专利名称：抗微生物剂的制作方法抗微生物剂本发明涉及针对革兰氏阴性菌的抗微生物剂，特别涉及融合蛋白，所述融合蛋白由具有降解革兰氏阴性细菌细胞壁的活性的酶和在N或C端融合于所述酶的其他肽段组成。而且，本发明涉及编码所述融合蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的载体以及包含所述核酸分子或所述载体的宿主细胞。此外，本发明涉及所述融合蛋白作为药物，特别是用于治疗或预防革兰氏阴性细菌感染，作为诊断手段或作为美容用物质的用途。本发明还涉及处理或阻止食品、食物加工装置、食品加工厂、与食品相接触的表面、医疗装置、医院和手术中的表面的革兰氏阴性细菌污染的用途。此外，本发明涉及包含所述融合蛋白的药物或美容用组合物。革兰氏阴性细菌具有外膜，其特点为特征性的不对称双分子层。外膜的双分子层由含有磷脂(主要为磷脂酰乙醇胺)的内侧单分子层和主要包含单一糖脂——脂多糖 (LPS)的外侧单分子层组成。在细菌界，LPS结构具有广阔的多样性，且LPS结构可响应主导的环境条件而受修饰。LPS层的稳定性以及不同LPS分子之间的相互作用主要通过二价离子(Mg2+、Ca2+)与LPS分子的阴离子组分(脂质A中的磷酸基团和KDO的内核和羧基基团)的静电相互作用达成。此外，脂质A疏水部分的密集而有序的折叠，受益于不饱和脂肪酸的缺乏，构成具有高粘性的刚性结构。这使其较不易被亲脂性分子渗透，并赋予外膜(OM) 额外的稳定性。已知多种类型具有杀菌或抑菌活性的试剂，例如抗生素、细胞内溶素、抗微生物肽和防卫素。然而，微生物对抗生素的增加的抗性对于治疗越来越多由细菌导致的感染造成困难。对于由革兰氏阴性细菌如铜绿假单胞菌O^seudomonas aeruginosa)和肠杆菌科 (Enterobacteriaceae)导致的感染产生了特别的困难。细胞内溶素为细菌噬菌体(或细菌的病毒)编码的肽聚糖水解酶。其在噬菌体复制的裂解周期中的晚期基因表达过程中合成，并通过降解细菌肽聚糖来介导后代病毒体从受感染的细胞的释放。其为β (1，4)_糖基化酶(溶菌酶)、糖基转移酶、酰胺酶或内肽酶。细胞内溶素的抗微生物应用已经在1991年由GaSSOn(GB2243611)提出。尽管细胞内溶素的杀灭能力久为人知，由于抗生素的成功和主宰地位，这些酶作为抗细菌剂的用途一直受忽略。仅在多重抗生素耐药性细菌出现后，用细胞内溶素对抗人类病原体这一简单概念方才受到注意。出现了开发完全新颖类型的抗细菌剂的令人瞩目的需求，且用作酶抗生素(enzybiotics)(“酶”和“抗生素”的组合术语)的细胞内溶素完美地符合该需求。在 2001年，Fischetti及其同事首次阐明了细菌噬菌体Cl细胞内溶素对A组链球菌的治疗潜力(Nelson等，2001)。从此，多份文献确立了细胞内溶素作为控制细菌感染，特别是革兰氏阳性细菌的细菌感染的有吸引力和补充的替代手段。接着，针对其他革兰氏阳性病原体如月市炎链球菌(Streptococcus pneumoniae) (Loeffler 等，2001)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis) (Schuch 等，2002)、无乳链球菌(Sti^ptococcus agalactiae) (Cheng 等，2005) 和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus) (Rashel等，2007)的其他不同的细胞内溶素证明了其作为酶抗生素的效力。现在，对于细胞内溶素疗法最重要的挑战在于革兰氏阴性细菌由于其外膜屏蔽细胞内溶素接近肽聚糖而对细胞内溶素外源作用的不敏感性。这一点现在阻止了细胞内溶素的作用范围扩张至重要的革兰氏阴性病原体。抗微生物肽(AMP)代表广泛范围的短的、阳离子性、由基因编码的肽抗生素，其可见于几乎所有生物。不同的AMP显示不同的特性，且该类型中的许多肽不仅作为抗生素， 还作为细胞穿透肽的模板正经受彻底的研究。尽管分享一些共同特征(例如，阳离子性， 两亲性和小尺寸)，AMP序列变化极大，且已提出至少四种结构组(α-螺旋，β-片层，延伸型(extended)和环状(looped))引起观察到的AMP构象的多样性。同样，已提出了几种其作为抗生素的作用模式，且显示例如许多这些肽的主要靶是细胞膜，而对于其他肽， 主要靶是细胞质侵袭和核心代谢功能的扰乱。尽管缺乏特异性靶结合，AMP可变得足够集中(concentrated)以显示协作活性(cooperative activity)，例如，通过在膜上形成孔， 如对于大部分AMP的情况下。然而，该现象仅在模式磷脂双分子层中观察到，且在一些情况下，需要在膜中AMP的浓度高至每六个磷脂分子一个肽分子来使这些事件发生。所述浓度接近甚至可达到全膜饱和。因为对于AMP最低抑制浓度(MIC)通常在低微摩尔范围，可理解地，对于这些阈值的相关性及在体内的重要性产生了怀疑(Melo等，Nature reviews, Microbiology,2009,245).防卫素是一大家族的小的、阳离子性、富含半胱氨酸和精氨酸的抗微生物肽，见于脊椎动物和无脊椎动物两者。防卫素根据半胱氨酸的间隔样式(spacing pattern)分为五个组植物、无脊椎动物、α _、β -和θ -防卫素。后三种主要见于哺乳动物。α -防卫素为见于嗜中性粒细胞和肠上皮的蛋白质。β -防卫素为最广泛分布的，并由白细胞和许多类型的上皮细胞所分泌。θ -防卫素目前很少见，例如见于猕猴(rhesus macaques)的白血病。 防卫素对细菌、真菌和许多有包膜和无包膜病毒有活性。然而，有效杀灭细菌所需的浓度多数情况下较高，即在微摩尔范围。许多肽的活性在生理盐条件、二价阳离子和血清的存在下受限。取决于疏水氨基酸残基的含量，防卫素亦显示溶血活性。因此，有对新颖的抗微生物剂的需要。该目标通过权利要求中限定的主题解决。如本文中使用的术语“蛋白质”与术语“多肽，，所指相同。本文中使用的术语“蛋白质”指氨基酸残基通过肽键以特定序列连接的直链聚合物。蛋白的氨基酸残基可通过例如共价附着多种基团如糖和磷酸来修饰。其他的物质如血红素或脂质可更松散的与多肽链相联系，得到偶合的蛋白质，其也包含于本文中使用的术语“蛋白质”中。有多种方式阐明多肽链的折叠，特别是针对α螺旋和β折叠片层的存在。如本文中使用的术语“蛋白质” 指所有四种类型的蛋白质，即全α、全β、α/β和α加上β。而且，术语“蛋白质”指复合物，其中所述复合物指均聚物(homomer)。如本文中使用的术语“融合蛋白”指由两个核酸序列融合所得的表达产物。上述蛋白可例如在重组DNA表达系统中产生。而且，如本文中使用的术语“融合蛋白”指第一氨基酸序列如例如酶，与第二或更进一步的氨基酸序列的融合物。所述第二或更进一步的氨基酸序列可限定域或任何类型的肽段。优选地，所述第二和/或更进一步的氨基酸序列对于第一氨基酸序列为外源的，并不与第一氨基酸序列的任何域实质上同源。如本文中使用的术语“肽段”指连接于蛋白质的任何类型的肽，如酶。如本文中使用的术语“肽”指由约2至约100个氨基酸残基，更优选约4至约50 个氨基酸残基，更优选约5至30个氨基酸残基组成的短多肽，其中一个氨基酸残基的氨基5基团通过肽键连接于另一个氨基酸残基的羧基基团。肽可具有特定功能。肽可为天然出现的肽或合成设计和产生的肽。所述肽可例如通过酶法或化学剪切来源于天然蛋白或从天然蛋白移出，或者可使用常规的肽合成技术(例如固相合成)或分子生物学技术(参见 Sambrook,J.等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989))来制备。天然出现的肽的实例为抗微生物肽、防卫素、 寿司肽(sushi peptide)。合成产生的肽的实例为聚阳离子性、两亲性(amphiphatic)或疏水性肽。本发明意指的肽并不指用于纯化或定位蛋白质的His-标记、Str印-标记、硫氧还蛋白或麦芽糖结合蛋白(MBP)等。如本文中使用的术语“细胞内溶素”指适于水解细菌细胞壁的酶。“细胞内溶素” 包含至少一个“酶活性域”(EAD)，其具有至少一种下述活性内肽酶、壳多糖酶、T4样胞壁质酶(T41ike muraminidase)、lambda样胞壁质酶、N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶 (酰胺酶)、胞壁酰-L-丙氨酸-酰胺酶、溶菌酶(muramidase)、裂解性糖基转移酶(lytic transglycosylase) (C)、裂解性糖基转移酶(M)、N_乙酰基溶菌酶、N-乙酰-氨基葡糖苷酶 (溶菌酶)或糖基转移酶如例如KZ144和EL188。此外，所述细胞内溶素还可包含无酶活性并结合于宿主细菌细胞壁的区，所谓CBD (细胞壁结合域)。如本文中使用的术语“EAD”指细胞内溶素的酶活性域。EAD负责水解细菌肽聚糖。 其显示细胞内溶素的至少一种酶活性。EAD还可包含多于一种酶活性模块。术语“自溶素”指与细胞内溶素相关的酶，但其由细菌编码并涉及例如细胞分裂。 关于自溶素的综述可见于"Bacterial peptidoglycan (murein)hydrolases. Vollmer W, Joris B, Charlier P, Foster S. FEMS Microbiol Rev. 2008Mar ；32 (2) :259-86，，。如本文中使用的术语“细菌素”指能够抑制其他细菌生长的蛋白质样、多肽样或肽样物质。优选地，所述抑制是特别通过将所述其他细菌吸收于所述细菌素的特定受体所致的。一般而言，细菌素由微生物产生。然而，如本文中使用的术语“细菌素”指由微生物产生的分离形式或指人工合成的形式两者，且还指基本上保留其亲本细菌素的活性，但其序列经插入或缺失一个或多个氨基酸残基而改变的变体。如本文中使用的术语“抗微生物肽(AMP) ”指任何具有杀微生物和/或抑微生物活性的肽。因此，如本文中使用的术语“抗微生物肽”特别指任何具有抗细菌、抗真菌、抗霉菌、 抗寄生物、抗原生生物、抗病毒、抗传染/感染(anti-infectious，anti-infective)和/或杀菌、杀藻、杀阿米巴、杀微生物、杀细菌、杀真菌、杀寄生物、杀原生生物(protozoacidal， protozoicidal)性的肽。如本文中使用的术语“防卫素”指存在于动物，优选哺乳类，更优选人之内的肽，其中所述防卫素在固有宿主防御系统中起摧毁外源物质如感染性细菌和/或感染性病毒和/ 或真菌的作用。防卫素是非抗体杀微生物和/或杀肿瘤蛋白质、肽或多肽。“防卫素”的实例为“哺乳动物防卫素”、“ α -防卫素”、“ β -防卫素”、indolicidin和马加宁(magainin)。 如本文中使用的术语“防卫素”指来自动物细胞的分离形式或人工合成的形式两者，且还指基本上保留其亲本蛋白质细胞毒活性，但其序列经一个或多个氨基酸残基的插入或缺失而改变的变体。如本文中使用的术语“寿司肽”指具有短的共同重复的补体调控蛋白(CCP)。寿司肽的寿司模块在许多不同蛋白质中作为蛋白质-蛋白质相互作用域起作用。已显示包含寿司域的肽具有抗微生物活性。如本文中使用的术语“阳离子性肽”指具有荷正电的氨基酸残基的肽。优选地，阳离子性肽具有9. 0或更高的pKa值。通常，所述阳离子性肽的至少四个氨基酸残基可荷正电，例如为赖氨酸或精氨酸。“荷正电”指所述氨基酸残基的侧链在接近生理环境具有净的正电荷。可重组产生的天然出现的阳离子性肽的实例为防卫素、马加宁、蜂毒肽和天蚕素 (cecropin)0如本文中使用的术语“聚阳离子性肽”指主要包含赖氨酸和/或精氨酸残基的合成产生的肽。如本文中使用的术语“两亲肽”指具有亲水性和疏水性功能基团两者的肽。优选地，如本文中使用的术语“两亲肽”指具有确定排列的亲水性和疏水性基团的肽，例如两亲肽可为例如α -螺旋，沿螺旋一侧主要为非极性侧链，而沿其其余的表面为极性残基。如本文中使用的术语“疏水基团”指基本上不溶于水，但溶于油相，且在油相中的溶解性高于在水中或在水相中的溶解性的化学基团如氨基酸侧链。在水中，具有疏水侧链的氨基酸彼此相互作用生成非水环境。具有疏水侧链的氨基酸的实例为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸和酪氨酸。如本文中使用的术语“缺失”指从对应的起始序列去除1、2、3、4、5或更多个氨基酸残基。如本文中使用的术语“插入”或“添加”指向对应的起始序列插入或添加1、2、3、4、5或更多个氨基酸残基。如本文中使用的术语“取代”指用不同的氨基酸替换位于某个位置的氨基酸残基。本发明涉及针对革兰氏阴性细菌的新颖的抗细菌剂，特别涉及包含(composed of)具有降解革兰氏阴性细菌细胞壁活性的酶和在N端或C端或两端融合于该酶的肽段的融合蛋白。在本发明的一个方面，具有降解革兰氏阴性细菌细胞壁活性的酶为细胞内溶素、 自溶素或细菌素。在本发明的另一个方面，根据本发明的酶可进一步包含不具酶活性并结合于宿主细菌细胞壁的区，所谓CBD (细胞壁结合域)。根据本发明的优选的融合蛋白描述于SEQ ID N0:36至63。根据SEQ ID NO 36 至63的融合蛋白可在N端包含一个或多个其他氨基酸残基。优选地所述其他氨基酸残基为甲硫氨酸。优选地，所述细胞内溶素由对革兰氏阴性细菌具有特异性的细菌噬菌体编码， 所述革兰氏阴性细菌如细菌组(group)、科、属或种的革兰氏阴性细菌，其包含人或动物病原性菌株，如肠杆菌科((埃希氏菌属(Escherichia)，特别是大肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属Shigella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Ehterobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、克雷伯氏菌属 (Klebsiella)特别是肺炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae)、摩根氏菌属(Morganella)、变形杆菌属(Proteus)、普罗维登斯菌属(Providencia)、沙雷氏菌属(krratia)、耶尔森氏菌属(Yersinia))、假单胞菌禾斗(Pseudomonadaceae)(假单胞菌属(Pseudomonas) > # 别是铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)、伯克霍尔德氏菌属(BurW10Ideria)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、鞘氨酉享单胞菌属(Sphingomonas)、 丛毛单胞菌属(Comamonas))、奈瑟氏菌属(Neisseria)、莫拉氏菌属(Moraxella)、 弧菌属(Vibrio)、气单胞菌属(Aeromonas)、布鲁氏菌属(Brucella)、弗朗西丝氏菌属(Francisella)、博德特氏菌属(Bordetella)、军团菌属(Legionella)、巴尔通氏体属(Bartonella)、考克斯氏体属(Coxiella)、嗜血菌属(Haemophilus)、巴斯德氏菌属 (Pasteurella)、曼氏菌属(Mannheimia)、放线杆菌属(Actinobacillus)、力口德纳氏菌属(Gardnerella)、螺旋体科(Spirochaetaceae)(密螺旋体属(Treponema)禾口疏螺旋体属(Borrelia))、钩端螺旋体科(Leptospiraceae)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、螺菌属(Spirillum)、链杆菌属(Str印tobacillus)、类杆菌科 (Bacteroidaceae)(拟杆菌属(Bacteroides)、梭杆菌属(Fusobacterium)、普雷沃氏菌属 (Prevotella)、卟啉单胞菌(Porphyromonas))、不动杆菌属(Acinetobacter)、特别是鲍氏不动杆菌(A. baumanii)。优选地，所述自溶素由革兰氏阴性细菌编码，所述革兰氏阴性细菌如细菌组 (group)、科、属或种的革兰氏阴性细菌，其包含人或动物病原性菌株，如肠杆菌科((埃希氏菌属Escherichia)，特别是大肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属 (Siigella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属 (EntercAacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)特别是肺炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae)、摩根氏菌属(Morganella)、变形杆菌属(Proteus)、普罗维登斯菌属(Providencia)、沙雷氏菌属Gerratia)、耶尔森氏菌属(Yersinia))、假单胞菌科 (Pseudomonadaceae)(假单胞菌属(Pseudomonas)、特另Ij是铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)、 伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、寡养单胞菌属(Menotrophomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas))、 奈瑟氏菌属(Neisseria)、莫拉氏菌属(Moraxella)、弧菌属(Vibrio)、气单胞菌属 (Aeromonas)、布鲁氏菌属(Brucella)、弗朗西丝氏菌属(Francisella)、博德特氏菌属(Bordetella)、军团菌属(Legionella)、巴尔通氏体属(Bartonella)、考克斯氏体属(Coxiella)、口f il 胃 M (Haemophilus)、 El H ft 胃 M (Pasteurella) > M K ^ M (Mannheimia)、放线杆菌属(Actinobacillus)、加德纳氏菌属(Gardnerella)、螺旋体科(Spirochaetaceae)(密螺旋体属(Ti^ponema)和疏螺旋体属(Borrelia))、钩端螺旋体科、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、螺菌属(Spirillum)、 链杆菌属(Streptobacillus)、类杆菌禾斗(Bacteroidaceae)(拟杆菌属(Bacteroides)、 梭杆菌属(Fusobacterium)、普雷沃氏菌属、吓啉单胞菌(Porphyromonas))、不动杆菌属 (Acinetobacter)、特另U是鲍氏不动杆菌(A. baumanii)。所述细菌素优选对上文所列的革兰氏阴性细菌具有特异性，但亦可为具较低特异性的。根据本发明的酶针对下述革兰氏阴性细菌具有细胞壁降解活性，所述革兰氏阴性细菌为细菌组(group)、科、属或种的革兰氏阴性细菌，其包含人或动物病原性菌株，如肠杆菌科((埃希氏菌属(Escherichia)，特别是大肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Siigella)、柠檬酸杆菌属(CitrcAacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(EntercAacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)特别是肺炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae)、摩根氏菌属(Morganella)、变形杆菌属(Proteus)、普罗维登斯菌属(Providencia)、沙雷氏菌属(krratia)、耶尔森氏菌属(Yersinia))、假单胞菌科 (Pseudomonadaceae)(假单胞菌属(Pseudomonas)、特另Ij是铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)、 伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、寡养单胞菌属(Menotrophomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、丛毛单胞菌属(Comamonas))、 奈瑟氏菌属(Neisseria)、莫拉氏菌属(Moraxella)、弧菌属(Vibrio)、气单胞菌属 (Aeromonas)、布鲁氏菌属(Brucella)、弗朗西丝氏菌属(Francisella)、博德特氏菌属(Bordetella)、军团菌属(Legionella)、巴尔通氏体属(Bartonella)、考克斯氏体属(Coxiella)、口f il 胃 M (Haemophilus)、 El H ft 胃 M (Pasteurella) > M K ^ M (Mannheimia)、放线杆菌属(Actinobacillus)、加德纳氏菌属(Gardnerella)、螺旋体科(Spirochaetaceae)(密螺旋体属(TMponema)和疏螺旋体属(Borrelia))、钩端螺旋体科、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、螺菌属(Spirillum)、 链杆菌属(Streptobacillus)、类杆菌禾斗(Bacteroidaceae)(拟杆菌属(Bacteroides)、 梭杆菌属(Fusobacterium)、普雷沃氏菌属、吓啉单胞菌(Porphyromonas))、不动杆菌属 (Acinetobacter)、特另U是鲍氏不动杆菌(A. baumanii)。来源于噬菌体或为野生型细胞内溶素的细胞内溶素部分的具体实例描述于下表表1 噬菌体公开文献野生型细胞内溶素细胞内溶素的预测功能Φν οPerry, L.L.和 Applegate, B.M.PhiV10p30壳多糖酶FELS-I McClelland, M.和Wilson5 R.K. STM0907.Fels0壳多糖酶Kropinksi, A.M.和McConnel, ε15epsilonl5p25壳多糖酶M.R.Ceyssens. P. (Laboratoiy for Gene裂解性糖基转移酶(C) /1个跨膜域
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本发明涉及针对革兰氏阴性细菌的抗微生物剂，特别涉及包含具有降解革兰氏阴性细菌细胞壁活性的酶和在N端或C端融合于该酶的肽段的融合蛋白。而且，本发明涉及编码所述融合蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的载体以及包含所述核酸分子或所述载体的宿主细胞。此外，本发明涉及所述融合蛋白作为药物，特别是用于治疗或预防革兰氏阴性细菌感染，作为诊断手段或作为美容用物质的用途。本发明还涉及处理或阻止食品、食物加工装置、食品加工厂、与食品相接触的表面、医疗装置、医院和手术中的表面的革兰氏阴性细菌污染的用途。此外，本发明涉及包含所述融合蛋白的药物组合物。