专利名称：新型植物乳杆菌及其组合物的制作方法在韩国传统的发酵食品，例如泡菜中发现的乳酸菌栖息于人体的消化系统中，分解纤维材料并将蛋白质合成重要营养素。有活力的微生物如乳酸菌对宿主的消化道有益， 因为这些微生物改善宿主的肠道微生物环境，该宿主如动物，包括人类，这些微生物被称为益生菌。因为益生菌需要口服施用，直达小肠并附着在小肠表面以发挥益生菌的作用，所以益生菌需要具有优良的耐酸性和胆汁耐受性，以及对肠上皮细胞的强附着力。在韩国传统的发酵食品，例如泡菜中普遍发现的乳酸杆菌乳酸菌是益生菌。乳酸杆菌微生物在同型发酵或异型发酵下产生乳酸，而且普遍在包括人类的动物肠道中和乳制品及蔬菜发酵中发现。乳酸杆菌微生物保持酸性PH值平衡以抑制有害细菌，如大肠杆菌或梭菌的增殖，并缓解腹泻和便秘。乳酸杆菌微生物还合成维生素，具有抗癌活性并降低血清胆固醇。已知由乳杆菌产生的乳酸菌素用于抑制志贺氏菌、沙门氏菌、葡萄球菌、大肠杆菌等的生长。乳酸菌素还抑制导致腹泻的微生物的增殖，并使肠道菌群正常化以预防腹泻 (Michael 禾口 Philippe，Probiotics and prebiotics :Effects on diarrhea,The journal of nutrition, Volume 137, March 2007, pages 803S—811S ；Roberfroid, Prebiotics and probiotics :Are they functional foods ？ ,American journal of clinical nutrition, Volume 71，June 2000，pages 1682S-1687S)。根据上述乳酸杆菌微生物的功能，对作为益生菌和牲畜饲料的乳酸杆菌微生物进行了积极研究。牲畜体内出现的细菌性腹泻导致死亡并降低增重率。因此，普遍使用向牲畜饲料加入抗生素的方法来预防细菌性腹泻并增加牲畜的生产力。然而，由于牲畜体内出现的抗生素耐药菌和残留抗生素，抗生素的使用受限，而提出了饲养牲畜的有机方法(韩国专利公开号 1998-78358) (McEwen禾口Fedorka-Cray,Antimicrobial use and resistance in animals, Clinical infectious Diseases, Volume 34, June 2002, pages S93-S106)。此外，已知乳酸菌如乳酸杆菌微生物具有增强免疫应答作用。因此，对乳酸菌在增强免疫应答方面的作用机制进行了研究。尽管没有揭示特殊机制，获知乳酸菌口服施用，并且存在于肠道中以影响肠道免疫系统。例如，已知通过酸奶吸收乳酸菌以增强淋巴集结的淋巴细胞的抗菌活性。根据对动物和人类的研究，已知乳酸菌增强IgA应答。此外，在体内对外部微生物病原体表现出对抗性的免疫系统分为先天免疫和适应性免疫，两者都受乳酸菌影响。根据肠道免疫系统的先天免疫，已知乳酸菌预防并杀死病原体，从而具有使机体保持健康不受感染的功能。先天免疫反应在感染的早期阶段抑制外部病原体数量增长方面起重要作用。另外，先天免疫反应递送抗原和共刺激分子，从而诱发先天免疫系统之后的适应性免疫的活化。涉及先天免疫反应的代表性免疫细胞包括NK细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞(Fearon DT, Locksley RM, Science 1996,272 :50-53, The instructiverole of innate immunity in the acquired immune response)。当受i式者感染时，适应j"生免疫实质地诱发了外部病原体的去除，而且对应于适应性免疫的免疫细胞包括T淋巴细胞和B淋巴细胞。因此，对外部病原体的物理抗性可能取决于适应性免疫活性的增强(Gowms JL. , Immunology Today. 1996Jun ； 17 (6) :288-91,The lymphocyte—a disgraceful gap in medical knowledge)0根据适应性免疫，将分解抗原以使其接触T淋巴细胞的巨噬细胞活化以增加多种细胞因子，特别是白细胞介素、IL-12和IL-18的产生。在这方面，乳酸菌细胞壁的某些成分激活NF-K B和STAT信号在巨噬细胞中转换以增加细胞因子的产生。此外，已知乳酸菌在抗原呈递细胞诸如树突状细胞中增加IL-12、IL-18和TNF- α的产生，该树突状细胞通常在消化系统的淋巴节和粘膜中发现。而且，已知乳酸菌增加了树突状细胞中表面分子的表达，该树突状细胞活化了 T淋巴细胞，如MHC II类和Β7-2 (Cross等，Anti-allergy properties of fermented foods :an important immunoregulatory mechanism of lactic acid bacteria ？ , International Immunopharmacology,Volume l,May 2001,pages 891-901)。在乳酸杆菌微生物和免疫反应之间的相互关系方面已经进行了很多研究。具体地，已知某些乳酸杆菌(例如发酵乳杆菌)增强抗原特异性免疫反应，因此尝试着将其作为细菌(例如白喉、破伤风)或病毒(例如流感病毒、脊髓灰质炎病毒)疫苗的佐剂使用(de Vrese等，2005 ;01ivares等，2007 Jest等，2008)。认为乳酸杆菌微生物的免疫增强作用是源自通过特异性乳酸杆菌微生物而增强的Thl型产生细胞因子的T淋巴细胞的活性，其有效地诱发了在适应性免疫中的一般免疫细胞的生长和T细胞或B细胞的活性(Mohamadzadeh 等，Lactobacilli activate human dendritic cells that skew T cells toward T helper 1 polarization. , Proc Natl Acad Sci USA. 2005 22 ；102 (8) 观80-28邪)。为了测量T淋巴细胞的增强活性，近年来积极对测量产生的IFN-γ的数量进行研究(Shida等，2006 foligne等，2007)。已知诱发一般免疫细胞生长可以预防或治疗消化道(肠道)感染(Jain S，Yadav H，Sinha PR. Probiotic dahi containing Lactobacillus casei protects against Salmonella enteritidis infection and modulates immune response in mice. J Med Food. 2009Jun ； 12 (3) :576-83.)、泌尿生殖道感染(Zarate G，Santos V，Nader-Macias ME. Protective effect of vaginal Lactobacillus paracasei CRL 1289 against urogenital infection produced by Staphylococcus aureus in a mouse animal model. Infect Dis Obstet Gynecol. 2009 ； 2009 :48358. Epub 2007 Mar 29·)、呼吸道感染(Yasuda Y，Matsumura Y，Kasahara K， Ouji N，Sugiura S，Mikasa K，Kita Ε. Microbial exposure early in life regulates airway inflammation in mice after infection with Streptococcus pneumoniae with enhancement of local resistance. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2009 Sep 25 [Epub ahead of print])、螺杆菌感染(Boyanova L，Stephanova-Kondratenko M， Mitov I. Anti-Helicobacter pylori activity of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus strains !preliminary report.Lett Appl Microbiol. 2009 May ；48 (5) 579-84. Epub 2009Mar 9.)禾口过敏反应(Ouwehand ACiNermes MiCollado MCiRautonen N， Salminen S， Isolauri Ε.Specific probiotics alleviate allergic rhinitis during the birch pollen season. World J Gastroenterol. 2009 Jul 14 ； 15 (26) :3261-8)。T淋巴细胞控制适应性免疫，其可以分为作为细胞免疫的Thl应答和作为体液免疫的Th2应答。Thl和Th2应答在抗原呈递细胞中产生不同的细胞因子。在Thl应答中，主要产生IL-2、IL-12、IL-18和干扰素-γ (IFN- y ) 在Th2应答中，主要产生PGE2、IL-4和 IL-IO0需要平衡Thl和Th2应答。如果Thl和Th2应答不平衡，会产生多种免疫性疾病。 Thl细胞主要对抗病原体，但Th2细胞主要涉及过敏症和炎症应答。当Thl和Th2应答在正常状态时，Th2细胞保护人体不受灰尘和其它不期望的物质的侵害。然而，如果Th2细胞过度应答，增加IgE抗体的产生，从而导致对人体无害的蛋白质的过敏反应，该蛋白质如花粉和食物。因此，应该平衡Thl和Th2应答的比例。这两者中任何一个的过度或不充分应答都会导致疾病。此外，由于持续性压力导致皮质醇的持续性分泌减少Thl应答并增加Th2 应答，从而引发癌症、特应性疾病、过敏症和自身免疫性疾病(Elenkov和Chrousos，Stress hormones, Thl/Th2 patterns, pro/anti-inflammatory cytokines and susceptibility to disease, Trends in Endocrinology and Metabolism, Volume 10, November 1999, pages 359-368)。根据体内实验，乳酸菌增加了 IL-2和IFN-Y的产生，它们是T淋巴细胞中的Thl 细胞因子，并且乳酸菌抑制了 IL-4和IL-5的产生，它们是Th2细胞因子(Matsuzaki等，The effect of oral feeding of Lactobacillus casei strain Shirota on immunoglobulin E production in mice, Journal of Dairy Science, Volume 81, January 1998, pages 48-53)。同时，IL-12和IL-18是在巨噬细胞或树突状细胞中产生的重要的细胞因子，其将 ThO淋巴细胞分化为Thl淋巴细胞。已知当在培养过程中用乳酸菌处理脾细胞或巨噬细胞时，增加IL-12、IL-18和IFN- α的产生取决于乳酸菌的浓度。因此，乳酸菌增加了巨噬细胞中IL-12、IL-18和IFN- α的产生，从而促进ThO向Thl的分化并诱导形成IFN- γ，因此乳酸菌在Th2应答萌芽阶段对平衡Thl/Th2起重要作用(Cross等，Anti-allergy properties of fermented foods :an important immunoregulatory mechanism of lactic acid bacteria ？ , International Immunopharmacology,Volume l,May 2001,pages 891-901)。 因此，已知乳酸菌预防和治疗由Th2的过度应答导致Thl/Th2失衡而诱发的癌症、特应性疾病、过敏症和自身免疫性疾病。
技术问题当寻找比常规乳酸菌具有更好免疫增强活性的新型乳酸菌时，本发明的发明人分离并确定了从韩国传统发酵食品中分离出的乳酸杆菌细菌。因此，本发明提供了乳酸杆菌菌株，其具有良好的增强免疫应答作用，特别地，具有促进IFN- γ，Thl型细胞因子产生、诱发一般免疫细胞的增殖和对抗由Th2过度应答导致的Thl/Th2失衡的良好活性，并且具有良好的构成益生菌的基本性质的耐酸性、胆汁耐受性和对肠上皮细胞的强附着力。本发明还提供了包含乳酸杆菌菌株的组合物以预防或治疗肠道紊乱病。本发明还提供了包含乳酸杆菌菌株的组合物以增强免疫应答。技术方案根据本发明的一个方面，提供了植物乳杆菌C几PM3(保藏在韩国微生物保藏中心(KCCM)，保藏日期2009年10月14日，保藏号=KCCMl 1045P)。根据本发明的一个方面，提供了包含植物乳杆菌C几PM3的组合物以预防或治疗肠道疾病。根据本发明的一个方面，提供了包含植物乳杆菌C几PM3的组合物以增强免疫应答。在下文中，将参考以下附图对本发明进行更全面地描述，其中示出了本发明的示范实施方案。根据本发明的一个方面，植物乳杆菌C几P243是从韩国传统发酵食品中分离并确定的新型植物乳杆菌菌株。韩国传统发酵食品可以是泡菜、发酵蔬菜、豆酱、酱油、清国酱 (chungkookjang)、发酵鱼等等，但不限于此。确定并分类植物乳杆菌的16S rRNA碱基序列测试结果显示，植物乳杆菌CJLPM3 与植物乳杆菌标准菌株(植物乳杆菌NBRC15891T，GenBank登录号AB326351)具有最高同源性(99.9%)，并显示其与植物乳杆菌有最近分子系统学亲缘关系。因此，所述微生物确定为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌CJLPM3，并且于2009年10月14日保藏于韩国微生物保藏中心(KCCM)(保藏号KCCM11045P)。植物乳杆菌CJLPM3的16S rRNA基因的碱基序列在以下所附序列表中的SEQ ID NO :1上示出。植物乳杆菌CJLP243是革兰氏阳性细菌和兼性厌氧菌，其可以在有氧和厌氧条件下生长，不产生孢子，不具有游动性，而且具有杆状形状。根据本领域已知的常规方法，已经分析了植物乳杆菌C几PM3的具体形态学和生理学性质，在下表1中示出。表 1[表 1]植物乳杆菌CJLP243(KCTC11045P)，一种包含植物乳杆菌CJLP243的治疗肠道疾病的组合物，和一种包含植物乳杆菌CJLP243的增强免疫应答的组合物。