专利名称：金铁锁提取物及其制备方法、药物组合物和用途的制作方法金铁锁(Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu)为石竹科植物金铁锁的干燥根，是西南地区特有常用药，具有悠久的药用历史。根据苗族民间用药经验，其根可药用，具有解毒、散瘀、止痛、祛风除湿等功能。金铁锁既可单用，也可入复方。在苗族民间，金铁锁与七叶莲、透骨香、五花血藤配伍，主治风湿痹阻引起的肌肉酸痛、关节红肿疼痛、屈伸不利等症。目前，金铁锁的提取一般采用的是常规的水提醇沉法或醇提法，但对于金铁锁提取物的药理学研究尚未见报道。申请人经过广泛深入的研究发现，通过将金铁锁用有机溶剂、含水有机溶剂或水在一定条件下提取得到的金铁锁提取物对实验性RA关节痛具有显著的镇痛、抗炎效应，明显提高痛阈，降低血清NO/NOS；对小鼠细胞免疫主要形式之一的迟发性超敏反应、T淋巴细胞增殖反应有显著的免疫抑制作用，并显示出良好的治疗自身免疫性疾病和炎性疾病的作用。
本发明的目的在于提供一种金铁锁提取物及其制备方法、药物组合物和用途。本发明金铁锁提取物具有显著的免疫抑制作用和镇痛、抗炎效应，特别是对类风湿关节炎、肾小球肾炎、肾病综合症、桥本氏甲状腺炎、系统性红斑狼疮、特发性血小板减少紫癜、白塞氏病、自身免疫性肝炎、免疫性血管病；风湿性关节炎具有治疗作用。本发明是这样实现的金铁锁提取物的制备方法为将新鲜采集的金铁锁根晾干粉碎，得到金铁锁粗粉，然后用有机溶剂、含水有机溶剂或水加热回流或渗滤提取2～4次，提取液浓缩干燥后得到金铁锁提取物。所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙醚、石油醚或汽油。具体的说，金铁锁水提取物的制备方法为取金铁锁适量，粉碎成粗粉，加10倍量水煎煮2次，第一次2小时，第二次1.5小时，滤过，合并滤液，浓缩至60℃测相对密度为1.30，放冷，加入乙醇使含醇量为70％，静置过夜，取上清液减压浓缩至相对密度为1.25的稠膏，75℃减压干燥，即得。金铁锁醇提取物的制备方法为取金铁锁适量，粉碎成粗粉，加8倍量75％的乙醇回流提取2次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，余液浓缩至相对密度为1.25的稠膏，减压干燥，即得。
按上述金铁锁提取物制备方法提取得到的金铁锁提取物。
由上述金铁锁提取物组成的药物组合物包括作为活性成分的金铁锁提取物和一种或多种药用载体或赋形剂。
本发明金铁锁提取物用于制备治疗自身免疫性疾病的药物。
所述的自身免疫性疾病为类风湿关节炎、肾小球肾炎、肾病综合症、桥本氏甲状腺炎、系统性红斑狼疮、特发性血小板减少紫癜、白塞氏病、自身免疫性肝炎或免疫性血管病。
本发明金铁锁提取物用于制备治疗炎性疾病的药物。
所述的炎性疾病为风湿性关节炎。
本发明金铁锁提取物可单独或以药物组合物形式使用，因此还涉及含有作为活性成份的有效剂量的金铁锁提取物以及常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.1-90％重量的金铁锁提取物。药物组合物可根据本领域已知的方法制备。如果需要，可将金铁锁提取物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人用的适当的施用形式或剂量形式。
本发明的金铁锁提取物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。给药剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、检剂、膏剂、贴剂、注射剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片、多层片。为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氮化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将给药单元制成检剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将给药单元制成胶囊，将有效成分金铁锁提取物与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶囊或软胶囊中。也可将有效成分金铁锁提取物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。为了将给药单元制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。
此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
本发明金铁锁提取物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，所用的具体化合物，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。
为了验证本发明制备方法的合理性，申请人对金铁锁的提取工艺进行了试验研究和筛选，具体如下一、金铁锁水提取工艺的研究影响煎煮的主要因素有药材粉碎粒度、煎煮次数、加水量及煎煮时间等，申请人经过研究发现通过以下方法优选出的提取工艺可以认为是金铁锁的最佳水提取工艺，所得的提取物疗效最好。
取金铁锁药材适量，按下表1试验，以出膏率及金铁锁的药理活性评分作为评价指标进行提取工艺的优选，结果见表2、表3表1金铁锁提取工艺研究的因素水平表
表2金铁锁提取工艺优选结果表

表3正交试验方差分析表

注F0.05(2，2)＝19.00研究结果表明各因素对金铁锁水提取工艺影响大小的顺序为C＞B＞A＞D，其中B、C两个因素有显著性差异，B2＞B3＞B1，C2＞C3＞C1，因此，提取次数选2次，加水量选10倍；A、D两个因素没有显著性差异，但考虑到生产实际，选择粗粉，以方便过滤提取液，煎煮时间第一次定为2小时，第二次定为1.5小时。
因此，金铁锁水提取物的最佳提取工艺为取金铁锁适量，粉碎成粗粉，加10倍量的水煎煮2次，第一次2小时，第二次1.5小时，滤过，合并滤液。
金铁锁药材经水提浓缩后，除杂相当关键，申请人采用不同浓度的乙醇进行醇沉以除去杂质，方法如下
取金铁锁粗粉，按优选的水提煎煮条件煎煮提取，减压浓缩(60-75℃，-0.08Mpa)至相对相密度1.30(60℃)，摇匀，量取一定量浓缩液，加乙醇，使乙醇含量为60％、70％、80％，醇沉24小时，取上清液减压回收乙醇，挥干，减压干燥(65-80℃，-0.08Mpa)，称醇提物重量；醇沉物减压干燥(65-80℃，-0.08Mpa)，称杂质重量。测定醇提物的药理活性，试验结果见表4。
表4除杂工艺研究结果表

研究结果表明醇沉浓度为70％时，除去的杂质最多，同时药理活性最高，因此，选用70％的乙醇浓度作为去除杂质的浓度。
浓缩工艺的研究申请人考察了减压浓缩和常压浓缩两种方法，经过优选发现，减压浓缩和常压浓缩两种方法比较，减压浓缩较常压浓缩快，节约时间，且药理活性比常压浓缩高，因此，选择减压浓缩作为本提取物制备的浓缩方法。
干燥工艺申请人研究发现，干燥温度对提取物的药理活性有一定的影响，本提取物在75℃减压干燥的药理活性最好，因此，选择75℃减压干燥作为本提取物的干燥方法。
二、金铁锁醇提取工艺的研究影响提取的主要因素有提取次数、溶媒用量、溶媒浓度及提取时间等，申请人经过研究发现通过以下方法优选出的提取工艺可以认为是金铁锁的最佳醇提取工艺，所得的提取物疗效最好。
取金铁锁药材适量，粉碎成细粉，按表5进行试验，结果见表6、表7表5金铁锁醇提取工艺研究的因素水平表

表6金铁锁醇提取工艺优选结果表

表7正交试验方差分析表

注F0.05(2，2)＝19.00研究结果表明各因素对金铁锁醇提取工艺影响大小顺序为C＞B＞A＞D，通过直观分析，选择C2、B2、A2、D2作为最佳提取工艺，即金铁锁适量，粉碎成粗粉，加8倍量75％的乙醇回流提取2次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，余液浓缩至相对密度为1.25的稠膏，减压干燥，即得金铁锁醇提取物。
为了确保本发明的效果，申请人对所述金铁锁提取物进行了生物活性实验，具体如下观察指标鸡蛋清致大白鼠足跖肿胀实验(抗急性炎症作用)；小白鼠扭体实验(镇痛作用)；环磷酰胺诱导小鼠迟发性超敏反应(免疫抑制作用)；小鼠脾淋巴细胞的增殖反应(体内)。
该生物活性实验所采用的金铁锁提取物均为用乙醇作为提取溶剂得到的提取物。
1.金铁锁提取物对鸡蛋清致大白鼠后足跖肿胀的影响方法及结果取Wistar大白鼠30只，称重，用苦味酸标记，分为3组将大鼠右后肢用手固定，在其踝关节处用圆珠笔作一标志，动物的右后肢浸入足容量测量装置内，浸入深度以标志处为界。从该装置的刻度吸管处所读取的数值即为动物右足的正常体积。连续测两次，求其平均值。给3组动物分别灌胃以下药物金铁锁提取物制得的溶液，氢化可的松，生理盐水，容量均为1ml/100g。30min后在每鼠右后肢掌心向踝关节方向进针，皮下注射10％鸡蛋清液0.1ml/只。其后每0.5小时分别测定鼠右后肢的容积，连续3次。
实验结果(表8)表明，金铁锁提取物具有良好的抗炎作用(比氢化可的松强)。
表8金铁锁提取物对鸡蛋清致大白鼠后足跖肿胀的影响

注**表示与生理盐水组比较差异极显著(P＜0.01)2.金铁锁提取物对小白鼠的镇痛作用(扭体法)方法及结果昆明种小白鼠40只，体重18-22g，♀♂各半，将小白鼠腹部的毛剪掉，随机分为2组，每组20只。给药组灌服金铁锁提取物0.3g/10g，对照组灌服等量生理盐水。给药后30min，各鼠腹腔注射0.6％醋酸溶液0.2ml/只。观察并记录注射醋酸溶液后15-30min内出现扭体反应的次数及时间。计算金铁锁提取物的镇痛百分率。结果见表9。
结果表明金铁锁提取物对醋酸所致小白鼠扭体反应有明显的抑制作用。
表9对醋酸所致小白鼠扭体反应的影响(x±s)

3.金铁锁提取物对环磷酰胺诱导小鼠迟发性超敏反应的影响方法及结果昆明种小白鼠32只，随机分为4组，每组8只，即正常对照组(0.5％CMC-Na0.2mL/10g)、阳性对照组(强的松)5mg/kg、金铁锁提取物低、高剂量组，剂量分别为5％、10％，各动物均为1次/dig。各组动物按上述剂量连续给药7d；于实验的第4天以1％DNCB丙酮麻油液致敏，致敏前1天开始皮下注射给药，每日1次，连续6d，致敏后第5天用1％二硝基氟苯10μl涂右耳耳郭两面进行攻击，24h后，颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳郭，用直径8mm不锈钢铳子冲下耳片，称重，同时取小鼠胸腺和脾脏，称重，以左右耳片重量差为肿胀度，计算胸腺指数和脾脏指数。结果见表10。
结果表明金铁锁提取物对环磷酰胺诱导小鼠迟发性超敏反应有明显的抑制作用。
表10对小鼠迟发性超敏反应的影响

4.口服金铁锁提取物对小鼠脾细胞增殖反应的影响LACA小鼠，♀，6-8wk，随机分成3组即对照组、金铁锁提取物0.6g/kg和1.2g/kg两剂量组，每组10只。给药组每天口服给药，共5天。对照组用等体积的生理盐水代替。第六天处死小鼠，无菌取脾制备脾细胞悬液，用RPMI-1640(含10％胎牛血清)培养液调整细胞浓度为5×106/ml，取100μl细胞悬液和等量1640或ConA(终浓度0.5μg/ml)加入96孔培养板内，于5％CO2、37℃温箱孵育54小时，每孔加入20μl3H-TdR(10μCi/ml)，继续培养至72小时，以多道细胞收集仪收集细胞于滤纸上，干燥后以液体闪烁记数仪测cpm值。每个样品10个平行孔，结果用平均cpm值表示。
实验结果表明口服给予0.6g/kg或1.2g/kg金铁锁提取物，对LACA小鼠脾细胞增殖反应有显著的抑制作用，并有计量依赖关系。结果见表11表11口服金铁锁提取物对LACA小鼠脾细胞增殖反应的影响

*p＜0.05，**p＜0.01(与对照组比较)结论上述四个实验结果表明，金铁锁提取物对小鼠脾细胞增殖反应具有明显的抑制作用；具有明显的镇痛、抗炎作用；具有显著的免疫抑制作用；对迟发性超敏反应具有很好的抑制作用。

本发明的实施例2金铁锁乙醇提取物的制备取金铁锁根干品10kg，粉碎成粗粉，加8倍量75％的乙醇回流提取2次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，余液浓缩至相对密度为1.25的稠膏，减压干燥，即得金铁锁乙醇提取物480g。
本发明的实施例3金铁锁石油醚提取物的制备将金铁锁根干品10kg粉碎后，用石油醚加热回流提取，每次用石油醚40L，提取3次，合并提取液，减压蒸发至干，得到石油醚提取物420g。
本发明的实施例4金铁锁乙酸乙酯水溶液提取物的制备将金铁锁根干品10kg粉碎后，用乙酸乙酯水溶液加热回流提取，每次用乙酸乙酯水溶液60L，提取2次，合并提取液，减压蒸发至干，得到乙酸乙酯水溶液提取物420g。
本发明的实施例5金铁锁三氯甲烷提取物的制备将金铁锁根干品10kg粉碎后，用三氯甲烷渗滤提取，每次用三氯甲烷30L，提取4次，合并提取液，减压蒸发至干，得到三氯甲烷提取物380g。
本发明的实施例6含金铁锁提取物的药物组合物1金铁锁水提取物200g，土温-80 4g，植物油196g，以上三味混合，用胶体磨混匀，压制成1000粒软胶囊。本制剂口服，每次4粒，每日3次，用于治疗自身免疫性疾病如类风湿关节炎、肾小球肾炎、肾病综合症、桥本氏甲状腺炎、系统性红斑狼疮、特发性血小板减少紫癜、白塞氏病、自身免疫性肝炎或免疫性血管病。
本发明的实施例7含金铁锁提取物的药物组合物2按下述配比称取原料金铁锁300g、见血飞200g、黑骨藤200g。以上三味，加水煎煮二次，每次2小时，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.20(60℃)，加乙醇至浓度为70％，静置过夜，取上清夜，浓缩，减压干燥，加入淀粉等辅料适量，粉碎成细粉，装胶囊，即得胶囊剂。本制剂口服，每次4粒，每日3次，用于治疗自身免疫性疾病如类风湿关节炎、肾小球肾炎、肾病综合症、桥本氏甲状腺炎、系统性红斑狼疮、特发性血小板减少紫癜、白塞氏病、自身免疫性肝炎或免疫性血管病。
本发明的实施例8含金铁锁提取物的药物组合物3按下述配比称取原料金铁锁300g、独活150g、羌活150g、川芎150g、乳香100g、红花100g、杜仲50g、黄芪50g。以上八味，加10倍量水煎煮二次，第一次2小时，第二次1.5小时，滤过，合并滤液，浓缩至相对密度为1.20(60℃)，加乙醇至浓度为70％，静置过夜，取上清夜，浓缩，减压干燥，加入淀粉等辅料适量，按照常规工艺压制成1000片。本制剂口服，每次3片，每日3次，用于炎性疾病如风湿性关节炎的治疗。
本发明的实施例9金铁锁提取物单方制剂取金铁锁提取物150g、植物油117.6g、蜂蜡2.4g混匀，用胶体研磨机研磨均匀，用压制法罐装成软胶囊，制成1000粒，每粒0.3g。本制剂口服，一次3粒，一日3次。用于治疗跌打损伤、创伤出血、风湿疼痛等。


本发明提供了一种金铁锁提取物及其制备方法、药物组合物和用途。金铁锁提取物是将新鲜采集的金铁锁根晾干粉碎，得到金铁锁粗粉，然后用有机溶剂、含水有机溶剂或水加热回流或渗滤提取2～4次，提取液浓缩干燥后得到的。本发明金铁锁提取物具有显著的免疫抑制作用和镇痛、抗炎效应，特别是对自身免疫性疾病，如类风湿关节炎、肾小球肾炎、肾病综合症、桥本氏甲状腺炎、系统性红斑狼疮、特发性血小板减少紫癜、白塞氏病、自身免疫性肝炎、免疫性血管病；炎性疾病，如风湿性关节炎具有治疗作用。