专利名称：源自杆菌属微生物的还原剂及其用途的制作方法食用肉的颜色是消费者评价肉质时的重要因素。若为鲜红色，则判断是优质的食用肉，若为褐色，则被看作是不新鲜等，肉色对消费者对于食用肉的购买意愿、评价造成很大的影响。而且，食用肉的色调反映肉中存在的肌红蛋白衍生物的比例。若此肌红蛋白被氧化，则成为高铁肌红蛋白，色调变化为褐色，成为使食用肉制品的经济价值显著下降的主要·原因。为了防止食用肉的褐变，在火腿、香肠等畜肉加工品中，一般使用硝酸盐、亚硝酸盐显色剂。但是，硝酸盐、亚硝酸盐由于具有引起高铁血红蛋白血症的急性毒性，所以使用量被限制成以残存亚硝酸根计成为70ppm以下。另外，亚硝酸被指出与仲胺反应而形成作为致癌性物质的亚硝胺的可能性。因此，从安全性的观点出发，进行了替代硝酸盐、亚硝酸盐显色剂的具有显色效果的物质、显色方法的探索。例如发现了通过添加棉子糖而防止褐变的方法(参照专利文献I)、通过添加金针菇提取物而防止褐变的方法(参照专利文献2)、利用蔬菜类中含有的成分而显色的方法(参照专利文献3)。但是,在专利文献I的方法或专利文献2的方法中显色效果不足，在专利文献3的方法中利用蔬菜类中含有的硝酸盐，安全性存在问题。另一方面，还提出了通过将肌红蛋白中的铁置换为锌来形成肌红蛋白锌原卟啉IX络合物而维持食用肉的色调的方法(专利文献4)、利用亚铁螯合酶或酵母促进肌红蛋白锌原卟啉IX络合物的生成而保持食用肉的鲜红色的方法(专利文献5、6)。在这些方法中，无法作用于已经生成的高铁肌红蛋白，显色乃至色调维持效果有限。专利文献专利文献I :日本特开2003-18976号公报专利文献2 日本特开2008-228702号公报专利文献3 日本特开2009-165445号公报专利文献4 :日本特开2006-56908号公报专利文献5 :日本特开2005-87058号公报专利文献6 :日本特开2006-61016号公报
本发明以提供对食用肉或食用肉加工品的色调改善有效的还原剂及其用途(不使用亚硝酸盐等显色剂的色调改善方法等)为课题。本发明人为了找出改善食用肉色调的物质而以杆菌属微生物为中心实施了筛选。筛选的结果确定了产生食用肉显色效果高的物质的微生物株。进一步进行研究的结果明确了被期待高有用性的该物质对高铁肌红蛋白显示还原活性。即，发现杆菌属微生物产生通过高铁肌红蛋白还原活性而促进食用肉显色的物质。该物质是对血红素显示还原作用的物质，不限于食用肉的显色，在血红素或血红素蛋白的还原有效乃至必要的其它用途方面也可利用。例如，在还原具有与高铁肌红蛋白类似的结构的高铁血红蛋白等的目的下可利用该物质。进一步的研究结果判明了源自杆菌属微生物的上述物质(显示还原作用的物质)为二氢硫辛酰胺脱氢酶和硝基还原酶。本发明是基于上述结果而完成的，其如下所示。[I] 一种还原剂，含有源自杆菌属微生物的血红素还原酶。 [2]根据[I]中记载的还原剂，其特征在于，所述血红素为高铁肌红蛋白的血红素。[3]根据[I]中记载的还原剂，其特征在于，所述血红素为高铁血红蛋白的血红素。[4]根据[1] [3]中任一项记载的还原剂，其特征在于，由杆菌属微生物的菌体粉碎物构成。[5]根据[1] [4]中任一项记载的还原剂，其中，所述杆菌属微生物为选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、纳豆菌、苏云金芽孢杆菌、及蕈状芽胞杆菌中的微生物。[6]根据[I]中记载的还原剂，其中，所述血红素还原酶为二氢硫辛酰胺脱氢酶或硝基还原酶。[7]根据[I]中记载的还原剂，其中，作为所述血红素还原酶，含有二氢硫辛酰胺脱氢酶和硝基还原酶。[8]根据[6]或[7]中记载的还原剂，其中，所述二氢硫辛酰胺脱氢酶的氨基酸序列含有序列号3的氨基酸序列，所述硝基还原酶的氨基酸序列含有序列号12的氨基酸序列。[9]根据[6] [8]的任一项中记载的还原剂，其中，所述二氢硫辛酰胺脱氢酶和所述硝基还原酶为重组蛋白质。[10] 一种色调改善剂，由[I] [9]中任一项记载的还原剂构成。[11] 一种色调改善剂，是将[1] [9]中任一项记载的还原剂与显示将肌红蛋白的血红素基中的铁置换成锌的作用的物质组合而成的。[12]根据[11]中记载的色调改善剂，其中，所述物质为亚铁螯合酶。[13]根据[10] [12]中任一项记载的色调改善剂,其中,所述色调改善剂用于改善食用肉或食用肉加工品的色调。[14] 一种食用肉或食用肉加工品用的色调改善剂，含有二氢硫辛酰胺脱氢酶和/或硝基还原酶。[15]根据[10] [14]中任一项记载的色调改善剂,其中,所述色调改善剂通过显色作用、显色促进作用和/或防褪色作用来改善色调。[16] 一种医药品，其特征在于，含有[I] [9]中任一项记载的还原剂。[17]根据[16]中记载的医药品，其中，所述医药品是口服给药制剂。[18]根据[16]中记载的医药品，其中，所述医药品是非口服给药制剂。[19] 一种还原剂的制造方法，所述制造方法包括以下步骤(I)和(2)(I)将产生血红素还原酶的杆菌属微生物在产生该酶的条件下培养的步骤；(2)从培养产物回收所述酶的步骤。[20]根据[19]中记载的制造方法，其中，所述步骤(2)由以下步骤构成(2-1)从培养产物收集菌体的步骤；(2-2)制备菌体粉碎物的步骤。 [21]根据[19]或[20]中记载的制造方法，其特征在于，所述血红素为高铁肌红蛋白的血红素。[22]根据[19]或[20]中记载的制造方法，其特征在于，所述血红素为高铁血红蛋白的血红素。[23]根据[19] [22]中任一项记载的制造方法，其中，所述杆菌属微生物为选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、纳豆菌、苏云金芽孢杆菌、及蕈状芽胞杆菌中的微生物。[24] 一种色调改善方法,其特征在于,使[10] [15]中任一项记载的色调改善剂作用于食用肉或食用肉加工品。[25] 一种色调改善方法，其特征在于，使选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、纳豆菌、苏云金芽孢杆菌、及蕈状芽胞杆菌中的杆菌属微生物的菌体粉碎物作用于食用肉或食用肉加工品。[26] 一种使用了 [1Γ[9]中任一项所述的还原剂的预防或治疗方法，预防或治疗血液循环障碍、低氧症或血氧减少状态，伴有血液循环障碍、低氧症及血氧减少状态中的一种以上的病理乃至症状的疾病，或由血液循环障碍、低氧症及血氧减少状态中的一种以上的病理乃至症状所引起的疾病。
[图I]示出将杆菌属菌体粉碎提取物或其加热处理物添加于猪腿肉冻干粉末中而成的溶液的吸收光谱的图。[图2]示出将杆菌属菌体粉碎提取物添加于猪腿肉冻干粉末中而成的溶液在保存中的580nm下吸光度(A58tl)经时变化的图。[图3]示出杆菌属菌体粉碎提取物冻干粉末中的高铁肌红蛋白还原酶活性的图。[图4]示出高铁肌红蛋白还原酶纯化过程中的通过DEAE色谱法得到的溶出图和高铁肌红蛋白还原酶活性的图。[图5]示出高铁肌红蛋白还原酶纯化过程中的通过羟基磷灰石色谱法得到的溶出图和高铁肌红蛋白还原酶活性的图。[图6]示出高铁肌红蛋白还原酶纯化过程中的通过凝胶过滤色谱法得到的溶出图和高铁肌红蛋白还原酶活性的图。[图7]示出以比活性高的凝胶过滤组分为试样的SDS-PAGE结果的图。[图8]比较在各纯化阶段得到的试样的比活性的图。[图9]示出使用了纯化酶(二氢硫辛酰胺脱氢酶DLD)的食用肉显色试验结果的图。对酶量不同的试样进行比较。[图10]示出使用了纯化酶(DLD)的食用肉显色试验结果的图。按照NADH的有无进行比较。[图11]示出纯化酶(DLD)的速率法分析结果(底物饱和曲线)的图。[图12]示出纯化酶(DLD)的速率法分析结果([s]/f[s]标绘)的图。[图13]示出纯化酶(DLD)的最适pH的图。[图14]示出纯化酶(DLD)的pH稳定性的图。[图15]示出纯化酶(DLD)的最适温度的图。[图16]示出纯化酶(DLD)的热稳定性的图。 [图17]示出纯化酶(DLD)对NADH和NADPH的反应性的图。[图18]示出各种阳离子对纯化酶(DLD)活性所造成的影响的图。[图19]示出重组DLD(无His标签)的高铁肌红蛋白还原活性的图。[图20]示出重组DLD(有His标签)的高铁肌红蛋白还原活性的图。[图21]示出使用了重组DLD的食用肉显色试验结果的图。R值、G值和B值为，阴性对照(左)为178、104和102，纯化重组DLD (右)为210、104和114。[图22]示出使用了重组DLD的食用肉显色试验结果的图。R值、G值和B值为，试样I为201、117和123，试样2为185、121和105，试样3为217、97和93，试样4为160、108 和 83，试样 5 为 156、84 和 65。[图23]示出使用了重组DLD的食用肉显色试验结果的图。R值、G值和B值为，试样I为168、122和106，试样2为185、152和145，试样3为172、123和119，试样4为187、153 和 144，试样 5 为 173、148 和 123。[图24]示出对DLD以外的食用肉显色酶的纯化过程中的通过苯基色谱法得到的溶出图和高铁肌红蛋白还原酶活性的图。[图25]示出对DLD以外的食用肉显色酶的纯化过程中的通过羟基磷灰石色谱法得到的溶出图和高铁肌红蛋白还原酶活性的图。[图26]示出对DLD以外的食用肉显色酶的纯化过程中的通过Cu亲和色谱法得到的溶出图和高铁肌红蛋白还原酶活性的图。[图27]示出以通过羟基磷灰石色谱法得到的组分和通过Cu亲和色谱法得到的组分为试样的SDS-PAGE结果的图。[图28]示出重组苹果酸脱氢酶(Malatedehydrogenase MDH)和重组硝基还原酶(Putative NaD(P)H nitroreductase :yodC)的活性的图。从左侧起依次为yodC/pET20b/BL21 (DE3pLysS)(枯草芽孢杆菌)、yodC/pET20b/BL21 (DE3pLysS)(纳豆菌)、pET20b/BL21 (DE3pLysS)(空白载体)、MDH/pET20b/BL21 (DE3pLysS)(枯草芽孢杆菌)、MDH/pET20b/BL21(DE3pLysS)(纳豆菌)。[图29]示出以重组MDH和重组yodC为试样的SDS-PAGE的结果的图。从左侧起依次为标记物、MDH/pET20b/BL21 (DE3pLysS)(枯草芽孢杆菌)、yodC/pET20b/BL21 (DE3pLysS)(枯草芽孢杆菌)、pET20b/BL21 (DE3pLysS)、MDH/pET20b/BL21 (DE3pLysS)(纳豆菌)、yodC/pET20b/BL21 (DE3pLysS)(纳豆菌)、标记物。[图30]示出使用了经纯化的重组yodC和重组MDH的食用肉显色试验的结果的图。[图31]示出重组yodC的最适pH的图。[图32]示出重组yodC的pH稳定性的图。[图33]示出重组yodC的最适温度的图。[图34]示出重组yodC的热稳定性的图。[图35]示出重组yodC对NADPH的反应性的图。[图36]示出各种阳离子对重组yodC活性所造成的影响的图。[图37]比较示出DLD和yodC对铁氰化钾的反应性的图。
[图38]比较示出DLD和yodC对肌红蛋白的反应性的图。

本发明的还原剂也可期待在血红蛋白浓度的测定、血红蛋白血症的治疗中的应用。即，本发明的还原剂也可用作试剂或医药品的有效成分。目前，作为血中血红蛋白浓度的测定方法，常用氰化高铁血红蛋白法。在该方法中，在使铁氰化钾和氰化钾的混合物作用于高铁血红蛋白而制成氰化高铁血红蛋白的基础上，利用比色定量法测定。若使用本发明的还原剂，则作为替代该方法的方法，可测定血中等的高铁血红蛋白量或总血红蛋白量。高铁血红蛋白血症是因高铁血红蛋白由于某种原因在体内过量蓄积，导致使体内成为缺氧状态而发病的。作为对高铁血红蛋白血症的治疗方法，亚甲蓝的静脉注射被认为最有效。但是，在并发氰中毒的情况下由于会促进氰中毒而无法使用亚甲蓝。作为其它治疗方法，包括抗坏血酸的口服给药、静脉注射(也可与核黄素联合给药)，但所有方法均效果不大。本发明的还原剂能够提供替代以往治疗方法的新的治疗策略。使用了本发明的还原剂的治疗方法也可对无法使用亚甲蓝的患者(并发氰中毒的人员等)应用。另外，亚甲蓝对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏者无效。G6DP缺乏症之类的可见戊糖磷酸途径异常的患者对该方法不应答而必须接受紧急输血。
G6DP缺乏症是世界上最通常的损伤之一。美国黑人男性中实际上约10%患病。另夕卜，确认非洲人和地中海沿岸居民中也有大量的患病者。因此，相当数量的受试者存在(氧化性)药物诱发性高铁血红蛋白血症的危险性。亚甲蓝本身对这样的患者给药无效(由于他们的G6H)缺乏症引起NADPH不足的缘故)，甚至存在反效果的可能性。本发明的还原剂还可期待对此类患者的效果。本发明的还原剂能够发挥因心搏数、血压、心搏出量异常所致的心脏负荷的减轻以及各组织代谢的亢进等药理作用以及生理作用。含有本发明的还原剂的医药品例如可期待在各组织的需氧量高的生理条件下，例如剧烈的劳动、运动等环境下，作为改善生物体耐久力的耐久力改善剂的用途。此外，也可将本发明的医药品应用于心功能不全、心肌病、心肌炎、心肌梗塞、心包炎、心包心肌炎(perimyocarditis)、一过性缺血发作、冠状动脉性心脏病、具有左-右脉分流的先天性异常(vitia)、法乐氏四联症/五联症、艾森门格综合征、休克、末梢缺血、动脉阻塞性疾病(A0D)、末梢AOD (pAOD)、颈动脉狭窄、肾动脉狭窄、脑的微循环系统障碍(小动脉硬化)、脑内出血、脑的静脉血栓形成和颅内静脉窦血栓形成、血管发育不良、蛛网膜下腔出血、血管性痴呆、宾斯旺格(Biswanger)病、动脉硬化性皮层下脑病、伴有栓塞的多发性皮质梗死、血管炎、糖尿病性视网膜病、由各种原因导致的贫血(anaemia)的预后(再生障碍性贫血、骨髓发育不良综合征、真性红细胞增多症、巨幼红细胞性贫血、缺铁性贫血、肾性贫血、球形红细胞症(spHaerocytosis)、溶血性(haemolytic)贫血等)、地中海贫血(thalassaemia)、异常血红蛋白病、葡萄糖_6_磷酸脱氢酶缺乏症、输血疾病、Rh (Rhesus)不相容性、_疾、瓣膜成形(valvuloplasty)、急性出血后贫血、脾功能允进综合征、肺纤维化、气肿、肺水肿(oedema) :ARDS、IRDS或复发性肺气肿、热灼伤、心绞痛、冬眠等缺血性疾病等，血液循环障碍、低氧症或血氧减少状态的预防或治疗，或伴有这些病理乃至症状或由这些病理乃至症状所引起的疾病的预防或治疗。为了将氧供给至缺血组织而防止缺血性细胞损伤(并且保护组织免受再灌注障碍)，也可在缺血性事件发生前、发生过程中和/或发生后给予本发明的医药品。也可在给予本发明的医药品的同时给予血管活性氧运输体(例如基于血红蛋白的氧运输体)。由于因例如外科脉管重建(例如经皮冠状动脉脉管重建)、移植、急性心肌梗死、血管成形术(经皮冠状动脉血管成形术等)所引起的急性缺血以及随后的再灌注和释放自由基的缘故，可将本发明的医药品和血管活性载体(基于血红素蛋白的氧运输体等)与气态一氧化氮组合，或在应用气态一氧化氮后对哺乳动物给予本发明的医药品和血管活性载体，从而发挥所期望的治疗效果。通过本说明书中记载的方法所治疗的哺乳动物在治疗前可患有缺血性心脏病，也可患有急性缺血性病理(例如心肌梗塞、脑卒中或肾缺血)，亦或脏器(脑、心脏、肾脏、肝脏、胃肠道等)可显示血管痉挛。为了治疗作为包括在循环系统的一部分或整体中通过的红细胞流量降低、贫血和脑卒中的各种原因的结果所产生的脊椎动物内低氧组织，也可使用本发明的医药品。另外，为了防止脊椎动物体内组织缺氧的目的，也可预防性地使用本发明的医药品。进而，因治疗或预防由部分动脉堵塞或微循环中的部分阻断所产生的低氧症的目的，也可应用本发明的医药品。就血红蛋白的给药而言，可参考美国专利申请第08/409，337号说明书。本发明的医药品的给药量、给药期间无特殊限制。可根据给药形态、年龄、体重、症状等适宜选择。
本发明的医药品的给药对象无限制。作为给药对象，除人以外，可列举出人以外的哺乳动物(包括宠物动物、家畜、实验动物。具体而言例如猴、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、猴、牛、猪、山羊、绵羊、马、鸡、羊、鲸、海豚、犬、猫等)。治疗对象在本发明的医药品给药前、给药过程中和/或给药后可以是正常血液量，也可以是血液量过多，亦或可以是血液量过少。本发明的医药品的给药方式无特殊限制。可通过经口或非经口中的任一给药方法给药。本说明书中使用的通过“非经口”的给药无特殊限定，例如可列举出静脉内、肌肉内、动脉内、骨髓腔内、囊内、眼窝内、心脏内、皮内、腹腔内、经皮气管内、皮下、表皮下、关节内、包膜内、蛛网膜下、骨髓腔内及胸骨内注射以及注入。作为优选的给药方法，可采用静脉内注射。作为适合经口给药的制剂的实例，例如可列举出片剂、胶囊剂、散剂、微粒剂、颗粒齐U、液体制剂和糖浆剂。作为适合非经口给药的制剂，例如可列举出注射剂、栓剂、吸入剂、贴剂等。本发明的医药品可根据需要添加药理学、制剂学上可容许的添加剂来制造。作为药理学、制剂学上可容许的添加剂的实例，例如可列举出赋形剂、崩解剂乃至崩解助剂、粘结剂、润滑剂、包衣剂、色素、稀释剂、基质、溶解剂乃至助溶剂、等张剂、PH调节剂、稳定剂、抛射剂和粘合剂。适合口服给药或非口服给药的制剂中可添加葡萄糖、乳糖、D-山梨醇、D-甘露醇、淀粉、高岭土、木糖醇、糊精、玉米淀粉、马铃薯淀粉、羟丙基纤维素或结晶纤维素等赋形剂；羧甲基纤维素、淀粉或羧甲基纤维素钙等崩解剂或崩解助剂；羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或明胶等粘结剂；轻质无水硅酸、合成硅酸铝、硬脂酸、硬脂酸钙、硬脂酸镁或滑石粉等润滑剂；羟丙基甲基纤维素、白糖、聚乙二醇或氧化钛等包衣剂；凡士林、液体石蜡、聚乙二醇、明胶、高岭土、甘油、纯化水或硬化油脂等基质；氟利昂、乙醚或压缩气体等抛射剂；聚丙烯酸钠、聚乙烯醇、甲基纤维素、聚异丁烯、聚丁烯等粘合剂；棉布或塑料片等基布等的制剂用添加剂等。适合注射用的制剂中可添加注射用蒸馏水、生理盐水、丙二醇等水性或能够构成用时溶解型注射剂的溶解剂或助溶剂，葡萄糖、氯化钠、D-甘露醇、甘油等等张剂；有机酸(衣康酸、琥珀酸、酒石酸、富马酸、枸橼酸、苹果酸、己二酸、葡萄糖酸、焦磷酸、乳酸、α -酮戊二酸、植酸等)或这些有机酸的盐、无机酸(碳酸等)或这些无机酸的盐、酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸等)、碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸、组氨酸等)等pH调节剂；利多卡因等镇痛剂等添加剂。本发明的医药品的典型作用对象之一是血红蛋白，但这里的血红蛋白无特殊限定。可以是天然(未修饰)的血红蛋白，通过基因操作修饰的血红蛋白，通过分子内或分子间交联、聚合或化学基团(例如聚烯烃氧化物、聚乙二醇、超氧化物歧化酶、或其它加成物)的加成等化学反应修饰的血红蛋白。本发明的医药品也可应用于上述血红蛋白以外的血红素蛋白。另外，还可应用于结构与上述血红素蛋白类似的金属卟啉络合物。3.还原剂的制造方法本发明的还一方面提供本发明的还原剂的制造方法。在本发明的制造方法中进行以下步骤将产生血红素还原酶、优选高铁肌红蛋白还原酶的杆菌属微生物在产生该酶的条件下培养的步骤(步骤(1))，和从培养产物回收上述酶的步骤(步骤(2))。作为步骤(I)的杆菌属微生物，可使用选自枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、纳豆 菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽胞杆菌中的任一种微生物。培养方法和培养条件只要是可产生目标酶的方法和条件，就无特殊限定。即，可在产生显示血红素还原活性的多肽的条件下，适宜设定适合培养所使用的微生物的方法、培养条件。以下，作为培养条件例示出培养基、培养温度及培养时间。作为培养基，采用所使用的微生物可生长的培养基。例如，可使用如下培养基添加了阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、龙胆二糖、可溶性淀粉、甘油、糊精、糖浆、有机酸等碳源，进而添加了硫酸铵、碳酸铵、磷酸铵、乙酸铵；或者可使用如下培养基添加了玉米麸粉、大豆粉、酪蛋白氨基酸、咖啡渣、棉籽油渣、蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、麦糠、肉汁等氮源，进而添加了钾盐、镁盐、钠盐、磷酸盐、锰盐、铁盐、锌盐等无机盐。为了促进所使用的微生物的生长，可在培养基中添加维生素、氨基酸等。培养基的PH调整至例如约3 8、优选约5 7左右，培养温度通常为约1(T5(TC、优选约25 35°C左右，在需氧条件下培养广15日、优选3 7日左右。作为培养方法，例如可利用静置培养、振荡培养法、使用发酵罐的需氧深部培养法。在以上条件下培养后，从培养产物回收目标酶(步骤(2 ))。代表性地在从培养产物收集菌体的操作(步骤(2-1))之后，制备菌体粉碎物(步骤(2-2))。菌体的收集可利用离心处理、过滤器过滤等。在使用固体培养基的情况等含有菌体以外的固体成分的情况下，可预先除去该固体成分。菌体粉碎物的制备可利用使用弗氏压碎器(French Press)或戴诺磨(DYN0-MILL)的机械粉碎处理、超声波处理、冷冻粉碎处理等。在之后进行的冷冻处理、干燥处理、冻干处理等之际发生菌体粉碎的情况下，也可不设置菌体粉碎专用的工序。所制备的菌体粉碎物可直接(即未实施特别的处理)或经追加处理后用作本发明的还原剂。这里的“追加处理”的实例是浓缩(利用超滤膜的浓缩等)、纯化(盐析、各种色谱法等)、添加其它成分、稀释及干燥。作为追加处理，也进行两种以上的处理。最终的形态可以为液体状，也可以为固体状(包括粉体状)。实施例为了找出改善食用肉色调的物质，以杆菌属微生物为中心实施了筛选。以下从根据筛选的结果中示出涉及被期待高有用性的微生物株的实验的结果。I.枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、纳豆菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽胞杆菌的冻干粉末的制备将IOmL的如表I所示的液体培养基分注于试管中，于120°C下灭菌20分钟。作为预培养，分别在上述试管中接种I接种环的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilisJCM1465 株(=ATCC6051 株、IAM12118 株、IF013719 株))、解淀粉芽孢杆菌(BacillusamyIoIiquefaciensNBRCl5535 株(=ATCC23350 株))、纳豆菌(Bacillus natto)、苏云金芽抱杆菌(Bacillus thuringiensis NBRC13865 株(=ATCC13366 株))、蕈状芽胞杆菌(Bacillus mycoides IAM1190 株(=IF03039 株))，于 30°C、300rpm 下振荡培养 I 晚。[表 I]


本发明的课题在于提供对食用肉的显色有效的还原剂及其用途。本发明提供一种含有源自杆菌属微生物的血红素还原酶的还原剂。优选使用枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、纳豆菌、苏云金芽孢杆菌或蕈状芽胞杆菌的菌体粉碎物。