专利名称：一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的制备方法及其应用的制作方法自从我国研制的纯品三氧化二砷注射液问世以来，由于其良好的抗肿瘤效果， 在给患者带来福音，延长寿命的同时也带来了良好的社会效益。然而目前使用的三氧 化二砷注射液一般采用高纯度的化学药品而制，尚存在价格昂贵，临床使用肝肾毒性加 大，难以普及等缺陷。为此，寻找更多的天然含砷药物，开发更多天然、低毒和高效含 砷化和物，作为现有一线抗癌砷剂三氧化二砷的补充或替代品，将是现代创新中药的迫 切要求。近年的研究发现，一度因为毒性较大而不被重用的As2O3，被发现不是P-糖蛋 白作用底物，不会被P-糖蛋白泵出细胞外，在肿瘤产生MDR (多药耐药)时，可用低 毒剂量As2O3进行有效的治疗，As2O3高效地逆转了多种耐药肿瘤细胞(白血病、肺癌、 肝癌、乳腺癌、结肠癌等)的耐药，并在肿瘤耐药机理研究中取得突的进展，为此引发 各国学者的广泛兴趣。而在砷剂的减毒、增效研究方面，本发明人课题组的研究发现， 海洋微生物代谢并溶解的各种形态砷及其组合物，其在动物组织中砷蓄积毒性大幅度降 低，在动物体内几乎没有分布。与此同时，体内外药理活性试验表明，海洋微生物多形 态代砷化合物，不仅可以诱导多药耐药白血病细胞凋亡，而且可以下调MDRl/P-gp耐 药基因，达到其逆转多药耐药的作用。而且更重要的是，其诱导效应强于同类砷剂亚砷 酸。所以，亚砷酸(As2O3在水中溶解的主要形式)并非是逆转肿瘤多药耐药作用的唯 一活性物质，从天然矿物资源中开发多种形态的代谢砷作为As2O3的重要补充，将是极有 应用前景的药物开发方向。在我国天然矿物砷资源非常丰富，主要以硫化矿形式存在。最重要的矿 物包括砷黄铁矿(FeAsS)、毒砂(FeAsS)、斜方砷铁矿(Fe2AS3)、砷镍矿(NiAS2)、红砷镍矿(NiAS)、砷钴矿(CoAsS2)、砷黑幻铜矿(Cu4As12S13)、硫砷 铜矿(Cu3AsS4)、砷钼矿(PtAs2)、铁硫砷钴矿[C (OFe) AsS]>雄黄矿(As203、鸡 冠石)、雌黄矿(As2S3)等。而在这些矿物药物中、雄黄矿(As2S3)、雌黄(As2S3) 和雄黄矿(As203、鸡冠石)已经作为中国药典法定的药物在治疗肿瘤、寄生虫、杀虫等 方面取得显著的疗效。但是，与其药理、药效的研究力度相比，其提取工艺的研究相对 滞后，虽然采用传统和现代工艺包括水飞、水飞+醋制、精制、纳米化、微粉化，在一 定程度上提高了吸收和生物利用度，但是由于无法得到大量和减毒、多形态的活性砷化 合物，其毒性仍然较大。而在另一方面本发明课题组公开中国发明2006102000675专 利中，采用多种冶金用嗜酸性硫杆菌提取雄黄、自然铜、朱砂等矿物药物，单方面解决 这些矿物的溶解问题，提高了药物的生物利用度，但是使用这些技术增加雄黄溶解度的 同时，加入了大量的辅助元素(铁和铁的化和物)，由于这些外加元素的影响，往往使我们难于从这一复杂的体系中用简单的方法同时提取大量的砷酸(V)、亚砷酸(V)和 或二甲基砷酸(V)等含砷化和物，加之大量可溶性砷的溶出，在提高药效的同时，雄 黄的急性毒性急剧增大。尚未从更本上解决雄黄毒性的问题，加之研究的砷矿物种类较 少，实际应用仍有许多问题。
本发明的目的在于提供了一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷 化合物提取液的制备方法及其应用。本发明所制备的含砷化合物提取液其抑制肿瘤药 物活性成分明确，与同类、一线的抗癌化合物亚砷酸相比具有药效增强、毒性降低的特点ο为了达成上述目的，本发明的解决方案是一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的制备方法，包 括如下步骤1)制备提取用砷化矿细粉；2)海洋微生物代谢砷化矿超微粉体细粉。所述的制备提取用砷化矿细粉的步骤为将砷化矿粉粹至200目后，加入lmol/ L的硫酸和三氯化铁的混合液中，然后在转速为180 r/min、温度为30°C的恒温摇床中培 养15d，得到提取液；将提取液用孔径为0.45 μ m的滤膜过滤，得到滤液；所述滤液在 温度为20°C、磁力搅拌转速为800 1000 r/min的条件下进行反应沉淀，2 min后过滤， 得到沉淀物；然后沉淀物用去离子水洗涤后，在60°C温度下干燥，即得砷化矿超微粉体 细粉。所述的砷化矿采用砷黄铁矿(FeAsS)、毒砂(FeAsS)、斜方砷铁矿 (Fe2A83)、砷镍矿(NiAS2)、红砷镍矿(NiAS)、砷钴矿(CoAsS2)、砷黑幻铜矿 (Cu4Asl2S13)、硫砷铜矿(Cu3AsS4)、砷钼矿(PtAs2)、铁硫砷钴矿[C (OFe)AsS]>雄黄矿(As203、鸡冠石)、雌黄矿(As2S3)中的一种或多种天然矿物。(以上 砷化矿都为市售原料)所述的海洋微生物代谢砷化矿超微粉体细粉的步骤为称取0.1g 200目砷化矿超微 粉体细粉，于灭菌后的250mL锥形瓶中，加入LA液体培养基90mL，调节pH为5.0，待 稳定后，接种体积分数为20%的海洋微生物菌种，无菌对照中不加菌种；然后在30°C、 振荡速度为180r/min时摇瓶浸出15d;过程中定期检测调节pH值，用蒸馏水补充所蒸 发的水分，定时进行处理液中砷酸(V)、亚砷酸(V)和或甲基砷酸(V)和或二甲基 砷酸(DMA)和或三甲基胂氧(TMAO)和或砷硼烷(AsB)和或砷胆碱(AsC)的含 量检测，当上述多种成分的总含量低于0.1%后，停止震荡培养，过滤除菌后取上清液， 该上清液就是含砷化合物或含有该提取物的组合物，可直接做为药品或者用于制备药品 的原料。所述的LA液体培养基为酵母膏5g，蛋白胨IOg，氯化钠IOg，琼脂1 g，脱脂 奶粉lg。所述的海洋微生物菌种采用海水产碱菌(英文名Alcaligenes aquamarinus)，粪产碱杆菌(英文名Alcaligenes faecalis)，氧化醋酸杆菌(英文 名Acetobacter oxydans)，生黑醋杆菌(英文名Acetobacter melanogenum),产 酸克雷伯氏菌(英文名:Klebsiella oxytoca)，嗜酸乳杆菌(英文名Lactobacillus.
5acidophilus),乳酸乳杆菌(英文名Lactobacillus. Lactis)，短小芽孢杆菌(英文名: Bacillus pumilus), 球形芽孢杆菌(英文名Bacillus sphaericus), 棒杆菌(英文 名Corynebacterium),北京棒杆菌(英文名Corynebacterium pekinense),钝齿棒杆 菌(英文名Corynebacterium crenatum),谷氨酸棒杆菌(英文名Corynebacterium glutamicum)、乳糖发酵短杆菌(英文名Brevibacterium lactofermentum)、黄色短杆菌 (英文名Brevibacteriumflavum)中的一种或多种；且各菌种组合中菌种量的组合比例为 等比或非等比。当处理液中采用不同的多种菌种组合以及多种菌种不同组合比例时，可 以克服由于砷矿物存在来源、产地和组成的差异造成处理条件及效果的不同。(以上菌 种都为市售菌种)
所述的海洋微菌种优选采用海水产碱菌，钝齿棒杆菌和黄色短杆菌三种，且菌种量 的组合比例为等比。所述的摇瓶提取方式也可采用槽浸、柱浸、罐浸、生物反应器、发酵罐处理以 及微生物固定化处理方式替换，特别是当进行放大生产时通过上述方法进行砷化矿的生 物提取处理。一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的应用，采 用上述方法制备所得的含砷提取液单独或与其它药物原料配伍或加入药学上可以接受的 辅料后能分别制备成软胶囊、硬胶囊、滴丸、片剂、分散片、颗粒剂、注射液、口服 液、栓剂；经口服或皮肤或粘膜或直肠方式给药，在抑制肿瘤，杀菌、抗菌药物中得到 应用；这些药物组合物每单位制剂中含有砷酸(V)、亚砷酸(V)、甲基砷酸(V)、 二甲基砷酸(DMA)、三甲基胂氧(TMAO)、砷硼烷(AsB，arsenobetaine)、砷胆 碱(AsC，arsenocholine)提取物中的一种或者多种；且上述提取物的含量之和占药物总 量的 0.1%—100%。本发明的有益效果为(1)本发明的目的是利用特殊海洋微生物，海水产碱 菌、粪产碱杆菌、钝齿棒杆菌和氧化醋酸杆菌对天然药物含砷矿物进行微生物提取。在 此过程中，含砷矿物中所含的砷可以被海洋微生物氧化、溶解和甲基化代谢，从而促进 有效成分得以充分释放。形成多价态的含砷化合物例如砷酸(III)和亚砷酸(V)。 另一方面，利用特殊海洋微生物氧化砷(III)形成砷(V)的能力，产生毒性较低砷酸
(V)和或甲基砷酸(V)和或二甲基砷酸(DMA)和或三甲基胂氧(TMAO)和或 砷硼烷(AsB)和或砷胆碱(AsC)等多种天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物。据 此，就可以达到产生多种毒性比三氧化二砷更小、抑制肿瘤作用更强的新的有药用价值 成分的目的。(2)本发明操作过程简单，提取物，经过简单分离就可以使用，不需要 繁杂的提取分离措施做进一步处理。本发明利用特殊海洋物代谢，产生毒性较低砷酸
(V)、亚砷酸(V)和或甲基砷酸(V)和或二甲基砷酸(DMA)和或三甲基胂氧
(TMAO)和或砷硼烷(AsB)和或砷胆碱(AsC)等天然含砷化合物，以上活性剂的 剂量将因配方而异。一般的剂量为每单位制剂中含砷酸(V)、亚砷酸(V)和或甲 基砷酸(V)和或二甲基砷酸(DMA)和或三甲基胂氧(TMAO)和或砷硼烷砷硼烷
(AsB, arsenobetaine)和或砷胆碱(AsC)和或砷胆碱(AsC)的提取物之和为药物总 量的0.1% — 100%，也可根据不同的剂型选择不同的剂量。(3)本发明涉及的海洋 微生物种类多，培养条件简单，不需要极端的嗜酸、嗜碱或者强酸性等极端培养条件。不仅单一的微生物可以产生多种天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物，而且更重要的 是，如表1所示二种或三种微生物组合或更多微生物组合，在同一工艺条件下，可以 产生含量更高、或者形态更丰富的天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物。

本实施例的一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的 制备方法，包括如下步骤1)制备提取用砷化矿细粉；2)海洋微生物代谢砷化矿超 微粉体细粉。所述的砷化矿采用砷黄铁矿(FeAsS)、毒砂(FeAsS)、斜方砷铁矿 (Fe2A83)、砷镍矿(NiAS2)、红砷镍矿(NiAS)、砷钴矿(CoAsS2)、砷黑幻铜矿 (Cu4Asl2S13)、硫砷铜矿(Cu3AsS4)、砷钼矿(PtAs2)、铁硫砷钴矿[C (OFe) AsS]>雄黄矿(As203、鸡冠石)、雌黄矿(As2S3)中的一种或多种天然矿物。当然以 上的12种含砷矿物是比较常见的，但是本发明并不局限于这12种，其他的含砷矿物也同 样适用。所述的制备提取用砷化矿细粉的步骤为将砷化矿粉粹至200目后，加入lmol/ L的硫酸和三氯化铁的混合液中，然后在转速为180 r/min、温度为30°C的恒温摇床中培 养15d，得到提取液；将提取液用孔径为0.45 μ m的滤膜过滤，得到滤液；所述滤液在 温度为20°C、磁力搅拌转速为800 1000 r/min的条件下进行反应沉淀，2 min后过滤， 得到沉淀物；然后沉淀物用去离子水洗涤后，在60°C温度下干燥，即得砷化矿超微粉体 细粉。所述的海洋微生物代谢砷化矿超微粉体细粉的步骤为称取O.lg 200目砷化矿 超微粉体细粉，于灭菌后的250mL锥形瓶中，加入LA液体培养基90mL (培养基酵 母膏5g，蛋白胨IOg，氯化钠IOg，琼脂1 g，脱脂奶粉Ig)，调节pH为5.0，待稳定 后，接种体积分数为20%的海洋微生物菌种，无菌对照中不加菌种；然后在30°C、振荡 速度为180r/min时摇瓶浸出15d;(摇瓶提取方式也可采用槽浸、柱浸、罐浸、生物反 应器、发酵罐处理以及微生物固定化处理方式替换，特别是当进行放大生产时通过上述 方法进行砷化矿的生物提取处理)。过程中定期检测调节pH值，用蒸馏水补充所蒸发的 水分，定时进行处理液中砷酸(V)、亚砷酸(V)和或甲基砷酸(V)和或二甲基砷酸
(DMA)和或三甲基胂氧(TMAO)和或砷硼烷(AsB)和或砷胆碱(AsC)的含量检 测，当上述多种成分的总含量低于0.1%后，停止震荡培养，过滤除菌后取上清液，该上 清液就是含砷化合物或含有该提取物的组合物，可直接做为药品或者用于制备药品的原 料。如表1所示，本实施例采用不同菌种及其不同的配比组合提取含砷化合物提取 液后，其中砷酸(V)、一甲基砷酸(V)、二甲基砷酸(V)的含量分析结果(采用 毛细管电泳分离法进行检测条件为BGE PDC/10 mmoLI^1和CTAOH/1 mmol.L 电压25KV、温度25°C、pHll.O、紫外检测波长设定在216 nm。)
其中A:海水产碱菌；B粪产碱杆菌；C 氧化醋酸杆菌；D 生黑醋杆菌；E :产 酸克雷伯氏菌，F:嗜酸乳杆菌；G:乳酸乳杆菌；H:短小芽孢杆菌；I:球形芽孢杆 菌；J棒杆菌；K北京棒杆菌；L 钝齿棒杆菌；M谷氨酸棒杆菌；N 乳糖发酵 短杆菌；O :黄色短杆菌,X为15种菌的等比例混合物。
表1表明，本发明处理液中的菌种可以优选海水产碱菌，钝齿棒杆菌和黄色短 杆菌的组合，或者再在其内加入菌种粪产碱杆菌，或者为氧化醋酸杆菌，或者为生黑醋 杆菌，或者产酸克雷伯氏菌，或者嗜酸乳杆菌，或者乳酸乳杆菌，或者短小芽孢杆菌， 或者球形芽孢杆菌，或者棒杆菌，或者北京棒杆菌，或者谷氨酸棒杆菌、或者乳糖发酵 短杆菌之中中任选的细菌复合组成，各菌种相对量可以为等比例关系，也可以是非等比 关系。本发明处理液中也可以接种上述各细菌中的任意单一菌种，但这类处理液处理的 效果相对要低于用不同菌种组合的处理液。对于由于来源、产地和组成等原因造成一定 差异砷化矿药物，其处理液中的菌种还可在上述等比例关系的基础上适当改变菌种组合 比例。实施例2
本发明制备的含砷化合物提取液的动物急性毒性试验测定试验本实施例选用实 施例1中优选的海水产碱菌，钝齿棒杆菌和黄色短杆菌等比组合制备的含砷化合物提取 液。小鼠20只，雌雄各半，一次性ig本发明提取液0.2ml/10g (砷酸V，289.3mg/ mL ； 一甲基砷酸V，168.3mg/mL，二甲基砷酸V，69.7mg/ mL)，然后观察小鼠活动
情况及有无死亡，持续7天，发现与As2S3常规粗粉相比，小鼠死亡数降低，从表3结果 可以看出，(表3为本发明制备的提取液和亚砷酸小鼠口服后砷在体内分布变化情况) As2S3提取液的LD5tl值明显大于亚砷酸钠注射液(见表2，表2为本发明制备的提取液和 亚砷酸小鼠口服LD5tl变化情况表)，由此说明其毒性小于亚砷酸钠注射液。采用海洋微 生物(A:L:0=1:1:1 ；海水产碱菌钝齿棒杆菌黄色短杆菌)提取，其中砷在各个组 织分布极少，几乎没有蓄积，与其他给药组相比，具有显著差异(P <0.05或P <0.01) 。以上试验说明，利用本发明工艺提取As2S3可以得到三种比亚砷酸毒性低的砷形态化合 物。表3中* P < 0.05，或* * P < 0.01表示海洋组或亚砷酸与原粉组比较差异显 著；#P < 0.05,或##P < 0.01表示海洋组与亚砷酸组比较差异显著。实施例3
本实施例为抑制肿瘤活性测定试验收集处于对数生长期的骨髓瘤细胞系U266，在 50ml细胞培养瓶中将细胞密度调整为1 X IO6细胞/瓶。加入适量本发明提取液或亚砷酸 钠注射液，浓度调整二者终浓度均为2.5Umol / L。培养24h后，收集细胞，用冷磷酸缓 7中液(PBS，每升含 NaCl 8.0 g、KCl 0.20 g、Na2HPO4 1.15 g、KH2PO4 0.20 g、pH 7.4) 洗2次，加入FITC-Annexin V和PI，轻轻混勻，于4 °C避光放置30 min后，加入结合液 (BindingBuffer)，在1 h内用流式细胞仪检测其早期凋亡率和晚期凋亡率。结果见表4， 表4为本发明制备的提取液和亚砷酸钠注射液诱导骨髓瘤细胞U266凋亡的凋亡率比较。从表4可见，本发明提取液与亚砷酸钠注射液相比，诱导骨髓瘤细胞 U266凋亡的总凋亡率高于亚砷酸(81.12 — 65.78)，而且其早期凋亡率明显大于
(48.96 — 12.45)亚砷酸组，说明其抗癌活性明显好于亚砷酸钠注射液。据此说明，本 发明其抑制肿瘤的效果，与一线的抗癌化和物亚砷酸相比，本发明提取液抑制肿瘤凋亡 作用更为显著，达到了毒性更低、药效更强的药物效应。由此可见，海洋微生物提取天 然砷矿物达到了产生毒性比亚砷酸更小、药效更强的新的有药用价值成分的目的。
实施例4
一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的应用，采用实 施例1的方法制备所得的含砷提取液能制备成软胶囊、硬胶囊、滴丸、片剂、分散片、 颗粒剂、注射液、口服液、栓剂；经口服或皮肤或粘膜或直肠方式给药，在抑制肿瘤， 杀菌、抗菌药物中得到应用；这些药物组合物每单位制剂中含有砷酸、亚砷酸、甲基砷 酸、二甲基砷酸、三甲基胂氧、砷硼烷、砷胆碱提取物中的一种或者多种；且上述提取 物的含量之和占药物总量的0.1%。其中本实施例采用的制剂为每单位制剂中含砷化合 物含量组成经检测得到为砷酸(V) 0.1 %；亚砷酸(V) 0 % ；甲基砷酸(V) 0%； 二甲基砷酸(DMA) 0 % ；三甲基胂氧(TMAO) 0% ；砷硼烷砷硼烷(AsB) 0 % ； 砷胆碱(AsC) 0%。实施例5
一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的应用，采用实 施例1的方法制备所得的含砷提取液能制备成软胶囊、硬胶囊、滴丸、片剂、分散片、 颗粒剂、注射液、口服液、栓剂；经口服或皮肤或粘膜或直肠方式给药，在抑制肿瘤， 杀菌、抗菌药物中得到应用；这些药物组合物每单位制剂中含有砷酸、亚砷酸、甲基砷 酸、二甲基砷酸、三甲基胂氧、砷硼烷、砷胆碱提取物中的一种或者多种；且上述提取 物的含量之和占药物总量的100%。其中本实施例采用的制剂为每单位制剂中含砷化 合物含量组成经检测得到为砷酸(V) 25 % ；亚砷酸(V) 25 % ；甲基砷酸(V) 10%； 二甲基砷酸(DMA) 10 % ；三甲基胂氧(TMAO) 10%；砷硼烷砷硼烷(AsB) 10 % ；砷胆碱(AsC) 10%。实施例6
一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的应用，采用实 施例1的方法制备所得的含砷提取液能制备成软胶囊、硬胶囊、滴丸、片剂、分散片、 颗粒剂、注射液、口服液、栓剂；经口服或皮肤或粘膜或直肠方式给药，在抑制肿瘤， 杀菌、抗菌药物中得到应用；这些药物组合物每单位制剂中含有砷酸、亚砷酸、甲基砷 酸、二甲基砷酸、三甲基胂氧、砷硼烷、砷胆碱提取物中的一种或者多种；且上述提取 物的含量之和占药物总量的50%。其中本实施例采用的制剂为每单位制剂中含砷化合 物含量组成经检测得到为砷酸(V) 12.5 % ；亚砷酸(V) 12.5 % ；甲基砷酸(V) 5% ； 二甲基砷酸(DMA) 5% ；三甲基胂氧(TMAO) 5% ；砷硼烷砷硼烷(AsB) 5 % ；砷胆碱(AsC) 5%。实施例7
一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的应用，采用实 施例1的方法制备所得的含砷提取液能制备成软胶囊、硬胶囊、滴丸、片剂、分散片、 颗粒剂、注射液、口服液、栓剂；经口服或皮肤或粘膜或直肠方式给药，在抑制肿瘤， 杀菌、抗菌药物中得到应用；这些药物组合物每单位制剂中含有砷酸、亚砷酸、甲基砷 酸、二甲基砷酸、三甲基胂氧、砷硼烷、砷胆碱提取物中的一种或者多种；且上述提取 物的含量之和占药物总量的100%。其中本实施例采用的制剂为每单位制剂中含砷化合 物含量组成经检测得到为砷酸(V) 25%；亚砷酸(V) 10 %；甲基砷酸(V) 5%； 二甲基砷酸(DMA) 30%；三甲基胂氧(TMAO) 10%；砷硼烷砷硼烷(AsB) 10%；
9砷胆碱(AsC) 10%。


本发明公开一种海洋微生物提取天然、多形态、抑制肿瘤的含砷化合物提取液的制备方法，包括如下步骤1)制备提取用砷化矿细粉；2)海洋微生物代谢砷化矿超微粉体细粉后得到含砷提取液，及此种含砷化合物提取液在抗肿瘤药物中应用。本发明所制备的含砷化合物提取液其抑制肿瘤药物活性成分明确，与同类、一线的抗癌化合物亚砷酸相比具有药效增强、毒性降低的特点。