专利名称：一株生产丙酮酸的代谢工程酵母菌的制作方法 丙酮酸是有重要应用价值的一种有机酸，具有保健生理功能(Pyruvicacid’s health function.Soft Drinks International，1998(5)24.)，并且是合成L-色氨酸、L-酪氨酸、L-多巴等产品的原料。丙酮酸可通过微生物发酵葡萄糖得到(Wang Q，He P，Lu D，Shen A，Jiang NLet.Appl. Microbiol.，2002，35338-342；Qiang Hua，Chen Yang，kazuyuki ShimizuJ.Biosci.Bioeng..1999，87(2)206-213；A.Yokota，H.Shimizu，Y.Terasawa et alAppl.Microbiol.Biotech..1994，41638-643；Mitsuaki MoriguchiAgric.Biol.Chem..1982，46(4)955-961；M.Moriguchi，K.Shuto，T.HashimotoJ.Ferment.Technol..1984，62(3)243-248；S.Takao，M.TanidaJ.Ferment.Technol..1982，60(4)277-280；Carsten Schinschel，Helmut SimonJ.Biotech..1993，31191-203)，目前发酵水平最高的菌种是光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)IFO0005(大阪发酵研究所Institute for Fermentation，Osaka)，曾报道用该菌种在补料流加发酵的情况下，生产强度为1.08g/L.h(Reiko Miyata，Tetsu YoneharaJ.Ferment.Bioeng..1996，82(5)475-479)。我国也用光滑球拟酵母发酵得到类似的结果(Li Y，Chen J，Lun SY，Rui XYAppl.Microbiol.Biotechnol.，2001，55680-685)。
由于丙酮酸是生物体糖代谢的中间代谢物，丙酮酸经丙酮酸脱羧酶催化生成乙醛，再还原得到乙醇，因此，丙酮酸脱羧酶的存在使乙醇作为副产物的产生降低了丙酮酸的产量。为了克服以上现有技术上存在的缺欠，我们从光滑球拟酵母IFO0005出发用代谢工程的方法敲除了它的丙酮酸脱羧酶基因，得到一株生产丙酮酸的代谢工程菌光滑球拟酵母3672，使丙酮酸脱羧酶活性降低了70％，阻断消耗丙酮酸生成乙醇的代谢途径，该菌株发酵时减少了副产物乙醇的生成，从而提高了丙酮酸的产量，使其产酸水平的生产强度比光滑球拟酵母IFO0005出发菌提高了一倍，为此，本发明的目的在于提供一株敲除了丙酮酸脱羧酶基因，比现有生产菌种更优越的丙酮酸生产菌光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)3672，该菌种可以在丙酮酸的生产中应用。在2003年01月15日已将光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)3672保藏在北京、中关村、100080，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册的编号为CGMCC N0.0879。另外，本发明还提供了该菌生产丙酮酸的种子培养基，其成分为10％葡萄糖，3％鱼蛋白胨，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，和4％CaCO3，pH5.5，也可以添加4mg/L烟酸，200μg/L维生素B6和2μg/L的生物素；发酵培养基，其成分为10％葡萄糖，0.1％大豆蛋白胨，0.6％(NH4)2SO4，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O和4％CaCO3，pH5.5，其中0.1％大豆蛋白胨，可以用3％鱼蛋白胨代替，还可以添加8mg/L烟酸，1mg/L维生素B6，30μg/L生物素，30μg/L维生素B1于发酵培养基中。以下是列举的实施例，以便更好地理解本发明。实施例一光滑球拟酵母3672 CGMCC N0.0879和光滑球拟酵母IFO0005分别接种于成分为1％酵母提取物，2％蛋白胨，10％葡萄糖pH5.5的培养基中，在250ml三角瓶中于30℃、220转/分的摇床培养16小时后，分别离心收获细胞，用20mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)洗2次，重新悬浮在该缓冲液中，加入玻璃珠，在4℃下剧烈振荡10分钟，15,000×g离心30分钟，分别测定上清液的丙酮酸脱羧酶酶活。光滑球拟酵母3672 CGMCCN0.0879的丙酮酸脱羧酶酶活为0.49U/ml，光滑球拟酵母IFO005的丙酮酸脱羧酶酶活为1.72U/ml。实施例二光滑球拟酵母3672 CGMCC N0.0879和光滑球拟酵母IFO005分别接种于种子培养基，其成分为10％葡萄糖，3％鱼蛋白胨，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，和4％CaCO3，pH5.5的培养基中，在250ml三角瓶中于30℃、220转/分的摇床培养24小时。以10％的接种量分别转接到发酵培养基，其成分为10％葡萄糖，0.1％大豆蛋白胨，0.6％(NH4)2SO4，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O和4％CaCO3，pH5.5的培养基中，在250ml三角瓶中于30℃、220转/分的摇床培养32小时，分别测定两株菌发酵液的丙酮酸和乙醇含量。光滑球拟酵母3672 CGMCC N0.0879为丙酮酸20.2g/L，乙醇4.6g/L；光滑球拟酵母IFO005为丙酮酸7.3g/L，乙醇7.4g/L。实施例三光滑球拟酵母3672 CGMCC N0.0879和光滑球拟酵母IFO005分别接种于种子培养基，其成分为10％葡萄糖，3％鱼蛋白胨，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，4mg/L烟酸，200μg/L维生素B6，2μg/L生物素和4％CaCO3，pH5.5的培养基中，在250ml三角瓶中于30℃、220转/分的摇床培养24小时。然后，以10％的接种量分别转接到发酵培养基，其成分为10％葡萄糖，3％鱼蛋白胨，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，8mg/L烟酸，1mg/L维生素B6，30μg/L生物素，30μg/L维生素B1和4％CaCO3，pH5.5的培养基中，在250ml三角瓶中于30℃、220转/分的摇床培养48小时，分别测定两株菌发酵液的丙酮酸含量。光滑球拟酵母3672 CGMCCN0.0879为50.2g/L；光滑球拟酵母IFO005为24.5g/L。
实施例四光滑球拟酵母3672 CGMCC N0.0879接种于种子培养基，其成分为10％葡萄糖，3％蛋白胨，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，4mg/L烟酸，200μg/L维生素B6，2μg/L生物素和4％CaCO3，pH5.5，在500ml三角瓶中于30℃、220转/分的摇床培养24小时。然后，以10％的接种量分别转接到5000ml自控发酵罐，其培养基成分为15％葡萄糖，3％蛋白胨，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，8mg/L烟酸，1mg/L维生素B6，30μg/L生物素，30μg/L维生素B1和4％CaCO3，pH5.5。在30℃、700转/分、通气量2升/分培养36小时，测定菌发酵液的丙酮酸含量为46.9g/L，生产强度为1.30g/L.h。


丙酮酸是有重要应用价值的一种有机酸。用代谢工程的方法构建一株生产丙酮酸的光滑球拟酵母菌，敲除了丙酮酸脱羧酶基因，使丙酮酸脱羧酶活性降低了70％，阻断消耗丙酮酸生成乙醇的代谢途径，减少了乙醇的生成而增加了丙酮酸的积累。是一株比原生产菌种更优越的丙酮酸生产菌。