专利名称：一种快速测定土壤微生物碳代谢能力的微孔板培养法的制作方法土壤微生物具有重要的环境功能，作为土壤生态系统中最活跃的部分，行使着分解土壤中动、植物残体和转化有机质的重要功能，是植物养分的源或库，它能促进土壤中能量流动和养分循环，是土壤生态系统的重要组分，是土壤肥力水平的活指标，是土壤活性大小的标志，一般来讲，肥沃的土壤多拥有丰富的微生物种类，及较高的土壤微生物多样性和总量。土壤微生物在治理各类土壤环境污染、维持生态服务功能以及促进土壤持续利用等方面具有重要意义。微生物作为有机物分解、养分转化的中介者，其数量及活力直接影响进 入土壤中有机物和污染物的分解转化速度，因而直接影响作物的产量和环境的质量。土壤中的有机碳库是陆地生态系统重要的碳库之一，土壤有机碳在很大程度上影响着土壤结构的形成和稳定性、土壤的缓冲性能和持水性能以及植物营养的生物有效性，起着缓解和调节与土壤退化及土壤生产力有关的一系列土壤过程，是土壤质量评价和土地可持续利用管理中的重要指标，也是表征土壤肥力高低的重要指标之一。作为土壤中重要的胶结物质，土壤有机碳影响土壤的物理性质和土壤的保肥与供肥性能，对土壤酸碱和有毒物质具有缓冲能力，是土壤良好的缓冲剂，其含量直接影响土壤肥力和作物产量的高低。作为土壤有机碳库的易分解、矿化部分，土壤活性碳是指土壤中移动快，并影响了植物生长，它们也是土壤微生物活性能源，从而进一步对调节土壤养分流有很大影响。当土壤中的有机碳总量一定是，微生物碳代谢能力的不同将会对土壤活性碳含量造成影响，宏观上表现为有机物分解速度、养分转化效能，植物生长快慢产生影响，因此，土壤微生物群落碳代谢能力可以作为微生物在土壤养分转化，植物营养利用上的一个指标。一般来讲，土壤微生物量碳含量越高，土壤养分转化使用效率越高，土壤养分越充足。碳代谢能力作为土壤微生物代谢能力的一种重要指标，目前的比较方法还比较有限并且具有一定应用缺点，如目前微生物群落生理活性研究较为先进的方法是Biolog-Eco板培养法，Biolog-Eco板碳源种类为31种，由于其主要成色剂红四氮唑能够对生物细胞产生毒害，从而低估了微生物区系利用不同碳源的能力。本发明采用常用的96孔细胞培养板培养法，成色物质为WST-8(也称CCK-8，学名2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5- (2,4- 二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)，该物质对生物细胞无明显毒害作用，同时在水中具有较高的溶解度，通过一定的实验重复，共设置了 47种土壤常见碳源，确立了标准化的培养及测定方法，从而更加准确的评价了微生物群落碳代谢多样性及能力，具有一定的应用潜力。
本发明的目的是为提供一种快速测定土壤微生物碳代谢能力的微孔板培养法。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案技术特征为(I)配制无碳源液体基础培养基，其成分为=KH2PO4 lg/L ；K2HP04, g/L ；KC1,0. 25g/L ；MgS04 · 7H20，0. 5g/L ;尿素 2g/L，(NH4)2SO4 2g/L，2_(2_ 甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5- (2,4- 二磺基苯)-2H-四唑单钠盐，200-500mg/L。(2)分装步骤I配制液体基础培养基，向分装后基础无碳源培养基中添加下列47种碳源中的I种D-纤维二糖、蔗糖、D-甘露醇、α -环式糊精、β -环式糊精、i-赤藓糖醇、甘油/丙三醇、L-阿拉伯糖、吐温40、吐温80、L-鼠李糖、D-阿洛酮糖、肝糖、D-山梨醇、松二糖、Y -羟丁酸、D-木糖/戊醛糖、D-海藻糖、D-蜜三糖/棉子糖、I-磷酸葡萄糖、D-半乳糖醛酸、戊五醇/核糖醇、乙酸、柠檬酸、D-苹果酸、α-丁酮酸、α-羟丁酸、衣康酸、D，L- α -磷酸甘油、β -甲基-D-葡萄糖苷、丙酮酸甲酯、菊糖、D-葡糖胺酸、N-乙酰-D葡萄糖氨、4-羟基苯甲酸、L-丙氨酸、L-天门冬酰胺、甘氨酰-L-谷氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、a-D-乳糖、苯乙胺、腐胺、肌醇。碳源充分溶解，并保证每种碳源添加量均为3g/L，高压蒸汽灭菌后避光保存。·(3)按表一所示将步骤2所配培养基，按每孔50 μ L加入96孔细胞培养板中，其中Al、Α7微孔只加入步骤I所配无碳源基础培养基(注如表I所示，96孔板共48个处理，两个重复)，超净工作台或其他无菌条件下风干，。(4)选取待测环境微生物固体或液体样品，溶解于10倍重量的无菌蒸馏水中，再用无菌水稀释(根据对样品来源预测，稀释100或1000倍)。(5)将步骤二制成的待测样品加入步骤一制作的细胞培养板中，20-30°C细胞培养板振荡器中保温培养(或静置培养)，8小时测定一次连续测定3天。测定方法采用全功能多波长扫描仪、酶标仪等在560-600nm之间任意波长处对细胞培养板各个微孔扫描并记录吸光OD值，72小时微孔测定值如小于O. 5，该微孔其他记录数值按。(6)选取72小时微孔两重复测定值均大于等于O. 5的微孔，取其平均值，代表其对不同单类碳源利用能力，选取72小时所有微孔测定平均值代表微生物群落利用碳源综合能力。本发明具有以下特点1)测定方法需时较短细胞培养板可以成批制备，每个待测样品测定操作时间不过5分钟，3天后即出结果；2)测定方法简便待测样品无菌水迅速稀释后，加入培养板后常温培养测定，不需复杂的测定条件；3)本发明通过实验筛选了土壤中动植物分泌物，残体代谢中常见的47种碳源，能够具有广泛的代表性，从而综合反映微生物群落碳源代谢能力的平板；实施方案比较湖南郴州桂阳县旱种及水栽烟田烟草根际土壤微生物碳代谢能力的影响，评价土壤微生物碳源代谢能力差异。I)采用大田试验，试验地点位于湖南省郴州市桂阳县烟草种植试验站。大田试验品种为K326，每个处理设3次重复，共6个小区，每个小区面积为4mX 10m,并进行随机区组排列。供试棉花于2011年4月13移栽，试验地生长期间未使用任何化学农药，肥水管理与大田棉花常规管理相同。2)配制无碳源液体基础培养基，其成分为=KH2PO4 lg/L ；K2HP04, g/L ；KC1,0. 25g/L ；MgS04 · 7H20,0. 5g/L ；尿素 2g/L，(NH4) 2S04 2g/L，2-甲氧基-4-硝苯基)_3_ (4-硝苯基)-5- (2,4- 二磺基苯)-2H-四唑单钠盐，200-500mg/L。3)分装步骤2配制液体基础培养基，向分装后基础无碳源培养基中添加下列47种碳源中的I种D-纤维二糖、蔗糖、D-甘露醇、α-环式糊精、环式糊精、i_赤藓糖醇、甘油/丙三醇、L-阿拉伯糖、吐温40、吐温80、L-鼠李糖、D-阿洛酮糖、肝糖、D-山梨醇、松二糖、Y -羟丁酸、D-木糖/戊醛糖、D-海藻糖、D-蜜三糖/棉子糖、I-磷酸葡萄糖、D-半乳糖醛酸、戊五醇/核糖醇、乙酸、柠檬酸、D-苹果酸、α-丁酮酸、α-羟丁酸、衣康酸、D，L- α -磷酸甘油、β -甲基-D-葡萄糖苷、丙酮酸甲酯、菊糖、D-葡糖胺酸、N-乙酰-D葡萄糖氨、4-羟基苯甲酸、L-丙氨酸、L-天门冬酰胺、甘氨酰-L-谷氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、a -D-乳糖、苯乙胺、腐胺、肌醇。碳源充分溶解，并保证每种碳源添加量均为3g/L，高压蒸汽灭菌后避光保存。按表一所示将步骤2所配培养基，按每孔50 μ L加入96孔细胞培养板中，其中Al、Α7微孔只加入步骤I所配无碳源基础培养基(注如表I所示，96孔板共48个处理，两个重复)，超净工作台或其他无菌条件下风干，。4)选取大田实验中同一重复不同植株，称取相当于IOg烘干土壤的新鲜烟草根区土样，在超净工作台上将其置于装有90mL无菌蒸馏水的250mL三角瓶中，摇床振荡(200r/min)30min后，在超净工作台上用无菌水稀释10倍，用八道枪吸取土样液接种于微平板的各孔中，每孔接种150L。将接种好的Eco微平板放置到培养板振荡器中，并置于30°C下培 养，培养期间每隔8小时用全波长扫描仪在590nm下测定光密度值。表一 96孔细胞培养板内碳源种类及位置本发明涉及涉及一种快速测定土壤微生物碳代谢能力的微孔板培养法，可以对环境微生物群落及纯化单菌株进行碳代谢能力实验，属于生物技术领域。本发明通过在细胞培养板内添加含有47种不同种类碳源的培养基及无毒易溶染料2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐，通过该培养方法，可以方便、快捷、准确地判断测定土壤微生物碳代谢的能力，本专利所采用的47种碳源均来自动植物残体在土壤中分解代谢的中间产物，具有较强的谭代谢能力代表性。