专利名称：唾液乳杆菌及其代谢物的制备方法和组合物以及应用的制作方法唾液乳杆菌为革兰氏染色阳性的无芽孢杆菌，广泛分布于含有碳水化合物的动植物发酵产品中，也见于温血动物的口腔、阴道和肠道内，在植物体表、乳制品、肉制品、啤酒、葡萄酒、果汁、麦芽汁、发酵面团、污水以及人畜粪便中，均可分离到。该菌分解糖的能力较强，分解蛋白质类的能力较低。一些如泡菜、腌菜、酒和酸奶食品生产过程中广泛用到该菌。CN 101538545A公开了唾液乳杆菌的一种菌株，以及包含该菌株的食品组合物，并且公开了该菌株能够刺激免疫并具有92. 91%的体外脱除4-硝基喹啉-I-氧化物(4-NQ0)的基因毒性的能力。但实验证明，该菌株在体内脱除4-NQ0的基因毒性较低。
为了进一步在体内脱除4-NQ0的基因毒性，本发明的发明人筛选到特定的一株唾液乳杆菌的菌株，实验证明该菌株具有较高的体内脱除4-NQ0的基因毒性的能力，由此得到本发明。本发明提供了一种唾液乳杆菌，该唾液乳杆菌属于唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillus salivarius subsp. Salivarius),于 2010 年 I 月 22 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO 3606o本发明进一步提供了上述唾液乳杆菌的代谢物。本发明进一步提供了上述唾液乳杆菌的代谢物的制备方法，所述唾液乳杆菌为如上所述的唾液乳杆菌，该方法包括在能使所述唾液乳杆菌存活的条件下，使所述唾液乳杆菌的活菌体与液相介质接触，得到接触后的产物，并且分离接触后的产物中的液相产物。本发明进一步提供了一种组合物，该组合物含有如上所述的唾液乳杆菌的活菌体和/或如上所述的方法制备的唾液乳杆菌的代谢物作为活性成分。本发明进一步提供了上述唾液乳杆菌在制备用于预防和/或治疗癌症的药物或功能食品中的应用，所述药物或功能食品含有如上所述的唾液乳杆菌的活菌体和/或如上所述的唾液乳杆菌的代谢物作为活性成分。本发明还提供了一种治疗和/或预防癌症的方法，该方法包括使用如上所述的组合物制备预防和/或治疗癌症的制剂，并将所述制剂施用于有需要的对象。本发明提供的唾液乳杆菌能够经过培养产生大量活菌体，也能够通过新陈代谢活动产生代谢物。所述唾液乳杆菌的活菌体和所述唾液乳杆菌的代谢物均能在体内脱除4-NQ0的基因毒性。并且含有唾液乳杆菌的活菌体和/或所述唾液乳杆菌的代谢物的组合物能够有效地起到预防和/或治疗癌症的作用，特别是能够有效地起到预防和/或治疗消化道癌症的作用。 本发明的其他特征和优点将在随后的部分予以详细说明。进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。为了进一步在体内脱除4-NQ0的基因毒性，本发明提供了一种唾液乳杆菌，该唾液乳杆菌是该唾液乳杆菌属于唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillussalivarius subsp.Salivarius)，于2010年I月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO 3606o本发明提供的唾液乳杆菌能够经过培养产生大量唾液乳杆菌的活菌体，所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述唾液乳杆菌增殖即可，例如可以将IO7量级的菌株接种于乳杆菌培养基，并且在厌氧或好氧条件下，在15-38°c的温度下培养8-72小时后，得到培养液。所述乳杆菌培养基可以为公知的各种适合乳杆菌培养的培养基，例如可以为乳汁和/或《乳酸菌一生物学基础及应用》(杨洁彬，轻工业出版社，1996年出版)中所述的乳酸菌(MRS)培养基。本发明可以进一步分离上述培养液中的唾液乳杆菌的活菌体，所述分离的方法没有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条件，本发明在此不再赘述。本发明进一步提供了上述唾液乳杆菌的代谢物。其中，所述的“代谢物”的概念是指所述唾液乳杆菌通过新陈代谢活动产生的物质。本发明进一步提供了上述唾液乳杆菌的代谢物的制备方法，所述唾液乳杆菌可以为如上所述的唾液乳杆菌，该方法可以包括在能使所述唾液乳杆菌存活的条件下，使所述唾液乳杆菌的活菌体与液相介质接触，得到接触后的产物，并且分离接触后的产物中的液相产物。其中，能使所述唾液乳杆菌存活的条件没有特别的要求，只要是能使所述唾液乳杆菌维持生命活动即可，例如《乳酸菌——生物学基础及应用》(杨洁彬，轻工业出版社，1996年出版)中所述的条件。其中，所述唾液乳杆菌的活菌体与所述液相介质之间的用量比没有特别的要求，可以是获得活菌体代谢物常用的选择，为了获得较多的代谢物，优选情况下，相对于IO6CFU的所述唾液乳杆菌的活菌体，液相介质的用量为O. 5-100ml，进一步优选为l-10ml。其中，所述接触的接触时间没有特别的要求，只要是能让活菌体的代谢物分散于所述液相介质中即可，为了获得较多的代谢物，优选情况下，所述接触的接触时间为O. 3-10小时，进一步优选为1-5小时。其中，所述液相介质选择没有特殊要求，只要是能使得活菌体维持产生代谢物的活动并能分散代谢物即可，为了获得较多的代谢物，优选情况下所述液相介质为水、生理盐水和磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的一种或多种。为了避免盐离子对代谢物的生物活性的影响，进一步优选所述液相介质为水。所述生理盐水和磷酸盐缓冲溶液的组成已为本领域公知，本发明在此不再赘述。所述液相产物可以直接作为唾液乳杆菌的代谢物，也可以将所述液相产物浓缩或干燥后得到的产物作为唾液乳杆菌的代谢物。本发明进一步提供了一种组合物，该组合物含有如上所述的唾液乳杆菌的活菌体和/或如上所述的方法制备的唾液乳杆菌的代谢物作为活性成分。其中，以所组合物的总重量为基准，所述唾液乳杆菌的活菌体的含量可以为
105-1010CFU/g,进一步优选为106-109CFU/g。其中，以所组合物的总重量为基准，所述唾液乳杆菌的代谢物中的干物质的重量计算，所述唾液乳杆菌的代谢物的含量为O. 1-99. 9重量％，进一步优选为1-99重量％，更进一步优选为10-90重量％。本发明中，干物质是指有机体在10°C -90°C的恒温下，充分干燥，余下的物质的重量。符合上述要求的组合物可以包括所述唾液乳杆菌的培养液(例如经该唾液乳杆菌发酵制得的发酵乳制品)、分离的所述唾液乳杆菌的活菌体、使所述唾液乳杆菌的活菌体与所述液相介质接触后的产物、去除接触后的产物中的固相物质得到的液相产物以及将所述液相产物进一步浓缩或干燥后得到的浓缩产物或干燥产物中的一种或多种。所述组合物可以为功能食品组合物，该功能食品组合物含有作为活性成分的所述唾液乳杆菌的活菌体和/或所述唾液乳杆菌的代谢物和食物。一般地，以所组合物的总重量为基准，所述唾液乳杆菌的活菌体的含量可以为105-101(lCFU/g，进一步优选为
106-109CFU/g;和/或，以所述组合物的总重量为基准，所述唾液乳杆菌的代谢物中的干物质的重量计算，所述唾液乳杆菌的代谢物的含量为O. 1-99. 9重量进一步优选为1-99重量％，更进一步优选为10-90重量％。所述食物可以是任意类型的食物，例如果汁制品、乳制品、豆制品等。所述功能食品组合物中还可以含有常规的添加剂，例如香料、矿物质、维生素、稳定剂、增稠剂、防腐剂等。所述组合物可以为药物，该药物含有作为活性成分的所述唾液乳杆菌的活菌体和/或所述唾液乳杆菌的代谢物和药学可接受的佐剂。该药物可以为常规的各种剂型，例如普通片剂或糖包衣片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、滴剂、颗粒剂、软膏剂、乳膏或凝胶剂。可以根据所要配制的剂型，选择合适的佐剂的种类。可以根据所述唾液乳杆菌的活菌体和/或所述唾液乳杆菌的代谢物的有效量来设定其在药品中的含量。所述唾液乳杆菌的活菌体和/或所述唾液乳杆菌的代谢物的有效量根据服用者的年龄和身体状况而不同，优选的范围包括对所述唾液乳杆菌的活菌体而言，为IO5-IO12CFU/千克体重·天；对所述唾液乳杆菌的代谢物的有效量而言，以所述唾液乳杆菌的代谢物的干物质的量计，为IO-IOOOOmg/千克体重·天。一般地，以所组合物的总重量为基准，所述唾液乳杆菌的活菌体的含量可以为105-101QCFU/g，进一步优选为106-109CFU/g ;和/或，以所述组合物的总重量为基准，所述唾液乳杆菌的代谢物中的干物质的重量计算，所述唾液乳杆菌的代谢物的含量为O. 1-99. 9重量％，进一步优选为1-99重量％,更进一步优选为10-90重量％。本发明提供的上述组合物可以用于制备用于预防和/或治疗癌症的药物或功能食品。本发明提供的上述组合物可以用于制备预防癌症的功能食品，也可以用于制备预防和/或治疗癌症的药物。
其中，所述药物或功能食品含有如上所述的唾液乳杆菌的活菌体和/或如上所述的唾液乳杆菌的代谢物作为活性成分本发明还提供了一种治疗和/或预防癌症的方法，该方法包括使用如上所述的组合物制备预防和/或治疗癌症的制剂，并将所述制剂施用于有需要的对象。其中，所述癌症可以为消化道癌，例如口腔癌、食管癌、胃癌和肠癌等。
其中，所述施用的方法可以为口服或经肛门给予。本发明中，液体和气体的体积均为标准状态下的体积。以下通过实施例进一步说明本发明。实施例I本实施例用于说明本发明的唾液乳杆菌的活菌体。将唾液乳杆菌菌株用无菌接种环接种于IOL乳杆菌培养基(MRS培养基，购自上海沪峰生物科技有限公司)，并且在厌氧条件下，在37°C的温度下培养12小时后，得到培养液。将得到的培养液在4000g的速度下离心10分钟后弃去上清，得到唾液乳杆菌的活菌体。实施例2本实施例用于说明本发明的唾液乳杆菌的代谢物的制备方法。将实施例I得到的唾液乳杆菌的活菌体IO13CFU分散于2L去离子水中，在37°C下保持2小时后在4000g的速度下离心10分钟，分离得到的离心后的产物中的上清液。该上清液即为唾液乳杆菌的代谢物(干物质的含量为O. 1% )。对比例I按照实施例I相同的方法制备唾液乳杆菌的活菌体，不同的是所用的菌株为CN101538545A公开的菌株。测试例I本测试例测试实施例I和对比例I获得的活菌体和实施例2获得的代谢物在体内的脱除4-NQ0的基因毒性的能力。将FD334大鼠(体重180_220g，购自北京维通利华公司)分为6组(每组15只)，按表I所示的方案配制的饮用水喂养7周，其中，4-NQ0购自西格玛公司，然后继续正常饲养 25 周后观察口腔癌的发生率(按 WHOCollaborating Centre for Oral PrecancerousLesions, Definition ofleukoplakia and related lesions An aid to studies onoralprecancer. Leukoplakia and related lesions. 46 (4) :518-539. 1976.中描述的方法判断是否发生口腔癌)，结果列于表I。表I


本发明提供了一种唾液乳杆菌，该唾液乳杆菌属于唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillus salivarius subsp.Salivarius)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO3606。本发明进一步提供了上述唾液乳杆菌的代谢物的制备方法，所述唾液乳杆菌为如上所述的唾液乳杆菌。本发明进一步提供了一种组合物，该组合物含有如上所述的唾液乳杆菌的活菌体和/或如上所述的方法制备的唾液乳杆菌的代谢物。本发明还提供了所述组合物在制备用于预防和/或治疗癌症的药物中的应用。本发明提供的唾液乳杆菌的活菌体和唾液乳杆菌的代谢物均能在体内脱除4-NQO的基因毒性，从而起到有效地预防和/或治疗癌症的作用。