专利名称：一种微生物油脂的生产方法微生物油脂，又称单细胞油脂(Single Cell Oil，SCO)，是指由微生物在一定条件下合成并储存在菌体内的甘油脂，其脂肪酸组成与一般的植物油脂相似，主要是ci6、C18系脂肪酸，如棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚麻酸等。某些微生物如细菌、酵母、霉菌、微藻能够利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂作为碳源积累大量油脂，如果油脂积累量能超过细胞干重的20%,即称为产油微生物(Oleaginous microorganisms)。近二十年来，具有保健作用的功能性油脂日益受到人们的青睐，因此有关微生物油脂的探索主要集中在获取经济价值高的功能性油脂，如Y-亚麻酸(GLA)、花生四烯酸(AA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等。与此同时，随着化石资源日益枯竭，石油价格不断上涨；大量使用化石燃料引起的环境污染问题，对生物柴油等可再生能源的需求逐年递增。生物柴油，即长链脂肪酸单酯，是由各种油脂经转酯反应而得。传统的生物柴油原料以植物油脂、餐饮或工业废油脂为主，但植物油脂成本很高，且植物生长周期长，占地面积大，易受季节、气候影响；而餐饮或工业废油脂的数量有限，不能满足对可再生能源日益增长的需求，因此限制了生物柴油的大规模生产与应用。微生物油脂具有与植物油脂相似的脂肪酸组成，故被认为是生产生物柴油的良好原料。最近美国国家可再生能源实验室(NREL)的报道特别指出，微生物油脂发酵可作为生物柴油产业和生物经济的重要研究方向。产油微生物种类繁多、且具有油脂含量高、碳源利用广等特点，因此，微生物油脂的研究与开发已引起众多学者的关注。现有的微生物油脂发酵中使用的培养基主要由市售的葡萄糖、蛋白胨、酵母粉等配置的合成培养基，成本较高，高昂的培养基成本限制了微生物油脂的大规模生产，因此，探索可利用于微生物油脂生产的廉价原料具有重要意义。木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源，其主要成分为纤维素、半纤维素和木质素。我国是一个农业大国，各种农业废弃物，如玉米芯、农作物秸杆、蔗渣等数量巨大。过去，这部分木质纤维素资源经常被废弃或低值化利用，如农作物秸杆经焚烧后用于农田堆月巴，但焚烧过程中产生的黑烟会污染环境。利用玉米芯、农作物秸杆或蔗渣等木质纤维素资源来生产微生物油脂可大大降低微生物油脂的生产成本，但在木质纤维素的稀酸水解以及酶法水解前用稀酸预处理的过程中，会产生许多抑制微生物生长代谢的物质，如有机酸、醛类化合物和醇类化合物等。这些物质降低了水解液中还原糖的可发酵性，并抑制微生物细胞积累油脂。然而于大多数油脂微生物而言，油脂产率很低，并不能满足微生物油脂工业化生产的需求。当前，文献报道的可利用木质纤维素水解液发酵产油脂的仅有Trichosporon fermentans、Cryptococcuscurvatus、Yarrowia Iipolytica 等几种。因此，获得能够利用广谱碳源且在含抑制剂的木质纤维素水解液中高效积累油脂的菌株或菌株组合是实现廉价生产微生物油脂的关键。
本发明的目的是提供一种发酵过程简单、成本低廉，油脂得率系数高的微生物油脂的生产方法。本发明的微生物油脂的生产方法，其特征在于，包括以下步骤(a)油脂酵母的驯化将酵母菌株接种到驯化培养基中，25 35°C培养，逐渐增加驯化培养基中木质纤维素水解液的比例，待驯化培养基中木质纤维素水解液的比例为100%时，继续培养10 15天，得到油脂酵母，所述的驯化培养基包括10 30%的木质纤维素水解液和余量的发酵培养基，PH5. 0 8. 0，所述的发酵培养基包括木糖60g/L、蛋白胨I. 8g/L、酵母粉0. 5g/L，余量为水；(b)发酵以木质纤维素水解液为原料，调节其pH值为5. 0 8. 0，再将油脂酵母接入到木质纤维素水解液中，22 35°C振动培养2 10天，得到发酵液；(c)提取生物油脂收集发酵液中的菌体，干燥得到干菌体，将干菌体进一步破碎后得到细胞破碎液，再加入有机溶剂萃取微生物油脂，然后再蒸馏去除有机溶剂，得到微生物油脂。所述的步骤(a)中的酵母菌株优选为Trichosporon dermatis CCIC 32903或 Trichosporn coremiiforme CCIC 1256。 Trichosporon dermatis CCIC 32903 和Trichosporn coremiiforme CCIC1256都购自中国工业微生物菌种保藏中心,在该保藏中心的编号分别为CCIC 32903和CCIC1256。所述的步骤(a)中的逐渐增加驯化培养基中木质纤维素水解液的比例，优选是按每天5 %的量逐渐增加木质纤维素水解液在驯化培养基中的比例。所述的步骤(b)中的将油脂酵母接入木质纤维素水解液中优选是将油脂酵母接到发酵培养基中进行活化，24小时后再以4 10%的接种量接入木质纤维素水解液中。所述的步骤(C)中的将干菌体进一步破碎优选为按每克干菌体加入IOmL浓度为I.0 I. 5mol/L HC1，于 90 100°C处理 20 50min。所述的步骤(C)中加入有机溶剂萃取微生物油脂，优选，有机溶剂为氯仿和甲醇按体积比I 2 I I. 5的混合溶液，其加入量为细胞破碎液体积的I 3倍，再收集氯仿层，减压蒸馏去除氯仿得到微生物油脂。所述的木质纤维素水解液是由木质纤维素原料经常规酸水解或酶水解制得，其总糖浓度优选为30 100g/L。所述的木质纤维素原料优选为玉米芯、水稻秸杆、小麦秸杆、玉米秸杆、甘蔗渣、棉花杆以及其他草本植物中一种或数种。本发明的有益效果是本发明通过对酵母进行驯化得到油脂酵母，该驯化方法操作简单，驯化后所得到的油脂酵母在木质纤维素水解液中的油脂得率系数为13 20%，比驯化处理前提高20% 30%以上。本发明方法，无需对木质纤维素酶水解液进行脱毒等处理，仅需对木质纤维素酸水解液进行简单预处理，且木质纤维素水解液中无需添加任何氮源物质与微量元、素，接种酵母菌株之后，可以高效的利用不同糖类物质以及木质纤维素水解液发酵得到微生物油脂，发酵过程简单，成本低廉。以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例I :将玉米芯粉碎至20目，按照玉米芯与稀硫酸(浓度为2wt% )的固液比为Ig IOmL的比例加入稀硫酸，于125°C下水解I. 5h，过滤，用氢氧化钙把水解液pH调至7.0，过滤，得到玉米芯稀酸水解液，总糖浓度为40g/L。将玉米芯稀酸水解液和发酵培养基(木糖60g/L，蛋白胨I. 8g/L，酵母粉O. 5g/L，余量为水)按体积比10 : 90混合，配制成驯化培养基。以Trichosporn coremiiformeCCIC 1256为出发菌株，接种到驯化培养基中，用乙酸调节pH5. 0，30°C培养。按每天5%的量逐渐增加玉米芯稀酸水解液在驯化培养基中的比例，直到驯化培养基中玉米芯稀酸水解液的比例为100%，继续培养10天，得到驯化后的油脂酵母，其在玉米芯稀酸水解液中的油脂得率系数为20%，然后保存。在斜面上挑取3环上述驯化后的油脂酵母接种到50mL发酵培养基(木糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，余量为水)中进行活化，24小时后以4%的接种量转接到50mL玉米芯稀酸水解液中，于25°C、160r/min摇瓶振荡培养10天，停止发酵，得到发酵液；将发酵液于4000r/min离心IOmin,收集菌体,用水洗漆后于105°C干燥至恒重,得干菌体20. 5g/L0按每克干菌体加入IOmL I. Omol/L HCl,于100°C水浴20min ;冷却后再加入体积比为2 I的氯仿和甲醇混合溶液(30mL)进行萃取，收集氯仿层，用旋转蒸发仪减压去除有机溶剂，得到微生物油脂，其油脂含量为41.1%，油脂产率8. 4g/L。实施例2水稻秸杆的酶水解液的制备I)酸预处理将水稻秸杆粉碎至20目，按照水稻秸杆与稀硫酸(浓度为2wt% )固液比为Ig 8mL的比例加入稀硫酸，于130°C下水解3h。2)碱预处理将酸预处理后的水解液过滤收集固体、水洗后，按照固液比为Ig : 6ml的比例加入NaOH溶液(浓度为I. 5wt% ),于100°C、160r/min下处理2h。3)酶解将经过酸、碱预处理过后的水稻秸杆水解液过滤收集固体、水洗、干燥，按照20FPU纤维素酶(Sigam-Aldrich公司)/克纤维素和60IU β -葡萄糖苷酶(Novozyme) /克纤维素的加入量加入两种酶,于50°C、180r/min下酶解3. 5天,得到水稻稻杆酶水解液，总糖浓度为100g/L，其pH值为5. O。将水稻秸杆酶水解液和发酵培养基(木糖60g/L，蛋白胨I. 8g/L，酵母粉0. 5g/L，余量为水)按照30 : 70的比例混合,配制成驯化培养基。以Trichosporon dermatis CCIC32903为出发菌株，接种到驯化培养基中，用NaOH溶液(浓度为I. 5wt% )调节pH8. 0，35°C培养。按每天5 %的量逐渐增加水稻秸杆酶水解液在驯化培养基中的比例，直到驯化培养基中水稻秸杆酶水解液的比例为100%，继续培养15天，得到驯化后的油脂酵母，其在水稻秸杆酶水解液中的油脂得率系数为13%。
用NaOH溶液(浓度为I. 5wt % )调节水稻秸杆酶水解液pH8. 0，在斜面上挑取3环上述驯化后的油脂酵母接种到50mL发酵培养基(木糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉IOg/L，余量为水)中进行活化，24小时后以10%的接种量转接到50mL水稻秸杆酶水解液中，于35°C、160r/min摇瓶振荡培养9天，停止发酵，得到发酵液；将发酵液于4000r/min离心IOmin,收集菌体,用水洗漆后于105°C干燥至恒重,得干菌体50. lg/L。按每克干菌体加入IOmL I. 5mol/LHCl,于90°C水浴50min ;冷却后加入体积比为I I. 5的氯仿和甲醇混合溶液(20mL)进行萃取，收集氯仿层，用旋转蒸发仪减压去除有机溶剂，得到微生物油脂，其油脂含量为45. 8%，油脂产率22. 95g/L。实施例3按实例2对水稻秸杆进行酶水解，得到水稻秸杆酶水解液，总糖浓度为100g/L，其pH值为5. 0，加水稀释成总糖浓度为50g/L稻秸杆酶水解液。将水稻秸杆酶水解液和发酵培养基(木糖60g/L，蛋白胨I. 8g/L，酵母粉0. 5g/L，余量为水)按照15 : 85的比例混合,配制成驯化培养基。以Trichosporon dermatis CCIC32903为出发菌株，接种到驯化培养基中，用NaOH溶液(浓度为I. 5wt% )调节pH6. 5，25°C培养。按每天5 %的量逐渐增加水稻秸杆酶水解液在驯化培养基中的比例，直到驯化培养基中水稻秸杆酶水解液的比例为100%，继续培养12天，得到驯化后的油脂酵母，其在水稻秸杆酶水解液中的油脂得率系数为14. 5%。用NaOH溶液(浓度为I. 5wt % )调节水稻秸杆酶水解液pH6. 0，在斜面上挑取3环上述驯化后的油脂酵母接种到50mL发酵培养基(木糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉IOg/L，余量为水)中进行活化，24小时后以7. 5%的接种量转接到50mL水稻秸杆酶水解液中，于30°C、160r/min摇瓶振荡培养9天，停止发酵，得到发酵液；将发酵液于4000r/min离心IOmin,收集菌体，用水洗涤后于105°C干燥至恒重，得干菌体25. 7g/L。按每克干菌体加入IOmL I. 5mol/LHCl,于90°C水浴50min ;冷却后加入体积比为I I. 5的氯仿和甲醇混合溶液(IOmL)进行萃取，收集氯仿层，用旋转蒸发仪减压去除有机溶剂，得到微生物油脂，其油脂含量为46. 2%，油脂产率11. 9g/L。实施例4本实施例与实施例I的区别在于所选木质纤维素原料分别为水稻秸杆、甘蔗渣、玉米秸杆、小麦秸杆，按照实施例I的方法进行酸水解，其稀酸水解液的总糖浓度分别35g/L，42g/L，38g/L，32g/L。以 T. coremiiforme CCIC 1256 为出发菌株，按照实施例 I 的方法进行驯化、发酵、提取生物油脂。水稻秸杆、甘蔗渣、玉米秸杆、小麦秸杆稀酸水解液中，发酵的条件分别为接种量10 %，温度22°C，初始pH值5. 0，发酵10天；接种量5 %，温度25 V，初始PH值7. 0，发酵8天；接种量7. 5%，温度30°C，初始pH值7. 5，发酵6天；接种量5%，温度35°C，初始pH值8. 0，发酵9天，驯化后的油脂酵母的油脂产率分别7. 5g/L，8. 5g/L，7. 9g/L, 7. 2g/L。实施例5本实施例与实施例4的区别在于所用菌株为Trichosporon dermatis CCIC32903,水稻稻杆、甘鹿洛、玉米稻杆、小麦稻杆稀酸水解液中，发酵的条件分别为接种量10 %，温度22°C，初始pH值6. 5，发酵2天；接种量5 %，温度25°C，初始pH值7. 0，发酵7天；接种量7. 5 %，温度28 V，初始pH值7. 2，发酵6天；接种量5 %，温度32°C，初始pH值、8. O，发酵9天，其余的与实施例3相同。驯化后的油脂酵母在水稻秸杆、甘蔗渣、玉米秸杆、小麦秸杆稀酸水解液中的油脂产率分别3. 4g/L，7. lg/L，6. 5g/L，6. lg/L。实施例6本实施例与实施例2的区别在于所选木质纤维素原料为玉米芯、甘蔗渣、玉米秸杆、小麦秸杆。按照实施例2的方法进行酶水解，加水稀释成糖浓度分别85g/L，72g/L，78g/L，82g/L酶水解液。以T. dermatis CCIC 32903为出发菌株，按照实施例2的方法进行驯化、发酵、提取生物油脂，玉米芯、甘蔗渣、玉米秸杆、小麦秸杆酶水解液中，驯化后的油脂酵母的油脂产率分别 8. 5g/L，7. 7g/L，8. 2g/L，8. 3g/L。实施例7本实施例与实施例6的区别在于所用菌株为Trichosporn coremiiforme CCIC 1256，其余与实施例6基本相同。驯化后的油脂酵母在玉米芯、甘蔗渣、玉米秸杆、小麦秸杆稀酸水解液中的油脂得率分别8. lg/L, 7. 8g/L，7. 9g/L，8. 2g/L。


本发明公开了一种微生物油脂的生产方法。本发明通过对酵母进行驯化得到油脂酵母，该驯化方法操作简单，驯化后所得到的油脂酵母在木质纤维素水解液中的油脂得率系数为13～20％，比驯化处理前提高20％～30％以上，将驯化后的油脂酵母接种到木质纤维素水解液发酵，然后收集发酵液中的菌体，破碎菌体，用有机溶剂萃取，然后去掉有机溶剂得到微生物油脂。本发明方法，无需对木质纤维素酶水解液进行脱毒等处理，仅需对木质纤维素酸水解液进行简单预处理，且木质纤维素水解液中无需添加任何氮源物质与微量元素，接种酵母菌株之后，可以高效的利用不同糖类物质以及木质纤维素水解液发酵得到微生物油脂，发酵过程简单，成本低廉。