一种用于蛋白质或者活性多肽生产和递送的食品级重组乳酸菌及其制备方法

刘占良, 刘战征, 刘占术

2014年3月26日

2012年9月10日

2012年9月10日

刘占良, 刘战征, 刘占术

C12R1/46GK103667164SQ201210334194

多肽 活性 蛋白质 用于 或者 生产

1.经过基因工程改造的食品级乳酸菌活载体，用于蛋白质或者活性多肽生产和递送其特征在于，其包括表达和生产外源蛋白质或者活性多肽的thyA基因缺失的乳酸菌菌株，插入到乳酸菌染色体的外源蛋白质或者活性多肽的表达框2.按照权利要求1的乳酸菌菌株，包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentium)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳杆菌(Lactoba cillus salivarius),以及乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactissubspecies lactis)等3.按照权利要求1的重组乳酸菌菌株，外源蛋白质或者活性多肽的表达框通过与thyA基因的置换而整合到乳酸菌染色体上，并敲除了抗生素抗性基因4.按照权利要求1的外源蛋白质或者活性多肽，是指抗原蛋白质、抗体蛋白质、营养性蛋白质、活性多肽、蛋白类激素、细胞因子等其中细胞因子包括IL-1 β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5, IL-6, IL-7, IL-8， IL-9， IL-10， IL-11， IL-12， IL-13， IL-15， IL-16， IL-17， IL-18，IL-19, IL-20, IL-21, IL-23，IL-24，IL-25，IL-26，IL-32，cMGF, LT, GM-CSF, M-CSF, SCF，IFN- Y , IFNA，EPO, G-CSF, LIF, OSM, CNTF，GH, PRL, IFNa，IFNP 等5.按照权利要求1的外源蛋白质或者活性多肽，其特征在于，其编码基因的核苷酸序列已经根据乳酸菌对密码子的使用偏好性进行了优化其优化原则为TTC — TTT ；GTA — GTT ；TCC — TCT ；GAG — GAA ；TGC — TGT ；AGA — CGT ；AGG — CGT6.按照权利要求1的纳米抗体或者亲和多肽表达框，其特征在于，其包括组成型启动子序列、信号肽序列和锚定子序列(当用于分泌表达时，不包含锚定子序列)7.按照权利要求6的组成型启动子序列，其特征在于，是下列序列中的一种，或者与下列序列的相似性超过85 %的序列中的一种1)GTCGGT CGA GTT GTT GAC AGG ATA AAG GTC GCC TGG TAT GGT CTC AATATA GCG2)GTCGTG GCA GTT GTT GAC AAC CTG TGG GCG GTT TGA TTT GTT CTT GCTATA GCG3)ACCGAG CCA GTT GTA GAC AGG GCT GTG CTG ACC TGG TAA GGT ATA TTATAG CG4)GAGCTG CGA GTT GTT GAC ATT GTT AAT GGC CCC TGA TAT ATT TGG CGTATA GCG5)GGGGTA GTT GTT GAC AGC GTG GGT TGG TGC TGG TAA TTT TGC GCT ATAGCG6)GAGTCT TGC GCT ATA GTT GTT GTC AGA ATG GAG ATA CTA TGA TAT AATGTT GCTATA GCG7)AGGGAG TGA GTT GTG ACA GGG CTG TGA TGG TGT GGT ATT GTT TTG GTATAG CG8)ACGAGT TGT TGG TAT TGT GGC GGT ATA GCG9)AGGGGT TGA GTT TGA CAC TGA TCC CGG CTG GTG GTA AAT TTT CGT TATAGC G8.按照权利要求6的信号肽序列，其特征在于，是下列序列中的一种，或者与下列序列的相似性超过85 %的序列中的一种DATT AAT GAT TCA ACC ACG GTT GAA CCA GTG CTG GAT GGC CCG TAT CAGCCA ACTACA TTT MA CCG CCA AAC GAT TAT TGG TTG CTG ATT AGT AGCAAT ACC GAT GGT GTT GTGTAC2)AAACCG CCA AAC GAT TAT TGG TTG CTG ATT AGT AGC AAT ACC GAT GGTGTT GTGTAC GAA AGC ACT AAC AAC TCA GAT TTC TGG ACA GCG GTT ATTGCC GTG GAACCG CGT GTTTCA3)TAAACG GAT AAC CAA AAT ACG GGC TAA CAT CAT CGT CAT GGT TTG CCATTA CTGCCA GTT TGG CCG CTC GTC GTC ATC TCT TTC GGG GGT GTG TCAATC TGG GTG GTT GAT GCTTGA TCT4)TTTAGC AAT CGT CGC ACC TTA ACG AGT AAC AAC CGT TTA GTT GGT ATGTTG AAGTAT GGT GGC CGC GTG TGG ACC TTT CAT GGC GAA ACG CCA CGTGCG ACC ACG GAT AGT AGCAAC5)ATTTAT CGT CAG CTG TTA ACC AAT TCA TAT TCT GTT GAT CTG CAC GATGAA ATCGAA CAA ATC GGT AGC GAA AAG ACC CAG AAC GTG ACG ATT AATCCG GGC CCATTT GCG CAAACC CGT 6)AAATTG ATG ATC TTA GGC ATG CTC GTT TTT AAA ATT AAT AAG GGG GTAACG GGGGCA ACA ATG GCG CAT GCT AGC ATC AAT CCT GAA ATG ACG ACCGCA GCC7)TTAACG AGT AAC AAC CGT TTA GTT GGT ATG TTG AAG TAT GGT GGC CGCGTG TGGACC TTT CAT GGC GAA ACG CCA CGT GCG ACC ACG GAT AGT AGCAAC ACT GCC GAT CTG AATAAC ATT 8)GCCGTG GAA CCG CGT GTT TCA CAA ACG AAT CGC CAG TAT ATT CTG TTTGGT GAAMC AAG CAA TTC AAC ATC GAA MC AAC AGT GAT AAA TGG AAGTTT TTC GAA ATG TTC AAG9.按照权利要求6的锚定子序列，其特征在于，是来自于以下蛋白质的LPXT-模序细胞壁锚定结构域(LPXTG-motifcell wall anchor domain)之一，这些蛋白质在GenBank的编码如下YP_005872271、YP_005873461、CCC77736、CCC77890、CCC78260、CCC78361、CCC78381、CCC78520、CCC78612、CCC78778、CCC79729、ΥΡ_005873877、ΥΡ_005873931、ΥΡ_005873973、ΥΡ_005874035、ΥΡ_005861438 等10.按照权利要求1的重组乳酸菌菌株，可以用于生产并将蛋白质或者活性多肽递送到消化道、呼吸道或者生殖道

[0001]本发明涉及一种用于蛋白质或者活性多肽生产和递送的食品级乳酸菌活载体及其制备方法更具体地说，本发明涉及一种用于生产和递送抗原蛋白质、抗体蛋白质、营养性蛋白质、活性多肽、蛋白类激素、细胞因子等蛋白质或者活性多肽的食品级重组乳酸菌，及其制备方法技术背景[0002]人或动物的胃肠道黏膜、呼吸道黏膜和生殖道黏膜存在着丰富多样的药物相关受体，是许多蛋白质或者多肽药物的靶标其中，胃肠道系统同时又是一个复杂的大型器官，行使着十分重要的生理功能，包括食物的摄入、免疫调节、能量平衡和新陈代谢等在胃肠道、呼吸道和生殖道中，存在着大量的微生物，既包括有益菌，如乳酸菌，也包括病原微生物[0003]乳酸菌为革兰氏阳性菌，属于益生菌近年来，随着乳酸菌基因组学的不断发展和遗传操作工具的不断丰富，乳酸菌逐渐发展为理想的生产蛋白质或者活性多肽的细胞工厂和递送活载体应用于食品、饮料及饲料产品中的乳酸菌的表达系统必须是食品级的即所应用的宿主菌、诱导物及载体三者都必须是食品级的首先，重组蛋白表达所使用的宿主菌必须是安全的、特征清楚且稳定的食品级微生物；其次，诱导物必须是食品级的、可被人食用或对人无害的物质，或温度、酸诱导等对人体无害的条件；另外，载体也必须是食品级的，不能有非食品级的功能性DNA存在，与食品级表达系统有关DNA必须来源于食品级微生物，且不含抗生素抗性基因，没有有害化合物产生这样的表达系统才适用于大规模工业生产[0004]使用乳酸菌作为蛋白质或者活性多肽生产和递送载体，首先要将乳酸菌菌株改造为一个药物蛋白质或者多肽的“细胞工厂”，包括a)建立乳酸菌的营养缺陷型，即将一个乳酸菌生存所必须的基因从染色体敲除(通常为胸苷酸合成酶基因thyA)，这样，当乳酸菌被人或动物排放到环境中时，乳酸菌细胞会迅速死亡，以避免基因在环境中的扩散；b)构建合适的表达框，以保证目标药物蛋白质或者多肽能够在适当的水平进行表达、有效地分泌到细胞外或者展示在乳酸菌细胞壁；c)要保证蛋白质的正确折叠，保持正确的三维结构和生物活性；d)将整个表达框插入到乳酸菌的染色体，并去掉基因操作过程中所引进的所有抗生素抗性基因，以保证产品的生物安全性然后，重组乳酸菌可以通过常规发酵技术进行发酵生产，经过冻干处理，可以制备成胶囊、片剂或者冲剂，用于直接口服[0005]美国专利 “Lactobacilli harboring aggregation gene as a vaccinedelivery vehicle (US006100388A, 2000年)”公布了一种将外源抗原蛋白质与凝聚基因(aggregation gene)或者粘蛋白结合因子融合表达的方法，将罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)开发为疫苗载体美国专利 “Bacterial deliveryofbiologically active polypeptides (US8066987B2, 2011 年)”公布了一种使用革兰氏阴性菌递送生物活性多肽的方法本发明所使用的乳酸菌为革兰氏阳性菌，同时，所使用的遗传调控元件均不在上述专利所保护范围[0006]使用食品级乳酸菌作为细胞工厂和递送活载体生产和递送蛋白质或者活性多肽具有如下优势[0007]I)由于具有良好的安全性，表达外源蛋白质或者活性多肽的食品级重组乳酸菌可以用于直接口服，相对于需要注射的蛋白质或者多肽药物，口服给药更易于被患者接受，治疗成本更低该产品也可以直接应用于饲料发酵、饲料添加等[0008]2)可以将蛋白质或者多肽随着乳酸菌高效靶向于消化道黏膜、呼吸道黏膜，或者生殖道黏膜由于乳酸菌活载体蛋白质或者多肽是由食品级重组乳酸菌在人体或者动物体内原位合成和释放，这些蛋白质或者多肽可以仅在靶标位置积累起相对较高的浓度，而对于非靶标位置，积累的浓度极低，所以引起的副作用也极低相比之下，传统的蛋白质或者多肽需要注射或者静脉进入人体或者动物体，然后通过遍布全身的循环系统而到达靶标，但同时也大量分布到非靶标组织和器官，既带来一定的副作用，也是一种浪费[0009]3)良好的代谢动力学在食品级重组乳酸菌定殖于消化道黏膜、呼吸道黏膜，或者生殖道黏膜期间，外源蛋白质或者多肽是随着乳酸菌细胞的生长和分裂逐渐释放的这起到了药物的缓释作用，也模拟了动物体自身的细胞因子的合成和释放过程，符合最理想的药物代谢动力学要求而传统的蛋白质或者多肽药物由于是一过性给药，药物在给药后迅速达到峰值，而后迅速衰减[0010]4)生产十分方便食品级乳酸菌活载体蛋白质或者活性多肽通过常规的细菌发酵和冻干技术即可生产冻干的菌粉可以制作成片剂、胶囊或者冲剂整个制造工艺十分简单，成本低廉

本发明涉及一种用于蛋白质或者多肽生产和递送的食品级重组乳酸菌及其制备方法。其特征在于，其由食品级的thyA基因(胸腺嘧啶合成酶基因)缺陷型乳酸菌菌株和整合到其染色体上的外源蛋白质或者活性多肽的表达框组成。其特征还在于外源蛋白质或者多肽的完整表达框由组成型启动子序列、信号肽序列和锚定子序列组成(当用于分泌表达时，不包含锚定子序列)。本发明所公布的食品级重组乳酸菌不含有任何新引入的抗生素抗性基因。本发明属于一个活载体技术平台，具有良好的通用性，可用于开发活载体疫苗、活载体纳米抗体、营养性蛋白质、活性多肽、蛋白类激素、细胞因子等，应用于医药、食品、饲料等诸多行业。

一种用于蛋白质或者活性多肽生产和递送的食品级重组乳酸菌及其制备方法