技术领域
[0001]本发明涉及用于处理样品以进行分子检测测定，特别是处理临床样品以进行核酸检测测定以检测疾病的方法[0002]发明背景[0003]人的分子测试已经对医疗诊断和患者管理变得越来越重要动物的分子测试在兽医应用中日渐重要核酸测试是现代法医学、移民、亲子鉴定和其它人身份应用的必需工具实验胚胎学对癌症研究、鉴定生物标志、素质因素和潜在药物靶标变得越来越重要RNA基因分型涵盖研究、应用测试和诊断学的所有领域中一系列用于分析个体或细胞之间遗传差异的应用处理生物样品时，目前的分子测试需要在用例如聚合酶链式反应(PCR)等技术进行核酸检测之前，对样品进行特定预处理目前认为样品预处理是必需的并且已经开发了许多商业试剂盒和系统并且正用于市场中不幸的是，预处理增加了分子测试的成本并且需要额外处理时间和设备[0004]人类遗传标记控股有限公司(Human Genetic Signatures Pty Ltd)(悉尼,澳大利亚)已经开发了如W02006/058393和US7833942中所公开的用于检测微生物的方法所述方法包括用一种试剂处理微生物 的微生物核酸以形成源自微生物核酸的简化形式的核酸，所述微生物核酸具有可用于检测微生物的独特核酸序列[0005]本发明人已经开发了不需要如同分子检测测定中目前所需要的样品预处理的改进的分子检测测定[0006]发明概述[0007]本发明涉及对生物样品进行的分子检测测定，其不需要样品清除步骤或处理生物样品以溶解细胞或纯化核酸[0008]在第一方面，本发明提供了一种分子检测测定，包括[0009](a)在容许细胞破碎和核酸处理的条件下直接用亚硫酸氢盐试剂处理生物样品；[0010](b)从所述经处理的样品中去除所述亚硫酸氢盐试剂；并且[0011](C)检测所述经处理的样品中的靶核酸[0012]在步骤(a)之前，所述生物样品不需要细胞破碎或化学/物理处理[0013]所述生物样品可选自粪便、鼻腔、血液、血浆、血清、口腔细胞、脓液、伤口、浓缩滤液、脑脊髓液、精液、液基细胞学(LBC)、组织、FFPE、激光捕获细胞、培养细胞、沉淀细胞、细菌培养物、细菌菌落、病毒悬液、抽吸物、支气管灌洗、痰液样品、环境样品、环境浓缩物、粮食、原料、水样或水浓缩物等[0014]检测到的核酸可为DNA、RNA或DNA和RNA的组合[0015]所述测定适合于检测动物的传染病、遗传性疾病或遗传特性优选地，所述动物为人[0016]所述传染病可由微生物引起，所述微生物包括细菌、病毒、类病毒、酵母菌、真菌、朊病毒、寄生虫或变形虫[0017]所述遗传性疾病可为癌症、突变、拷贝数改变、遗传病症、环境诱导的疾病、由暴露于致癌物引起的疾病、特征在于基因组中核苷酸重复长度扩大或减小的疾病[0018]遗传特性可为对癌症或任何其它疾病的易感性，其中遗传和表观遗传变化促成疾病状态的发展[0019]优选地，亚硫酸氢盐试剂为亚硫酸氢钠或偏亚硫酸钠优选地，以浓度为约2.5M至约3.5M，pH范围为约4.5至约5.5使用亚硫酸氢盐试剂更优选地，以浓度为约3M，pH为约5.0使用亚硫酸氢盐试剂[0020]优选地，步骤(a)包括在约75°C和95 °C之间加热约I分钟至30分钟更优选地，在约80°C和95°C之间的温度下加热所述样品约10至20分钟应了解，温度和加热持续时间可根据处理的样品和待检测核酸的细胞来源而改变[0021]可通过任何适合方式从经处理的样品中去除亚硫酸氢盐实例包括基于柱的纯化或基于珠粒的纯化最佳，但是在一些情况下简单的沉淀步骤可能已足够[0022]去除亚硫酸氢盐之后，优选地使所述样品再悬浮于pH为至少10，更优选介于约pHll.5至约12.5的洗脱缓冲液中已经发现至少为约12的pH适合大多数样品[0023]亚硫酸氢盐试剂将经处理的核酸中的胞嘧啶修饰为尿嘧啶在双链DNA中，亚硫酸氢盐试剂将互补双链基因组DNA的每条链中的胞嘧啶修饰为尿嘧啶，形成除非互补核酸分子外的两种衍生物[0024]在一种优选的形式中，衍生微生物核酸大体上含有碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)并且具有与相应的未经处理的核酸大体上相同的碱基总数[0025]如果扩增经处理的核酸，则扩增的核酸大体上含有碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)可通过任何适合方式例如聚合酶链式反应(PCR)、恒温扩增或信号放大进行扩增[0026]在一种优选的形式中，所述测定进一步包括为经处理的样品提供核酸引物或探针[0027]优选地，经处理的样品经历扩增反应以形成对微生物或遗传指示物特异的靶核酸分子[0028]优选通过扩增检测靶核酸分子适合的扩增检测的实例包括PCR、qPCR、逆转录酶PCR、数字PCR、恒温扩增或信号放大[0029]也可通过测序法例如Roche454、ABI SOLiD或离子激流系统(1n torrentsystem) > Illumina Hi Seq SBS 技术、太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences)米用的Helicos Heliscope或SMRT技术或任何其它等效技术检测经处理的核酸[0030]在一种优选的形式中，通过以下方式检测靶核酸分子[0031]提供能够与微生物特异性核酸分子的靶区域结合的检测配体并且容许检测配体有足够时间与靶区域结合；并且[0032]测量检测配体与靶区域的结合以检测微生物特异性核酸分子的存在[0033]在另一种优选的形式中，通过分离扩增产物并且使分离的产物显现来检测靶核酸分子优选地，通过电泳分离扩增产物并且通过使凝胶上的一条或多条带显现检测扩增产物[0034]优选地，靶核酸分子不会自然存在于细胞中[0035]第二方面，本发明提供了用于分子检测测定以直接处理样品的试剂盒，所述试剂盒包含[0036]亚硫酸氢盐试剂；[0037]核酸洗脱和反应试剂；[0038]所述靶核酸的PCR引物；和[0039]进行所述测定的说明书[0040]试剂盒可进一步包括核酸分离或纯化柱、PCR混合液(mastermix)、PCR试剂、对照核酸引物、反应管、试管、拭子等[0041]整篇说明书中，除非上下文另外要求，词“包含(comprise)”或其变型例如“包含(comprises) ”或“包含(comprising) ”将理解为暗示包括陈述的元素、整数或步骤或一组元素、整数或步骤，但不排除任何其它元素、整数或步骤或一组元素、整数或步骤[0042]对已经包括在本说明书内的文件、行为、材料、装置、物品等的任何讨论仅仅是为了对本发明提供上下文关系的目的不得将其视为承认任何或全部这些问题形成了现有技术基础的组成部分或是本发明相关领域中的一般常识，因为在开发本发明之前其在澳大利亚存在[0043]为了可能更清楚地理解本发明，将参考下列附图和实施例描述优选的实施方案[0044]附图简述[0045]图1示出了使用本发明检测艰难梭状芽孢杆菌(C.difficile)的结果A.Fam通道对艰难梭状芽孢杆菌的tcdA/B基因有特异性；B.Cy5通道对提取对照有特异性[0046]图2示出了来自相同样品的3种病毒`的扩增结果A.Fam=诺如病毒(norovirus)(单链RNA病毒)；B.Hex =腺病毒(双链DNA病毒)；C.Cy5 =轮状病毒(单链RNA病毒)[0047]图3示出了将人细胞加标(spike)到排泄物中的影响A.显示在3M亚硫酸氢盐试剂中于95°C下加热人MRC5细胞15分钟，然后再悬浮于高pH缓冲液(12.3)中并且扩增人β-球蛋白基因B.显示将相同细胞加标到排泄物中，在3Μ亚硫酸氢盐试剂中于95°C下加热15分钟，然后再悬浮于高pH缓冲液(12.3)中并且扩增人β_球蛋白基因[0048]实施本发明的模式[0049]优点[0050]本发明有许多包括以下的优于现有技术方法的优点[0051]a.样品的细胞溶解和核酸转化在相同试管中同时发生并且不到30分钟可实现完全溶解和转化，甚至少到10-20分钟就可实现[0052]b.可直接处理样品例如排泄物，而无灵敏度的损失[0053]c.基于本发明的测试具有能够对患者原始样品进行，而无需用酶(例如蛋白酶K)预处理的优点[0054]d.所述方法不需要任何昂贵的纯化方法，例如目前市场上的商业纯化试剂盒这些商业试剂盒可用于几乎每种样品类型，例如血液、粪便、培养细胞、FFPE、细菌、病毒和寄生虫，略举数例这些商业试剂盒可花费几千美元并且可花2-4小时纯化样品世界上几乎每一个实验室在目前采用的分子测定的任何后续扩增步骤之前都使用这些试剂盒进行样品纯化[0055]e.去除亚硫酸氢盐之后，再将样品再悬浮于不需要任何进一步处理例如热脱磺化作用的简单洗脱缓冲液中，从而简化了工艺[0056]f.所述方法可在相同试管中同时检测来自相同样品的RNA和DNA病毒，而无需使用专门的病毒纯化试剂盒通过本发明等效溶解并转化了 RNA和DNA病毒(尽管一个是单链而一个是双链)[0057]g.令人惊讶的是，高pH的洗脱缓冲液不会降解RNA这个发现与已经在现有技术中教授的相悖，因为现有技术教学特别建议不要在高温和高PH下处理RNA[0058]h.所述方法可使用相似条件溶解并转化所有细菌类型，因此单个患者样品可用于艰难梭状芽胞杆菌、沙门氏菌(Salmonella)、弯曲杆菌(Camplylobacter)和寄生虫等的多重测试，从而对每种细菌或靶标微生物而言，消除了单独提取方法的问题[0059]1.所述方法适用于难以溶解可以形成使其对常规溶解技术有抵抗力的坚韧外壳的样品例如寄生虫因此检测祀标生物例如结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(TB)(对常规溶解技术非常有抵抗力)会很理想，因为需要基于核酸的灵敏诊断测试[0060]j.所述方法能够只使用10个拷贝病毒有效地溶解并转化直接来自于血清的丙型肝炎病毒(HCV)，证明了在极低水平下检测重要RNA病毒的实用性[0061]k.所述方法还减少了样品处理时间许多个小时并且消除了样品必须纯化，然后如同目前进行那样再次转化并纯化亚硫酸氢盐的问题[0062]1.所述方法适于患者排泄物中结直肠癌的灵敏检测此类样品是非侵入性的并且会减少如同原检测方式对内窥镜检查的依赖另外，预计‘样品到结果’不到3小时，而无需复杂的样品处理过程使用优于血清样品的排泄物进行诊断有许多优点，最重要的是与其中灵敏度总是主要问题的血清样品不同，在样品中很可能存在大量人细胞[0063]样品`[0064]本发明适于处理样品，包括粪便、鼻腔、血液、血浆、血清、口腔细胞、脓液、伤口、浓缩滤液、脑脊髓液、精液、液基细胞学(LBC)、组织、FFPE、激光捕获细胞、培养细胞、沉淀细胞、细菌培养物、细菌菌落、病毒悬液、抽吸物、支气管灌洗、痰液样品、环境样品、环境浓缩物、粮食、原料、水样或水浓缩物等[0065]样品处理(HGS)[0066]根据本发明处理样品的优选方法如下将样品直接放入200μ1的3M(范围2.5-3.5Μ)亚硫酸氢钠ρΗ5.0 (pH范围4.5-5.5)并且在75和95°C之间加热10-20分钟[0067]通过任何适合方式从经处理的样品中去除亚硫酸氢盐实例包括基于柱的纯化或基于珠粒的纯化最佳，但是在一些情况下简单的沉淀步骤可能已足够[0068]去除亚硫酸氢盐之后，使所述样品再悬浮于pH介于11.5至12.5(优选> pH12)的洗脱缓冲液中[0069]样品现已准备好进行PCR扩增，无需进一步处理[0070]去除亚硫酸氢盐[0071]通过商用方法,例如MethylEasy?技术(Human Genetic Signatures)可实现亚硫酸氢盐去除简言之，向样品添加240μ1的试剂#3并且将样品转移到离心机柱中然后使柱在10，OOOXg下旋转以去除亚硫酸氢盐然后用300 μ I的试剂#4洗涤柱2次，洗涤间期在10，OOOXg下旋转添加20至50 μ I的洗脱缓冲液并且使样品旋转到干净接收管中样品现已准备好进行PCR扩增[0072]样品预处理[0073]当前的样品预处理牵涉Qiagen Inc (Valencia, CA91355USA)、Sigma LifeSciences (St Louis, MO, USA)、Invitrogen Corporation(Carlsbad, CA92008, USA)和Promega Corporation (Madison, WI53711USA)销售的商业试剂盒[0074]将本发明与下列方法作比较[0075]医院“内部”测试[0076]在95°C下加热大便样品10分钟，然后稀释并且再扩增样品中艰难梭状芽胞杆菌的tcdB基因[0077]Qiagen 纯化[0078]QIAamp DNA Stool Mini Kit (50)产品目录号 #51504[0079]商业寄生虫测试[0080]AusDiagnostics胃肠道寄生虫5,产品目录号6502[0081]结果[0082]粪便样品[0083]表1、2、3和4中测试的所有粪便样品处理如下 [0084]将拭子放在排泄物中，然后转移到装有200 μ I的3Μ亚硫酸氢钠(ρΗ5.0)的管内，混合，然后在95°C下加热15分钟[0085]使用MethylEasy?方法去除亚硫酸氢盐并且使样品再悬浮于20-50 μ I的洗脱缓冲液中，然后使用标准条件扩增[0086]表1示出了医院“内部”测试的结果，使用Qiagen纯化测试相同样品并且使用根据本发明的所述方法测试相同样品正如从结果可见，医院“内部”测试产生7个假阴性结果和I个假阳性结果(通过EIA和培养以及可商购的分子诊断试剂盒进行确认)，表明所述方法不具有对检测患者原始样品中艰难梭状芽胞杆菌的所需灵敏度使用Qiagen方法，4个样品没有足够物质用于处理，而I个样品给出假阴性结果(通过EIA的GDH阳性)这些结果证明了根据本发明所述方法(HGS方法)用于快速诊断艰难梭状芽胞杆菌的实用性另外，使用HGS方法易于测定体积有限的样品另外，Qiagen方法需要至少2小时样品制备时间并且必须称出预定量的排泄物[0087]表1.医院“内部”测试与Qiagen纯化与HGS方法检测艰难梭状芽胞杆菌的结果
