于点样时使用的点样液中本发明的多肽的浓度没有特殊限制，本领域技术人员可以依常规选择，优选为I μ g^lOOO μ g/mL,更优选10 μ g^500 μ g/mL。此外，对于本发明的多肽在固体载体上分布的密度没有特殊限制，本领域技术人员可以依常规选择，优选为1~100 点 /10mm2，更优选 5~50 点 /IOmm20
[0048]本发明的检测器件可以用于检测糖尿病(特别是I型糖尿病)和/或结核病、或者制备用于检测糖尿病(特别是I型糖尿病)和/或结核病 的试剂盒。
[0049]本发明的检测试剂盒
[0050]本发明还涉及一种检测试剂盒(本发明的检测试剂盒)，其包括本发明的多肽或检测器件。该检测试剂盒优选用于检测糖尿病(特别是I型糖尿病)和/或结核病，更优选用于检测结核病并发I型糖尿病。
[0051]本发明的检测器件或本发明的多肽是本发明的检测试剂盒的要件。本发明的检测试剂盒还可以包括:
[0052]1.配好的血清稀释液或血清稀释液组分溶液:血清稀释液，例如有北京赛驰生物科技有限公司的样本稀释液(产品编号070021-S2)、郑州博威嘉生物科技有限公司的加样变色样本稀释液(产品编号bwj010103)等。该血清稀释液用来稀释血清，试剂盒检测的血清要稀释适当倍数，例如2~200倍，优选10-100倍。
[0053]本发明的检测试剂盒还可以包括:
[0054]2.浓缩洗液:固体载体表面孵育血清及酶标二抗后，需用洗液清洗掉固体载体表面未结合的抗体和酶标二抗。浓缩洗液例如是I %的吐温20水溶液，使用时需稀释2~40倍、优选5~20倍。
[0055]本发明的检测试剂盒还可以包括:
[0056]3.酶标二抗溶液:1型糖尿病病人或结核病病人血清中的I型糖尿病自身抗体或结核病抗体(IgG)可与固体载体(例如SJ改性硅胶)上的本发明的多肽结合，二抗可与抗体结合，而二抗上的标记物可与发光底物反应，从而发出可检测的光。酶标二抗可以是例如辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG。作为酶标二抗溶液，可以列举出北京中杉金桥生物技术有限公司生产的辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG(H+L)，产品编号ZB-2304。对酶标二抗在酶标二抗溶液中的浓度没有特殊限制，可以是例如Ing~1000ng/mL。
[0057]本发明的检测试剂盒还可以包括:
[0058]4.发光液组分溶液:发光液可与二抗上标记的辣根过氧化物酶反应，使得反应发出仪器可检测到的化学光。发光液由两种溶液混合而成，分别是A液一过氧化氢溶液，及B液一发光氨溶液。发光氨(鲁米诺)只有用氧化剂处理过才会发光。通常使用双氧水和一种氢氧化物碱的混合水溶液作为激发剂。在辣根过氧化物酶催化下，双氧水分解为氧气和水:
[0059]2 H2 O2 — 02+2H20
[0060]鲁米诺与氢氧化物反应时生成了一个双负离子，它可被过氧化氢分解出的氧气氧化，产物为一个有机过氧化物。该过氧化物很不稳定，立即分解出氮气，生成激发态的3-氨基邻苯二甲酸。激发态至基态转化中，释放的能量以光子的形式存在，波长位于可见光的蓝光部分。发光液组分溶液的例子例如Thermo Seientific公司的SuperSignal.? ELISAFemto Maximum Sensitivity Substrate,货号 37074。
[0061]本发明的检测试剂盒还可以包括:
[0062]5.一个或两个以上的反应腔体(例如中国专利授权公告CN202054829U)。
[0063]本发明的检测试剂盒还可以包括:
[0064]6.其他用于检测糖尿病(特别是I型糖尿病)和/或结核病的检测分子(例如多肽、蛋白质、核酸等)。
`[0065]本发明的检测试剂盒还可以包括:
[0066]7.使用说明书。
实施例
[0067]以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但并不是对本发明技术范围的限定。通过本说明书的记载，本领域技术人员可以容易的对本发明进行修饰/改变，这些包含在本发明的技术范围内。
[0068]L 30狀的制各与确认
[0069]实施例中使用的30肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，由吉尔生化(上海)有限公司合成，该多肽的表征图谱见图2，可以确认合成了所述多肽。
[0070]2.检测器件的制备
[0071]检测芯片是以SJ改性硅胶(iPDMS薄膜)为固体支撑材料，在其上通过点样固定多肽溶液制备而成。改性硅胶是在传统的聚二甲基硅氧烷材料中加入带烯烃末端的、表面引发聚合反应的引发剂，并通过热交联(硅氢键键合)固定到聚二甲基硅氧烷的三维结构中，得到一种新的材料即SJ改性硅胶。其制作过程如图3所示。
[0072]其中的A和B为聚二甲基硅氧烷的两个组分，聚二甲基硅氧烷(Poly (dimethylsiloxane), Sylgard 184)购买自美国道康宁(DowCorning)公司，包含液态组分A(成分为金属钼催化剂与带乙烯基的二甲硅氧烷高分子前体混合物)和交联剂B(成分为带有乙烯基和S1-H基团的二甲基硅氧烷前体)两种成分。C为末端带乙烯基的引发剂，购于杭州东伟公司。最后修饰上的高分子是寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯单体(Olig0(ethyleneglycol)methacrylate,以下简称0EGMA,分子量Mw=526)购买于Aldrich。将聚二甲基娃氧烷前体A和交联剂B与带乙烯基末端的引发剂C以A:B:C=10:1:0.5比例充分混合。通过固化反应制成透明的弹性硅橡胶，然后通过SIP技术进行表面修饰即可得到SJ改性硅胶。实验表明，SJ改性硅胶的表面有足够高密度的、通过共价键固定的引发剂，其可以通过表面引发聚合反应(SIP)实现表面高分子修饰。使用poly(OEGMA)(聚乙二醇甲基丙烯酸酯)进行反应获得聚乙二醇(Polyethylene Glycol, PEG)修饰的表面,实现较强的抗蛋白非特异性吸附的能力。
[0073]制好的SJ改性硅胶薄膜需保存在4°C冰箱中。
[0074]采用晶芯? PersonalArrayerTM 16个人点样仪在改性硅胶上制备多肽微阵列，过程为:
[0075]I)预处理
[0076]将SJ改性硅胶薄片(15 X 15mm2)浸泡在活化液中，30min后取出用去离子水淋洗3次，用氮气吹干，马上用于点样。
[0077]2)点样
[0078]将点样液稀释好并转移到384孔板相应的微孔中，将带样本的384孔板置于点样仪基台上，同时将预处理的改性硅胶薄片置于点样仪的基台上，马上进行点样。点样环境条件为室温(25°C)，湿度设定为50%。制成的多肽微阵列上每个点的点样量约为0.6nL，样点半径为200 μ m。
[0079]3)化学固定
[0080]刚制好的多肽微阵列要放在恒温恒湿箱(26°C，60%湿度)中固定至少6h。化学固定过程如图4所示。
[0081]首先通过点样仪将包含有捕获多肽分子的缓冲液点在改性硅胶薄膜上，接着缓冲液开始蒸发，捕获多肽分子与SJ改性硅胶表面亲密接触并相互作用，通过化学结合，改性硅胶表面的Ploy(OEGMA)高分子的末端-COOH与多肽分子的-NH2形成稳定共价键，进而将有化学活性的多肽分子固定在SJ改性硅胶表面。
[0082]5)装配
[0083]固定6h的多肽微阵列必须在两天内装配好。首先通过背胶将SJ改性硅胶薄片贴在专门的反应柱上，盖上反应腔体。一个反应器由两个反应柱和一个反应腔体组成。
[0084]6)保存
[0085]装配好的多肽微阵列，需要抽真空密封，保存在4°C的冰箱中，备用。
[0086]3.用检测器件进行检测
[0087]检验步骤
[0088]1、开始检测前，将浓缩清洗液按1:10的比例加入纯化水或蒸馏水进行稀释，稀释完成后直接使用。使用移液枪将2mL清洗液加到芯片表面，浸泡芯片3分钟，保证芯片表面被完全浸润。
[0089]2、将待测血清样本用样本稀释液按照1:40稀释混匀。
[0090]3、弃去浸泡芯片的清洗液，在芯片表面完全湿润的状态下，每个血清样本吸取200 μ L稀释后的血清加入到芯片反应器内。
[0091]4、将芯片反应器放入芯片固定座，放到摇床上，开启摇床，频率150转/分钟，室温孵育30分钟。
[0092]5、弃去芯片反应器内的血清样本，用15mL洗液清洗反应腔体和芯片表面3次。
[0093]6、清洗完成后，每个芯片反应器分别加入200 μ L酶标抗体溶液，将芯片反应器放入芯片固定座，放到摇床上，开启摇床，频率150转/分钟，室温孵育30分钟。
[0094]7、弃去芯片反应器内的酶标抗体溶液，用15mL洗液清洗反应腔体和芯片表面3次。
[0095]8、清洗完成后，取下反应腔体，每个芯片表面分别加入15 μ L发光底物液，使发光液能均匀的铺于芯片表面。
[0096]9、将加入了发光液的芯片置于凝胶成像仪中化学发光成像，并判读结果。
[0097]结核病病人血清由江苏省疾控中心提供，均为痰培养确诊了的结核病病人血清，I型糖尿病病人血清及其他疾病病人血清样本由合作医院提供。血清由相关人员用冰块/干冰等包裹运送或快递至实验室。
[0098]阴性对照有PBS缓冲液(即在第3步中不用待测血清孵育,而用PBS溶液孵育,其余步骤相同)的对照，血清稀释液的对照，及阴性病人(指健康人血清及非I型糖尿病且非结核病病人)血清的对照。
[0099]多肽微阵列的点样模式如图5所示。其中，三角形的20个点的样本为人IgG，作为实验的定位点；正方形的4`个点的样本为PB点样液，作为实验的空白对照；圆形点的的样本是其他的I型糖尿病自身抗原蛋白多肽，作为实验的检测指标(这些多肽有响应说明检测血清中有I型糖尿病自身抗体)；星形点的样本多肽即为本发明的多肽SEQ ID N0:1，它是I型糖尿病自身抗原蛋白多肽，会对I型糖尿病患者血清产生响应，也会对结核病人血清产生响应。
[0100]实验结果如图61所示。其中，图6显示了阴性对照的检测结果，只有三角形所示的点的样本有响应。图7显示了 I型糖尿病病人血清的检测结果，三角形、圆形和星形点的样本有响应。图8显示了结核病病人血清的检测结果，三角形和星形点的样本有响应。需要说明的是，仪器测得信号值由低到高，相应的信号点颜色由黑一红一白渐变。