专利名称：利用活性氧代谢物抑制剂活化和保护细胞毒性淋巴细胞的制作方法图1-保护CD3ε+T细胞免遭DPI的氧化抑制。此处描述的淋巴细胞和MO是取自外周血液中。用培养基(对照，开环)或IL-2(100U/ml，闭环)处理MO和淋巴细胞的混合物16小时。培育后，淋巴细胞用CD3ε和CD69抗体进行标记。数据结果显示了CD69在可存活T细胞(CD3ε)(左)中的表达，以及具有细胞程序性死亡减少的前倾扩散特征和增加的边角扩散特征的T细胞百分数(右)。当在CD56+中检测CD69表达时也获得了同样的结果。NK细胞与MO共培育29.5％(对照)或79.0％(1000nM DPI)的NK细胞获得了对IL-2作出应答的CD69抗原。在没有MO存在的情况下的T细胞或NK细胞培育中，DPI没有增加IL-2诱导的CD69表达(未给出)。这个结果是三个类似实验的代表数据。发明详述本发明涉及利用对ROM抑制性化合物，如diphenylionodinium单独给药或与其他辅助药物结合给药来治疗来治疗癌症和病毒性疾病。ROM抑制性化合物是指能够抑制ROM产生和释放的化合物和组合物。ROM抑制性化合物这个名词进一步包括ROM清除剂。对多种药物给药的结果是活化和保护了细胞毒性淋巴细胞免遭单核细胞/巨噬细胞的破坏和抑制性效应，并且刺激了这些细胞的抗癌和抗病毒特性。此外，在有疫苗组合物的情况下对ROM抑制性化合物给药可使得在单核细胞存在的情况下提高淋巴细胞的分裂增生。本发明也考虑了在添加有其他的细胞毒性淋巴细胞活化化合物药物的情况下给药。细胞毒性淋巴细胞是拥有细胞毒性能力的淋巴细胞，如NK细胞和细胞毒性T细胞(CTLs)。细胞毒性淋巴细胞这个名词也包括非细胞毒性细胞，如可辅助具有细胞毒性能力的淋巴细胞活化的辅助T细胞。细胞毒性淋巴细胞活化化合物，包括那些具有免疫刺激特性，其中优选的是可与ROM抑制性化合物协同作用的化合物。这样的免疫刺激性化合物的代表化合物包括细胞因子、肽、黄酮类化合物、一般抗原、疫苗和疫苗助剂。可与本发明的方法联合使用的其他化合物包括化学治疗药物和/或抗病毒药物。本发明中的方法在治疗肿瘤疾病和病毒性疾病方面是有效的。在考虑治疗遭受多种肿瘤性疾病和病毒疾病个体方面，本发明寻求能够刺激和提高细胞介导的免疫性的方法来达到治疗的目的。细胞介导的免疫性(CMI)包括细胞毒性淋巴细胞介导的对外来药剂的免疫应答。CMI应答不同于抗体介导的体液免疫性，因为在CMI中的活性药剂是细胞毒性淋巴细胞，而不是抗体蛋白。细胞介导的免疫性(CMI)是通过细胞毒性淋巴细胞，如NK细胞和/或T细胞(CTLs)识别和破坏在其表面展示有外来抗原的细胞的方式作用的。在本发明中，外来抗原可以是肿瘤性细胞或受病毒感染的细胞。这样，CMI的职责是消灭体外侵入的细胞。例如，CMI是可以靶定病毒感染的细胞，而不是防止病毒感染细胞。不同于能有效防止病毒感染的体液免疫性，细胞介导的免疫性首要的机制是对已经存在的病毒感染的防御。该机制对于肿瘤疾病进行的斗争而言也很关键的。因此，在细胞毒性淋巴细胞活性提高方面，本发明特别适于对肿瘤疾病和病毒性疾病进行的斗争。正如上面所讨论的，免疫系统包含有多种不同的细胞类型，每种细胞都用于保护机体免遭外来入侵。为了达到这个目的，免疫系统的某些细胞可产生活性氧代谢物(ROM)，例如过氧化氢，ghypalhous酸、以及羟基自由基。按照以前的观察，自体单核细胞/巨噬细胞(MO)可有效抑制一种细胞毒性淋巴细胞，人天然杀伤(NK)细胞的活化，应答于体内细胞因子刺激(如IL-2或IFN-α)。(可参见，H，K.，etal.，Scand.J.Clin.Lab lnvest.57193-202(1997))。抑制性信号是通过MO产生的过氧化氢和其他活性氧代谢物(ROM)来传递的。(SeeHellstrand，K.，et al.，J.lmmunol.，1534940-4947(1994)；Hansson，M.，et al.，J.lmmunol.15642-47(1996))。已经证明，添加可降低过氧化氢浓度的过氧化氢清除剂和/或添加可抑制过氧化氢释放的化合物，如组胺或H2受体拮抗剂，这两种方法都可去除MO的抑制性效应。现在认为，T细胞是对多种细胞因子，如INF-α和IL-2的抗肿瘤特性负责的重要效应细胞，这在实验肿瘤模型和人肿瘤疾病中也观察到了。(Sabzevari，H.，et al.，Cancer Res.534933-4937，(1993)；Hakansson，Al.，et al.，Br.J.caneer，74670-676，(1996)；Wersall and Mellstedt，Med.Oncol.，1269-77，(1995))。本发明部分涉及到一些方法，这些方法包括将可降低ROM浓度的化合物与一或多种引起T细胞活化或刺激的T细胞活化化合物结合使用。本发明通过给药影响ROM的化合物、T细胞活化化合物、和/或抗癌和抗病毒化合物，提供了多种方法来治疗肿瘤性紊乱和病毒感染，这些方法是通过提高T细胞数量和特异性活性的方式来进行的。在本领域中，已知有多种能够激活和刺激细胞毒性淋巴细胞活性的细胞毒性淋巴细胞激活化合物。剂量、给药途径和使用方法以及对这些药剂给药都是按照传统的方式，这些在本领域中是众所周知的。一般来讲，已经证明，白细胞介素、细胞因子和黄酮类化合物能够刺激细胞毒性淋巴细胞的活性。合适的化合物是选自包括IL-1、IL-2、IL-12、IL-15、INF-α、INF-β、INF-γ以及黄酮乙酸、呫吨酮-4乙酸以及其类似物和衍生物。某些疫苗和疫苗助剂也可认为是细胞毒性淋巴细胞活化化合物。此处考虑的化合物包括从已免疫或种痘的个体得到的多种疫苗和疫苗助剂，它们可辅助已给药的抗原来诱导快速的、强有力的、持久的细胞毒性淋巴细胞介导的免疫应答。说明性的疫苗包括流感疫苗、人免疫缺陷病毒疫苗、肠炎沙门菌疫苗、乙肝疫苗、Boretellabronchiseptica疫苗、结核病疫苗，以及多种抗癌性治疗药物，如同种异基因癌症疫苗和自体癌症疫苗，这都是在本领域中已知的。
本发明还指导对这些疫苗助剂的使用。这些药剂包括卡介苗(BCG)杆菌、百日咳菌外毒素(PT)、霍乱毒素(CT)、大肠杆菌热不稳定毒素(LT)、分支杆菌71KD细胞壁结合蛋白、微乳MF59、从可生物降解的多聚物聚(lactide-co-glycolides)(PLG)制备的微粒、30-40KD笼样结构的免疫刺激复合体(ISCOMS)(它由助剂uil A的糖苷分子、胆固醇和抗原能够整合其中的磷脂组成的)，以及本领域中已知的其他合适化合物。这样的化合物可以以能在已免疫的个体内引起有效免疫应答的足够剂量给药。
本发明考虑和公开了多种不同细胞毒性淋巴细胞活化化合物。这些化合物可用于形成细胞毒性淋巴细胞活化组合物，这可能是本发明激活患者细胞毒性淋巴细胞的一个步骤。本发明也考虑到将细胞毒性淋巴细胞活化化合物和细胞毒性淋巴细胞活化组合物相互通用。对这些药物的剂量、给药途径和使用方式以及岁这些药物的给药可按照传统的方法，这在本领域中是众所周知的。
名词‘活性氧代谢物抑制剂’包括多种不同的化合物。NADPH抑制剂、H2受体抑制剂、以及其他在本领域中已知具有H2受体拮抗剂活性的其他化合物也适于在本发明中应用。这些合适化合物的包括diphenylionodonium(DPI)、组胺、与组胺和血清素具有相似化学结构、但不负面影响H2受体活性的化合物。合适的化合物是选自由diphenylionodonium(DPI)、组胺、dimaprit、可乐定、妥拉唑啉、IMPROZODINE、倍他唑、组胺同源化合物、H2受体拮抗剂、8-羟基-DPAT、ALK-3、BMY7378、NAN190、LISURIDE、d-LSD、FLESOXINAN、DHE、MDL72832、5-CT、DP-5-CT、IPSAPIRONE、WB4101、麦角胺、丁螺环酮、METERGOLINE、SPIROXATRINE、PAPP、SDZ(-)21009以及BUTOTANINE组成的组中。
在本领域中，多种可有效催化细胞间过氧化氢降解的过氧化氢清除剂也是已知的。适合的化合物是选自由过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶、维生素E、SELEN、谷胱甘肽以及抗坏血酸组成的组。
对上述化合物的给药可在体内或体外的方式进行。当在体外给药时，需要选用无菌、无毒的给药途径。在体内给药时，上述化合物给药可通过皮下、静脉内、肌肉间、眼内、口、经黏膜、或经皮等路径有利的进行，例如通过注射或通过控制释放机制。控制释放机制的示例包括多聚体、凝胶、微球体、脂质体、片剂、胶囊、栓剂、唧筒、注射器、眼内嵌入物(ocular insert)、经皮肤制剂、洗剂、乳剂、经鼻喷剂、亲水胶、微囊、吸入剂以及胶态药物传递体系。
本发明中的化合物是以药物学上可接受的形式和基本上无毒的剂量给药的。本发明对给药化合物的多种形式进行了考虑。这些化合物可在含有或不含有表面活性剂如羟丙基纤维素的水溶液中给药。对分散体溶液也进行了考虑，例如那些利用甘油、脂质聚乙烯乙二醇和油的分散体溶液。也在制剂中添加了抗微生物的药物。可注射制剂包括无菌水溶液或分散体溶液，或在使用前可稀释或悬浮在无菌环境中的粉剂。载体，如含有水、乙醇多羟基化合物、植物油等的溶剂或分散体溶液也可添加到本发明的化合物中。包衣，如卵磷脂和表面活性剂可用于维持组合物特有的流动性。也可添加等张因子如糖和氯化钠，也可添加旨在延缓活性化合物的吸收的药剂，如硬脂酸单钠和明胶。无菌注射液的制备是按照本领域中的技术人员熟知的方法来制备的，并且在储存和/或使用前进行过滤。无菌粉剂可通过对溶液或悬浮液进行真空干燥或冷冻干燥来制备。持续释放制剂或配方也在本发明的考虑之列。在本发明中的组合物中所使用的药剂都是药物学上可接受的，并且是以基本上无毒的剂量给药。
虽然对这些化合物进行的实验中是选用的单一浓度，但我们应该明白在临床上可以对这些化合物长时间的给药以复合剂量。一般来讲，这些化合物给药的时间可长达大约一个星期，甚至可将时间延长至一个月或一年。在一些情况下，对这些化合物的给药可以间断，然后在以后的时间里继续。这些化合物的每日剂量可分为多次给药，也可是单独一次给药。
此外，本发明中的化合物可以是单独给药，或者是作为一个组合物(结合)给药。如果单独给药，那这些化合物应该是以时间上相近的方式给药，例如在24小时之内，这样细胞因子或其他化合物对细胞毒性淋巴细胞的活化就可得到加强。较为特别的，这些化合物可在一小时内单独给药。给药方式可以是局部或系统的注射或输注。其他的给药方法也可能是合适的。
本发明也考虑了将细胞毒性淋巴细胞活化化合物与ROM产生或释放抑制化合物、ROM清除剂、抗癌化合物、以及抗病毒化合物结合给药。剂量、给药途径和使用方法，以及对这些药剂的给药都是以传统方法，这些在本领域中是熟知的。例如，在一个实施方案中，将IL-2和IL-12相结合来活化细胞性淋巴细胞群，在一个可选方案中，疫苗或者是佐剂用于活化T细胞群。在另一个实施方案中，在治疗过程中是DPI与组胺结合给药来抑制从单核细胞中产生和释放过氧化氢。本发明也考虑了对多种ROM抑制剂化合物结合给药，这些化合物包括过氧化氢清除剂如过氧化氢酶和抗坏血酸过氧化物酶。本发明进一步考虑利用上述所有化合物的结合来找出一种有效的方式，这样可刺激细胞毒性淋巴细胞对肿瘤性疾病和/或病毒性疾病的抵抗。
所有的化合物制剂都是以剂量单位形式提供的，这样就可将剂量一致，并且简化了给药。每个剂量单位形式含有预先确定剂量的活性成分，这个预先确定的剂量是通过计算得出来的，这个剂量的活性成分可与一定量的药物上可接受的载体结合产生所需要效果。因此，这样的计量就定义为特定化合物的有效剂量。
通过本领域中一般技术人员已知的技术就可以确定优选的化合物剂量范围。IL-2、IL-12或IL-15可以大约1000-600,000U/kg/天(18MIU/m2或1mg/m2/天)的剂量给药。更优选的剂量为大约3,000-200,000U/kg/天，甚至更优选的剂量是大约5,000-100,000U/kg/天。
INF-α、INF-β、INF-γ也可以大约1000-600,000U/kg/天的剂量给药，更优选的剂量为大约3,000-200,000U/kg/天，甚至更优选的剂量是大约5,000-100,000U/kg/天。
黄酮类化合物可以1-100,000mg/天的剂量给药，更优选的剂量是5-10,000mg/天，甚至更优选的是剂量是大约50-1,000mg/天。
本发明中的化合物的一般给药剂量在此处所列的范围之内。例如，IL-2一般的单独给药剂量为大约300,000U/kg/天。INF-α一般给药剂量为45,000U/kg/天。IL-12在临床实验上的剂量是0.5-1.5μg/kg/天(Motzer，et al.，Clin.CancerRes.4(5)1183-1191(1998))。IL-1β在癌症患者身上的使用剂量是0.005-0.2μg/kg/天(Triozzi，etal.，J.Clin.Oncol.13(2)482-489(1995))。IL-15的使用剂量是25-400ug/kg/天。(Cao，et al.，Cancer Res 58(8)1695-1699(1998))。
也可对疫苗和疫苗助剂以与那些化合物相适应的剂量给药来活化细胞毒性淋巴细胞。通过那些本领域中的一般技术人员熟知的技术就可以很容易的确定每种药剂的合适剂量。对这些药剂的合适剂量的确定要部分建立在患者对药剂的可耐受性和治疗效率之上，对这种可耐受性和效力的检测是利用与确定合适的化学治疗剂量相似的方法来进行的。
可有效抑制细胞间过氧化氢形成和释放的化合物，或过氧化氢清除剂，能以有效剂量大约为0.05-10mg/天的剂量给药，更优选的剂量是大约0.1-8mg/天，甚至更优选的剂量是大约0.5-5mg/天。此外，这些化合物可以1-100微克/千克患者体重(1-100mg/kg)的剂量给药。然而，在每种情况下，这些剂量要依赖于给药化合物的活性。前述的剂量对NADPH抑制剂如DPI、组胺、H2受体拮抗剂、其他细胞间过氧化氢产生或释放抑制剂或过氧化氢清除剂是合适和有效的。对特定宿主的合适剂量可很容易的通过本领域中的一般技术人员熟知的经验技术确定。
本发明考虑了一种方法来确定患者是否需要增强的细胞毒性淋巴细胞活性和提高患者循环血液ROM抑制性化合物浓度至一个最佳的、有益的和治疗性的水平，这样就可以提供更加有效的细胞毒性淋巴细胞刺激性。在治疗期内，这样的水平可通过在一天的时间内重复注射本发明中的化合物来得到。
患有癌症的患者经常有循环血组胺水平降低的症状。(Burtin etal.Decreased blood histamine levels in subjects with solidmalignant tumors，Br.j.Cancer 47367-372(1983))。因此，将血液组胺浓度提高至有益浓度的方法可应用于癌症和抗病毒的治疗中，而这些癌症和抗病毒治疗是建立在组胺与一些药剂之间的协同效应之上的，而这些药剂又是可增强细胞毒性效应细胞介导的细胞毒性的。按照这种策略，T细胞活性就可增强。例如，通过将H2拮抗剂与药剂结合给药，可以提高细胞毒性T淋巴细胞的细胞毒性活性，这种H2激动剂如组胺，可将循环组胺提高至足够增强与H2受体激动剂协同作用的药剂的活性。
在本发明的一个实施方案中，循环血ROM抑制性化合物，如DPI或H2受体拮抗剂的有益水平是通过以0.05-10mg/天的剂量给药ROM抑制化合物获得的。在另外一种实施方案中，ROM抑制性化合物的有益血水平是通过给药以1-100毫克/千克患者体重(1-100g/kg)的剂量来获得的。在另一个实施方案中，在长达52个星期的治疗期内，有1-4个星期的治疗期是每天注射多次ROM抑制性化合物。是在另外一个实施方案中，ROM抑制性化合物的给药时间是1-2个星期，在这段时间里进行每天几次的多次注射(multiple injection)。这样的给药可以每几个星期重复一次，这样的治疗时间可长达52个星期或更长的时间。此外，给药的频率是可变的，这要视患者对治疗的耐受程度和治疗的效果来定。例如，这样的给药可每星期或每天三次，持续时间可达24个月。
本发明的一个实施方案考虑了在多种癌症或肿瘤性疾病治疗中的应用。本发明可抵抗的恶性疾病包括的，但并不局限于原发或转移性恶性肿瘤疾病、血液恶性疾病如急性和慢性骨髓性白血病、急性和慢性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤、特发性巨球蛋白血症、毛细胞白血病、骨髓发育不良综合症、原发性脾大性红细胞增多症以及特发性血小板增多症。
本发明中的方法可单独使用，也可与其他抗癌治疗结合使用。当与化学治疗方法结合使用时，ROM抑制性化合物和细胞毒性淋巴细胞活化化合物是与一种或多种化学治疗药物结合使用的。剂量、给药途径和给药方法以及对这些药剂的给药可按照本领域中熟知的传统方式进行。在癌症治疗中应用的代表性化合物包括环磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法仑、雌莫司汀、iphosphamide、泼尼莫司汀、白消胺、tiottepat、卡莫司汀、洛莫司汀、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟尿嘧啶，长春花碱，长春新碱，长春地辛、依托泊苷，替尼泊苷、放线菌素D(Dactinomucin)doxorubin、(dunorubicine)、表柔比星、博来霉素、nitomycin、顺铂、卡铂、丙卡巴肼、amacrine、咪托蒽醌、它莫西芬、nilutamid、和aminoglutemide。应用这些化合物来治疗恶性疾病的方法已经很好的建立起来。此外，其他癌症治疗化合物也可与本发明中的化合物结合使用。
本发明考虑了对多种病毒性疾病的治疗。下文所列的仅仅是本发明中的化合物能够有效治疗的一些病毒性疾病部分示例。其中有多种由单纯疱疹病毒或带状疱疹病毒引起的疱疹疾病，这些疱疹包括菌部疱疹生殖器疱疹、唇疱疹、包皮疱疹、herpes progenitalis、herpesmenstrualis、herpetic keratitis、疱疹脑炎、眼带状疱疹以及带状疱疹病毒。本发明对上述疾病都能进行有效的治疗。
本发明的另一方面表明其在对引起肠道疾病，如轮状病毒导致的疾病，的病毒进行的抵抗方面是有效的。
在另一方面，本发明可有效的抵抗多种血液感染。例如黄热病，登革热、埃博拉病毒、Crimean-Congo出血性热、汉坦病毒疾病、单核细胞增多症和HIV/AIDS。
本发明的另一方面涉及多种引起肝炎的病毒。这些病毒的一个具有代表性的群体包括甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒。
还是在另一方面，本发明有效抵抗了病毒感染引起的呼吸道疾病。示例包括鼻病毒感染(普通的感冒)、腮腺炎、风疹、水痘、B型流感、呼吸道合胞病毒感染、麻疹、急性发热性咽炎、咽结膜性热以及急性呼吸性疾病。
本发明的另一方面考虑和对多种癌症相关的病毒的处理方法，这些病毒包括成人T细胞白血病/淋巴瘤(HTLVS)、鼻咽癌、Burkitt’s淋巴瘤(EBV)、宫颈癌、肝细胞癌。
在进一方面，本发明在治疗病毒介导的脑炎方面是有效的，这些脑炎包括St Louis脑炎、Western脑炎、以及脾传性脑炎。
本发明中的方法可单独或与其他抗病毒治疗方法结合使用。当与其他抗病毒化学治疗法结合使用时，可对ROM抑制性化合物和细胞毒性淋巴细胞活化化合物与一种或多种抗病毒药物结合给药。计量、给药途径和使用方法以及对这些药剂的给药都是应用本领域中众所周知的方法。在抗病毒化学治疗中应用的代表性化合物包括碘苷、三氟胸苷、阿糖腺苷、无环鸟苷(acycloguanosine)、溴乙烯基脱氧尿苷、利巴韦林，trisodium phosphophonoformate、金刚烷胺、金刚乙胺、(S)-9-(2，3-二羟丙基)腺苷、4’，6’-二氯黄烷、AZT、3’-(叠氮-3’-脱氧胸苷)、更昔洛韦、didanosine(2’，3’-二脱氧肌苷或ddI)、zalcitabine(2’，3’-二脱氧胞苷或ddc)、二脱氧腺苷(ddA)、nevirapine、HIV蛋白酶抑制剂、以及其他病毒蛋白酶抑制剂和其他蛋白酶抑制剂。
本发明还考虑将抗癌和抗病毒药物的结合物与ROM抑制性化合物结合给药。
虽然没有意图来限制本发明，但是我们认为本发明中的方法是通过改变抗原呈递机制来提高细胞毒性淋巴细胞活性的。一种理论认为，同时是抗原呈递细胞(APC)的单核细胞/巨噬细胞向T细胞的抗原呈递受到了抑制。这种抑制可能是由来产生ROM的MO代谢途径产生的，而ROM又抑制了MO抗原呈递代谢途径，在MO群体中产生了互斥抗原呈递或ROM产生状态。MO抗原传递的一个结果是T细胞在没有传递过来的抗原和ROM存在的情况下保持休眠状态。
按照这种理论，ROM产生和释放抑制性化合物，如组胺的给药的作用就是通过增加抗原的呈递来提高T细胞的活性。在有益浓度的组胺存在下，单核细胞产生的ROM具有一个开启的分子开关，从而造成对ROM产生的负调节。在上述的互斥代谢状态假说中，对ROM产生的负调节导致随后抗原呈递途径的增加，从而导致了抗原呈递的增加。相应的，在基于抗原的T-细胞活化剂，如疫苗存在的情况下，对组胺给药将降低ROM的生产和增加抗原的传递，从而将有助于提高T细胞活性。
在另外一种理论中，对ROM抑制剂给药可去除ROM诱导的细胞毒性淋巴细胞抑制作用，导致细胞毒性淋巴细胞活性提高。
下面讨论的例子应用了本发明的学说，表明单核细胞/巨噬细胞(MO)，尤其是MO衍生的活性氧代谢物(ROMs)有效的抑制了人细胞毒性淋巴细胞的活化，即使是在体外对细胞毒性淋巴细胞活化化合物如INF-α或IL-2给药之后。此外，结果显示当将ROM抑制性化合物添加到淋巴细胞和MO的混合物中时，ROM抑制性化合物对细胞毒性淋巴细胞给予了保护。
为了确定本发明中的多种化合物对T细胞群的效应，我们对那些可在成人细胞毒性淋巴细胞表面诱导表达的多种细胞毒性淋巴细胞的表达进行了研究。观察结果显示，在无ROM抑制性化合物存在的情况下，MO明显抑制了细胞因子诱导的细胞毒性淋巴细胞活化，这个结果是通过CD69或其他标记物与代表性细胞因子如IL-2或INF-α共培育之后的结果来反映的。然而，添加这样的ROM抑制性化合物有效的逆转了我们观察到的MO抑制效应。我们也做了一些额外的工作，研究了组胺在人细胞毒性淋巴细胞对预防体外流感病毒的多价疫苗增殖应答上的效应。在这些实验中，对组胺的给药表明，在抗原和单核细胞存在的情况下，它增强了淋巴细胞的增殖。示例通过提及下列旨在例示本发明的示例，会更易于理解本发明的一些特定方面，但本发明并不将其范围局限于特定的示例实施方案。
通过应用多种可导致细胞毒性淋巴细胞刺激和/或活化的细胞毒性淋巴细胞活化化合物，本发明中的方法可用于增强对细胞毒性淋巴细胞群的活化和保护。ROM抑制性化合物如DPI，在下文中有讨论。
为了证明这些化合物的活化和保护特性，我们将淋巴细胞(包括NK细胞和T细胞)和单核细胞从捐赠的血中分离开，并且检验了当他们暴露于多种细胞毒性淋巴细胞活化化合物如IL-2和/或INF-α、疫苗、疫苗助剂或其他免疫刺激化合物、多种ROM抑制性化合物如DPI、组胺，以及多种过氧化氢清除剂如过氧化氢酶时的活化特性。
从sweden Sahlgren’s Hospital血液中心的健康供体中获得了新鲜制备的LEUCOPACK形式的外周静脉血，以此来研究在MO和ROM抑制剂存在和不存在的情况下，细胞毒性淋巴细胞的活化特性。将血液(65ml)与92.5ml Iscove’s培养基、35ml 6％的Dextran(KabiPharmacia，Stockholm，Sweden)以及7.5ml柠檬酸右旋糖(ACD)(Baxter，Deerfield，lllinois)混合。在室温下培育15分钟后，上清液在Ficoll-Hypaque(Lymphoprep，Myegaard，Norway)上小心分层。经过室温下转速为380g离心15分钟后，在分界面处收集单核细胞(MNC)，在PBS缓冲液中冲洗两次，重新悬浮在添加有10％人AB+血清的Iscove’s培养基中。在对细胞进一步分离的过程中，将细胞悬浮液保存在硅化试管(Vacuette，Greiner，Stockholm)中。
通过利用对最初由yasaka和他的合作者描述的逆流离心淘选(CCE)技术(Yasaka，T.et al.，J.lmmunol.，1271515)做了修改之后的CCE技术将MNC进一步分离为淋巴细胞和单核细胞(MO)，其中对CCE所做的修改Hansson等(J.lmmunol.，15642(1996))已有描述。简单的讲，将MNC重新悬浮在含有0.05％BSA和含有利用氯化钠缓冲溶液配制的0.015％EDTA的淘选缓冲溶液，然后将其在BeckmanJ2-21超速离心机中离心，转子为JE-68B型转子，转速为2100rpm。以18毫升/分钟的流速获得了MO含量大于90％的部分。以14-15毫升/分钟的流速回收了富含NK细胞(CD3-/56+表型)和T细胞(CD3+/56+)的淋巴细胞部分。这部分含有小于3％的MO，其组成为CD3ε+/56-NK细胞(45-50％)、CD3ε+/56-T细胞(35-40％)、CD3ε+/56-细胞(5-10％)以及CD3ε+/56+细胞(1-5％)，这是通过血细胞得来的数据。在一些实验中，使用包被有抗CD56-的dynabead(Dynal A/S，Os/O，Norway)来获得纯化的T细胞淋巴细胞制剂，上述的Hansson等在这方面有详述。
在上述的分级分离之后，将T细胞和NK细胞的淋巴细胞混合物置于下述的多种实验条件中，并且通过作为活化标记的特定细胞表面蛋白的出现来对其活化进行检测。
通过定位在细胞表面的特定蛋白可对淋巴细胞进行检测。不同的细胞表面蛋白定位在不同淋巴细胞和处于不同活化阶段的淋巴细胞表面上。已经将这些蛋白归类为CD类或‘分化簇’，并且他们可用做多种不同类型细胞的标记物。对不同表面蛋白特异的标记抗体结合到CD标记的表面，这样他们就可用于鉴别不同类型的T细胞和他们各自的活化阶段。
在下面描述的实验中，CD3、CD4、CD8、CD69和CD56(一种NK细胞标记物)可检测我们所需的细胞毒性淋巴细胞。CD3组抗体对在所有外周T细胞上表达的标记物是特异的。CD4组抗体特异于II型MHC限制性T细胞，而II型MHC限制性T细胞又叫做辅助T细胞。CD8组抗体识别定位于I型MHC限制性T细胞之上，而I型MHC限制性T细胞又叫做CTLs或溶细胞T细胞。CD69细胞识别活化的T细胞和其他活化的免疫细胞。最后，CD65组抗体可识别在NK细胞表面的异源二聚物。
在下面描述的实验中，流动血细胞记数可用来鉴别T细胞的多种亚群。流氏细胞仪使得研究人员能通过多种标记探针在大范围内区分各个亚群。在这些实验中，CD3标记物是用来检测T细胞亚群的，而CD4和CD8标记物可用来将T细胞亚群进一步分为辅助T细胞和CTLs。在存在组胺和T细胞活化化合物和不存在组胺和T细胞活化化合物的情况下，就可通过CD69 T细胞活化标记来确定MO暴露引起的效应。利用流氏细胞仪就在一个淋巴细胞离子通道闸门中对不同标记物的表达进行估计(as described in Hellstrand，K.，etal.Cell.lmmunol.13844-54(1991))。
前面的使用方法是用于实验中来报告细胞群表面抗原的。将一百万个细胞与适当的异硫氰酸荧光素(FITC)和藻红蛋白(PE)共轭单克隆抗体在冰上进行30分钟的共培育(Becton &Dickinson，Stockholm，Sweden；1μl/106cells)。用PBS将细胞冲洗两次，然后冲洗悬浮在500ul的无菌过滤PBS中，通过连有已配备了Lysys II软件程序(Becton & Dickenson)的FACSort的流氏细胞仪来进行分析。淋巴细胞是呈前倾角和直角散射的。将流速调整为小于200细胞xs-1，并且如果没有特别声明的话，每个样品至少要分析5000个细胞。示例1
为了确定DPI和组胺是否能够抑制MO中ROM的自发释放，我们进行了化学发光检测来对ROM(超氧离子)进行特异性定量。我们利用Hellstrand，K等在J Immunol 153期4940-4947(1994)页上的文章中和Lundqvist与Dahlgren在Free Radic.Biol.Nod第20期785-792页(1996)上的文章中描述过的方法来检测淘选过的MO中自发性等点发光增强细胞外超氧离子生成。在DPI浓度为10nM时，我们观察到细胞外超氧离子的释放降低了4倍还要多，在对从三个血液捐赠者身上采取的血样进行的三个实验中，我们也观察到了相似的结果。相似的是，在模型实验中，组胺(50uM)抑制的细胞外超氧离子浓度要高出他的浓度5倍多。而相同摩尔浓度的ranitidine可将组胺产生的效果完全拮抗。示例2MO能够降低分子氧浓度并产生ROM(呼吸爆发)，这两种情况可以是自发的和在对特定可溶的或颗粒药剂刺激的应答时产生(seeKlebanolff，S.J.，Adv.Host Def.Mech.1111-151(1982))。在研究从对IL-2作出应答的T细胞和NK细胞上获得的CD69时，我们将DPI，一种NADPH氧化酶活性抑制剂(Miesel，R.，etal.，Free.Radic.Biol 2075-81(1996))，添加到淋巴细胞和MO的混合物中。利用培养基或IL-2(100U/ml)对MO和淋巴细胞混合物进行6个小时的处理。培育后，将淋巴细胞用CD3ε和CD69标记。数据结果显示了CD69在活T细胞(CD3ε)中的表达，也显示了具有减少的前倾散射和增加的边角散射死亡特征的T细胞的百分数。在检查CD69细胞在CD56+中表达时也获得了相似的结果。NK细胞与含有29.5％(对照)或79％(DPI 1000nM)NK细胞的MO共培育，而所用的NK细胞在对IL-2作出应答时可获得CD69抗原。在没有MO存在下温孵T细胞或NK细胞中，DPI没有增加IL-2诱导的CD69表达。DPI显著的逆转了MO诱导的T细胞(图1)和NK细胞(未出示)抑制。MO也产生了活性氮中间物，其中氧化氮(NO)是其最终效应分子，并且DPI也是NO合成酶的抑制剂(Miesel，R.，etal.，Free.Radic.Biol 2075-81(1996))。为了研究MO中NO诱导是否有助于观察T细胞和NK细胞对IL-2的无反应性，我们选用了NO合成酶抑制剂N-单甲基-L-精氨酸(L-NMMA)来进行实验。在使用浓度足以抑制MO中NO合成的情况下(Hansson，M，et al.，Jlmmunol.15642-47(1996))，这种化合物并没有影响MO诱导的T细胞和NK细胞抑制。过氧化氢酶，一种过氧化氢清除剂，在浓度超过50U/ml时，就能显著的逆转T细胞和NK细胞中MO诱导的对IL-2诱导的CD69表达的抑制，然而，超氧化物歧化酶，一种超氧离子清除剂，在足以清除大于90％超氧离子的浓度(200U/ml)时却没能产生这样的逆转效用。示例3与在inter alia_T细胞(Alderson，M.R.，et al.，J ExpMod.18171-77(1995))和NK细胞(Medvedev，A.E.，et al.，Cytokine9394-404(1997))上表达的Fas受体(CD95L)作用之后，Fas配体可引发多种类型细胞的凋亡。为了评定FasL/Fas相互作用在观察到的氧化诱导凋亡中的作用，我们选用了一种Fas配体抑制剂，这种抑制剂可融合到人IgG1的Fc片段上，其包含有人Fas细胞外结构域(aa1-154)。FasFc-IgG1融合蛋白在一定浓度(20ug/ml)已足以减少大于60％FasL介导的、活化诱导的T细胞凋亡，但并不影响T细胞或NK细胞中MO诱导的对IL-2的无反应性或MO诱导的细胞凋亡(表1)。
表1 T细胞和NK细胞中FasL/Fas非依赖型无反应性和凋亡
A从外周血中回收淋巴细胞和MO，用表1的图注中描述的抗CD3ε、抗CD56和抗CD69进行标记，并且利用流氏细胞仪来分析各自的表型。DPI浓度为100nM，FasFc-IgG1浓度为20ug/ml。B利用含有降低的前倾散射和增加的直角散射的淋巴细胞离子通道闸门，通过流氏细胞仪来检测细胞凋亡。在三个单独实验中得到了相似的结果。示例4以药物上可接的形式、以大约0.2-2.0mg或3-10μg/kg的剂量将溶解于无菌载体溶液中的DPI皮下注射入需要增强T细胞活性的患者体内，在这样的情况下，患者往往是患有恶性疾病。伴随的，在第1-5和8-12天时，W.IL-2，如人重组IL-2(Proleukin?，Eurocetus)以27g/kg/天的剂量进行皮下注射或持续灌输。这个剂量代表了IL-2的总剂量，这个剂量要比本领域中的熟练技术人员的给药量低的多。
上述的方法一直重复4-6个星期，直至观察到肿瘤疾病的真实衰退。甚至在观察到部分或完全的应答之后，这样的治疗还可继续。对产生了完全应答的患者来说，在治疗周期间，这样的治疗可以有更长的时间间隔。
这样的治疗也包括周期性的提高血液DPI水平，这是通过每天注射1次、2次或更多次剂量为0.2-2.0mg或3-10ug/kg的DPI，，并且在有规律间隔时间内持续1到2周这样的方式来实现的，例如，每天注射一次、每两周注射一次、或每周注射一次以使血液血液DPI稳定在有益的浓度上。DPI和化学治疗药物的联合使用DPI也可与化学治疗药物联合使用来治疗肿瘤性疾病或病毒性疾病。在旨在加快细胞毒性淋巴细胞活化和保护的化学治疗前、治疗中、治疗后和贯穿整个化学治疗过程中，通过DPI给药可消除单核细胞介导的抑制。
用于癌症和抗病毒治疗的代表性化合物在上文有叙述。其他的癌症和病毒性疾病治疗化合物也可用在本发明之中。相似的，本发明的治疗方法可有效抵抗的、因而可进行指导治疗的恶性疾病和病毒性疾病在上文也有叙述。应该指出的是，对于本领域中的熟练技术人员来讲，这些抗癌症和抗病毒化合物的给药量、给药途径和剂量准则都是已知的。本发明的目的直接指向提高这些化合物效率和优化他们的治疗结果。因此，我们认为，将他们的传统使用方法与本发明中的化合物和使用方法相结合就足以获得我们想要的治疗效果。
已经证明，将组胺和IL-2结合来活化NK细胞是在治疗骨髓性白血病方面与传统化学治疗方法的有效结合。(Brune andHellstrand，Br.J.Haematology，92620-626(1996)。示例5对由于肿瘤性疾病和/或病毒性感染如乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头状瘤病毒(HPV)、1型或2型单纯疱疹病毒(HSV)、或其他病毒感染而需要增强细胞毒性淋巴细胞活性的患者来讲说，可以通过在第1-5和8-12天时，以27g/kg/天的剂量，进行皮下注射或持续注人重组IL-2输注的方法(Proleukin?Eurocetus)来治疗。此外，患者还可以一个合适的给药途径，例如皮下注射，来以6×106U的日剂量进行干扰素给药治疗。这样的治疗也包括与IL-2和/或干扰素给药相结合的、每天注射1次、2次或更多次剂量为0.2-2.0mg或3-10μg/kg的DPI给药治疗。
上述方法可持续4-6周，直至观察到肿瘤衰退，或直至病毒感染有改进。甚至在第一次、第二次或随后的症状完全减轻后继续治疗。对于产生了完全应答的患者来讲，在治疗周期中可给予两次这样的治疗更长的时间间隔。
这样的治疗也包括周期性的加强患者血液DPI水平，这是通过每天注射1次、2次或更多次剂量为0.2-2.0mg或3-10ug/kg的DPI，，并且在有规律间隔时间内持续1到2周这样的方式来实现的，例如，每天注射一次、每两周注射一次、或每周注射一次以使血液血液DPI稳定在一个有益的浓度，如高于0.2μm/l.。
此外，干扰素给药的频率也是变化的，这要依赖于患者对治疗的耐受程度和治疗的有效性。例如，干扰素的给药可以每周三次，或甚至每天一次的频率持续24个月。那些本领域中的熟练技术人员对干扰素治疗的变化都很熟悉，这样就不仅可以收到好的治疗效果，而且使患者舒适一些。示例6症状第一次、第二次、随后的或完全的减轻的，患有AML的患者接受IL-2[35-50g(相当于6.3-9×105IU)，皮下注射，每天两次]为期21天的治疗，在3-6个星期的间隔之后重复治疗，直到复发。在#1周期中，患者接受为期3周。由16mg/m2/天阿糖胞苷、40mg/天硫鸟嘌呤组成的低剂量化学治疗。伴随的，对患者每天两次皮下注射0.2-2.0mg或3-10μg/kg药物上可接受形式的DPI，以此将循环DPI的浓度提高到有益水平(在0.2m/l以上)。在IL2治疗过程中，通过每天两次对以ROM抑制性化合物的药物上可接受形式存在的、剂量为0.2-2.0mg或3-10ug/kg的DPI给药，可持续将DPI浓度提高到一个有益的水平。然后，患者允许有3-6周的休息时间。
在第一个治疗周期(#1治疗周期)结尾之后，第二个治疗周期(#2治疗周期)开始。每天两次对存在于无菌载体溶液中的、ROM的药物上可接受的形式进行注射，注射方式是皮下注射，给药剂量为0.2-2.0mg或3-10ug/kg。阿糖胞苷(16mg/m2/天)和硫鸟嘌呤(40mg/天，口服)给药期为21天(或直至血小板记数50×109/L)。在第二个星期，患者接受每天两次、每次注射剂量为0.2-2.0mg或3-10ug/kg的药物上可接受形式的DPI给药来提高DPI至一有益水平。在为期三周的化学治疗的最后，患者接受为期一周的、每天两次、每次注射剂量为0.2-2.0mg或3-10ug/kg的药物上可接受形式的DPI给药。然后患者接受为期3周的IL-2给药。然后患者允许有3-6周的休息时间。
随后，#3治疗周期开始。#3治疗周期与#2治疗周期完全相同。
此外，这样的治疗也包括周期性的提高血液DPI水平，这是通过每天注射1次、2次或更多次剂量为0.2-2.0mg或3-10ug/kg的DPI，，并且在有规律间隔时间内持续1到2周这样的方式来实现的，例如，每天注射一次、每两周注射一次、或每周注射一次以使血液血液DPI获得一个有益的浓度。讨论此处提供的数据表明MO抑制了细胞毒性淋巴细胞的活化。细胞毒性淋巴细胞活化的MO抑制看来是通过ROM的形成来介导的。上文讨论的实验表明，通过添加ROM抑制性化合物如DPI可逆转细胞毒性淋巴细胞的MO抑制。这些结果表明细胞毒性淋巴细胞的活化是从MO抑制的负调节中受益的。结论虽然我们详细叙述了一些特定的实施方案，但是对本领域中的熟练技术人员来讲，这些实施方案只是来例解本发明的，而不是来限制本发明的。因此，所有的文献也通过引用包括在内。
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1.一种含diphenylionodonium(DPI)的组合物，可用于在单核细胞(MO)存在的情况下，活化和保护细胞毒性淋巴细胞的方法中，这些方法包括检测一个个体是否需要增强细胞毒性淋巴细胞活性；对患者给药以有效剂量的diphenylionodonium(DPI)以在MO存在的情况下，活化和保护细胞毒性淋巴细胞的功能。
2.权利要求1中的组合物，进一步包括可以有效剂量对患者给药的细胞毒性淋巴细胞刺激性组合物，其中，该细胞毒性淋巴细胞刺激性组合物是选自由疫苗助剂、疫苗、肽、细胞因子和黄酮类化合物组成的组。
3.权利要求2中的组合物，其中该细胞毒性淋巴细胞刺激性组合物是疫苗助剂，选自由卡介苗(BCG)芽孢杆菌、百日咳毒素(PT)、霍乱毒素(CT)、大肠杆菌热不稳定毒素(LT)、分支杆菌71KD细胞壁结合蛋白、微乳MF59、多聚(lactide-co-glycolides)微粒(PLG)、以及免疫刺激复合体(ISCOMS)组成的组。
4.权利要求2中的化合物，其中细胞毒性淋巴细胞刺激性化合物是疫苗，选自由流感疫苗、人免疫缺陷病毒疫苗、肠炎沙门氏菌疫苗、乙肝疫苗、Boretella bronchiseptica疫苗、结核病疫苗、同种异基因癌症疫苗和自体癌症疫苗组成的组。
5.权利要求2中的组合物，其中的细胞毒性淋巴细胞刺激性组合物是细胞因子，选自由IL-1，IL-2，IL-12，IL-15，IFN-α，IFN-β，或IFN-γ组成的组。
6.权利要求2中的组合物，其中的细胞毒性淋巴细胞刺激性组合物是黄酮类化合物，选自由黄酮乙酸和呫吨酮-4-乙酸组成的组。
7.权利要求2中的组合物，其中该细胞毒性淋巴细胞的日给药剂量是1000-600,000U/kg。
8.权利要求1中的组合物，进一步包括有效剂量的一些化合物，这些化合物可抑制细胞间活性氧代谢物(ROM)的产生和释放，这些化合物选自由组胺、二盐酸组胺、磷酸组胺、血清素、dimaprit、可乐定、妥拉唑林、impromadine、4-甲基组胺、倍他唑、组胺同源化合物组成的组。
9.权利要求8中的组合物，其中该有效剂量为0.05-50mg/剂。
10.权利要求8中的组合物，其中该有效剂量为1-500μg/kg患者体重。
11.权利要求1中的组合物，其中给药该细胞毒性淋巴细胞刺激性组合物，以及给药有效剂量的可抑制细胞间活性氧代谢物(ROM)的化合物在1小时之内进行。
12.权利要求1中的组合物，其中给药该细胞毒性淋巴细胞刺激性组合物，以及给药有效剂量的可抑制细胞间活性氧代谢物(ROM)的化合物在24小时之内进行。
13.权利要求8中的组合物，其中该细胞间活性氧代谢物是过氧化氢。
14.权利要求13中的组合物，进一步包括有效剂量的细胞间过氧化氢清除剂。
15.权利要求14中的组合物，其中的清除剂是选自由过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶组成的组。
16.权利要求14中的组合物，其中该过氧化氢清除剂的给药剂量为0.05-50mg/天。
17.权利要求14中的组合物，其中该有效剂量的DPI、该细胞毒性淋巴细胞刺激性组合物和该过氧化氢清除剂是分别给药的。
18.权利要求1中的组合物，进一步包括化学治疗药物。
19.权利要求18中的组合物，其中的化学治疗药物包括抗癌药物，它是选自一个组中，这个组是由环磷酰胺、苯丁酸氮芥、美法仑、雌莫司汀、iphosphamide、泼尼莫司汀、白消胺、tiottepat、卡莫司汀、洛莫司汀、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟尿嘧啶，长春花碱，长春新碱，长春地辛、依托泊苷，替尼泊苷、放线菌素D(Dactinomucin)doxorubin、dunorubicine、表柔比星、博来霉素、nitomycin、顺铂、卡铂、丙卡巴肼、amacrine、咪托蒽醌、它莫西芬、nilutamid、和aminoglutemide组成。
20.权利要求18中的组合物，其中的化学治疗药物包括抗病毒药物，这些抗病毒药物是选自一个组，这个组是由碘苷、三氟胸苷、阿糖腺苷、无环鸟苷(acycloguanosine)、溴乙烯基脱氧尿苷、利巴韦林，trisodium phosphophonoformate、金刚烷胺、金刚乙胺、(S)-9-(2，3-二羟丙基)腺苷、4’，6’-二氯黄烷、AZT、3’-(叠氮-3’-脱氧胸苷)、更昔洛韦、didanosine(2’，3’-二脱氧肌苷或ddI)、zalcitabine(2’，3’-二脱氧胞苷或ddc)、 二脱氧腺苷(ddA)、nevirapine、HIV蛋白酶抑制剂、以及其他病毒蛋白酶抑制剂组成。
21.权利要求18中的组合物，其中的药剂包括该DPI、该细胞毒性淋巴细胞刺激性组合物，以及该与单独药剂相结合的化学治疗药物。
22.用来在单核细胞(MO)存在的情况下活化和保护细胞毒性淋巴细胞的方法，它包括检测一个个体是否需要增强细胞毒性淋巴细胞活性；以及对患者给药以有效剂量的diphenylionodonium(DPI)以在MO存在的情况下，活化和保护细胞毒性淋巴细胞的功能。
23.权利要求22中的方法，进一步包括对个体给药以有效剂量的细胞毒性淋巴细胞刺激性组合物，该细胞毒性淋巴细胞刺激性组合物是选自由疫苗助剂、疫苗、肽、细胞因子和黄酮类化合物组成的组。
24.权利要求23中的方法，其中该细胞毒性淋巴细胞刺激性化合物是疫苗助剂，选自由卡介苗(BCG)芽孢杆菌、百日咳毒素(PT)、霍乱毒素(CT)、大肠杆菌热不稳定毒素(LT)、分支杆菌71KD细胞壁结合蛋白、微乳MF59、多聚(lactide-co-glycolides)微粒(PLG)、以及免疫刺激复合体(ISCOMS)组成的组。
25.权利要求23中的方法，其中细胞毒性淋巴细胞刺激性化合物是疫苗，选自由流感疫苗、人免疫缺陷病毒疫苗、肠炎沙门氏菌疫苗、乙肝疫苗、Boretella bronchiseptica疫苗、结核病疫苗、同种异基因癌症疫苗和自体癌症疫苗组成的组。
26.权利要求23中的方法，其中的细胞毒性淋巴细胞刺激性组合物是细胞因子，选自由IL-1，IL-2，IL-12，IL-15，IFN-α，IFN-β，或IFN-γ组成的组。
27.权利要求23中的方法，其中的细胞毒性淋巴细胞刺激性组合物是黄酮类化合物，选自由黄酮乙酸和呫吨酮-4-乙酸组成的组。
28.权利要求23中的方法，其中该细胞毒性淋巴细胞的日给药剂量是1000-600,000U/kg。
29.权利要求22中的方法，进一步包括有效剂量的一些化合物，这些化合物可抑制细胞间活性氧代谢物(ROM)的产生和释放，这些化合物选自由组胺、二盐酸组胺、磷酸组胺、血清素、dimaprit、可乐定、妥拉唑林、impromadine、4-甲基组胺、倍