专利名称：一种黄色短杆菌及其应用及发酵制备赖氨酸的方法赖氨酸是人和动物营养的八种必需氨基酸之一。它对调节体内代谢平衡、提高体内对谷类蛋白质的吸收、改善人类膳食营养和动物营养、促进生长发育均有重要作用。目前主要用于医药、食品和饲料工业，从消费结构上看，赖氨酸在饲料中的消费占了近90%，而在食品及医药中间体的消费仅占10%。赖氨酸多是通过微生物发酵来制备，一般通过将赖氨酸发酵菌种在种子罐培养后接种至发酵罐中发酵产生赖氨酸，黄色短杆菌是一种常用的赖氨酸发酵菌种。为了提高赖氨酸的生产能力，进行菌株改良，开发具有高产率的菌株是重点的研究方向。
本发明的目的是为了提高发酵法生产赖氨酸的生产能力，提供一种新的黄色短杆菌及采用该黄色短杆菌作为发酵菌种发酵制备赖氨酸的方法。为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种黄色短杆菌，其特征在于，所述黄色短杆菌的保藏编号为CGMCC5341。另一方面，本发明提供了一种如上所述的黄色短杆菌在发酵制备赖氨酸中的应用。第三方面，本发明提供了一种发酵制备赖氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括在生成赖氨酸的条件下，将如权利要求1所述的黄色短杆菌接种至发酵培养基中进行发酵培养。本发明提供的黄色短杆菌，保藏编号为CGMCC5341，采用该黄色短杆菌作为发酵菌种发酵制备赖氨酸，可提高终点赖氨酸含量、单罐供酸量和转化率。本发明的其他特征和优点将在随后的部分予以详细说明。生物保藏本发明的菌株被命名为黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)，并于2011年10 月14日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101)(保藏单位的缩写为 CGMCC)，保藏编号为 CGMCC5;341。3以下对本发明的进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的
仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。一方面，本发明提供了一种黄色短杆菌，该黄色短杆菌的保藏编号为CGMCC5341。将该黄色短杆菌在30-32°C下，在固体培养基(含有1重量％蛋白胨，1重量％酵母膏和0. 5重量％ NaCl的pH7. 0的琼脂培养基)上培养M_30h，在显微镜下观察，发现 该菌株在琼脂培养基上形成1. 0-1. 4mm厚的菌膜，细胞短杆近球形，不形成孢子，无鞭毛， 不运动。该菌株最适生长温度为25-32°C，革兰氏染色阳性，G+，在水中为均勻悬浮液，菌落圆形，奶油色，边缘光滑，菌落产生非水溶性黄色素。本发明中的黄色短杆菌菌株是通过将黄色短杆菌FB21 (购自江南大学)作为出发菌株，经N+注入诱变技术得到的。该N+注入诱变技术是将培养24h后的出发菌株用0. 85%生理盐水从培养基上洗脱下来，用生理盐水适当稀释至菌悬液浓度约IO8-IO9个/mL。取适量菌悬液涂布于灭菌冷却后的载玻片上，以在显微镜下观察无相互重叠的细胞为宜。自然干燥后立即进行N+注入。将制得的样品载片置于离子注入机载台上进行N+注入诱变。注入能量为20kev，剂量为0.01-3. OX IOw个离子/s，注入靶室的真空度为10_3Pa，离子束流量为1mA。N+注入后立即将载玻片在无菌操作下从平皿中取出，放入装有IOmL无菌水的摇瓶中，在130rpm/min的摇瓶机上摇洗20min，适当稀释后涂布于固体培养基(含有1重量％蛋白胨，1重量％酵母膏和0. 5重量％ NaCl的pH7. 0的琼脂培养基)上，31°C培养40-4 ,挑取单菌落，在无菌条件下将其转接入固体培养基(含有1重量％蛋白胨，1重量％酵母膏和 0. 5重量％ NaCl的pH7. 0的琼脂培养基)中进行扩大培养，32°C培养40-4他。对获得的菌株进行摇瓶和小试筛选，最后获得一株黄色短杆菌菌株，即本发明的黄色短杆菌，保藏编号为CGMCC5341。另一方面，本发明提供了一种如上所述的黄色短杆菌在发酵制备赖氨酸中的应用。第三方面，本发明提供了一种发酵制备赖氨酸的方法，所述方法包括在生成赖氨酸的条件下，将如上所述的黄色短杆菌接种至发酵培养基中进行发酵培养。本发明中，发酵培养基为本领域技术人员公知的概念，指微生物发酵所需的供微生物生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素和水等。发酵液也为本领域技术人员公知的概念，指接入微生物菌株的液体培养基(该液体培养基也即本发明中所称发酵培养基)，经过一段时间的培养后所得产物。发酵过程就其本质来说是由微生物参与的生物化学反应过程，因此微生物细胞的数量、状态、代谢情况对产物的生物合成有着重要的影响。菌体浓度的大小对发酵产物的产率有着重要的影响。理论上菌体浓度越大，产物的产量也越大，但是菌体浓度过高会产生其他影响，如营养物质消耗过快，发酵液中的营养成分发生明显的改变，如有毒物质的积累等，这些可能改变菌体的代谢途径。因此，本发明中，以每升发酵培养基为基准，黄色短杆菌的接种量优选为12-18体积％。本领域技术人员应该理解的是，黄色短杆菌在被接种至发酵培养基中之前，采用常规方法将黄色短杆菌经过种子罐培养，然后再将菌种接入发酵培养基中。在种子罐培养的培养程度可以通过取样显微镜镜检、( (optical density)值测定对黄色短杆菌的生长进行观察，当通过上述方法观察菌体形态正常、测定OD值达到0. 95以上时停止培养，将此时种子罐中的种子液称为成熟种子液，然后再将成熟种子液接入发酵培养基中。因此，本发明中，黄色短杆菌的接种量优选为12-18体积％，指的是接入发酵培养基中的成熟种子液的体积占接入成熟种子液后发酵培养基体积的12-18%。由于黄色短杆菌个体微小，数量不易统计，而种子液的OD值为被测种子液吸收的光密度，可以反映种子液中黄色短杆菌的数量，因此，本领域中一般均采用OD值来表示种子液中黄色短杆菌的数量，本发明也沿用本领域的采用OD值来表示种子液中黄色短杆菌的数量的习惯。且本发明中，OD值用722N可见光分光光度计测定。种子罐培养可以采用一级种子罐培养也可以采用二级种子罐培养，一级种子罐培养即将黄色短杆菌在一个种子罐中一直培养到所需的培养程度；二级种子罐培养即先将黄色短杆菌在一个种子罐中培养一段时间后再转入另一个种子罐继续培养，培养到所需的培养程度。二级种子罐培养在各个种子罐的培养时间没有具体限定，只要最终能培养到所需的培养程度即可。为了操作方便，本发明的种子罐培养优选采用一级种子罐培养。本发明中，对于种子罐培养基的成分无特殊要求，可以采用本领域常用的种子罐培养基，例如，可以用淀粉质原料糖化清液、玉米浆、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铵、苏氨酸和蛋氨酸等配制种子罐培养基。根据本发明，每升种子罐培养基中各原料的用量可以在很大范围内改变，优选情况下，每升种子罐培养基中，淀粉质原料糖化清液的用量可以为30-40 克，玉米浆(干重为20-50重量％)的用量可以为70-90克，磷酸氢二钾的用量可以为 0. 5-1. 5克，硫酸镁的用量可以为0. 4-1. 1克，硫酸铵的用量可以为5-15克，苏氨酸的用量可以为0. 1-0. 6克，蛋氨酸的用量可以为0. 1-0. 3克。由于本发明提供的制备赖氨酸的方法相对于现有技术的改进主要在于使用本发明的黄色短杆菌作为发酵菌种，因此对于本发明方法的其他条件和操作没有特别的要求， 例如，优选在接种后在流加碳源和流加氮源的条件下进行发酵。优选情况下，流加碳源的量使发酵液中还原性糖的浓度控制在5-10克/升，流加氮源的量使发酵液中氮的浓度控制在 0. 35-0. 8克/升。此处“流加碳源的量使发酵液中还原性糖的浓度控制在5-10克/升，流加氮源的量使发酵液中氮的浓度控制在0. 35-0. 8克/升”是指通过控制流加碳源和流加氮源的速度来使在整个发酵培养过程中发酵液中还原性糖的浓度维持在5-10克/升，使发酵液中氮的浓度维持在0. 35-0. 8克/升。本发明中，发酵培养的设备为本领域技术人员所公知，例如，可以使用发酵罐进行发酵培养。本领域技术人员应该理解的是，赖氨酸的发酵培养应该在空气中进行。为了有效利用发酵罐的产能，接种后且流加碳源和流加氮源之前发酵罐中的培养基的体积优选为发酵罐体积的40-60%，随着流加碳源和流加氮源，发酵罐中的培养基的体积逐渐增大，为了保证发酵罐中的空气量，优选为流加碳源和流加氮源至发酵罐体积的70-80%时放料，为了保证放料后发酵罐中的菌种数量，不影响放料后发酵罐中的发酵培养，放料体积优选为放料前发酵罐中发酵液体积的5-10%。本发明的发明人在实验中发现，连续流加比间歇流加的发酵效果好，因此，本发明中的流加优选为连续流加。
本发明中，优选发酵培养57-63小时后放罐。本发明中的放罐是指将发酵罐中的培养基全部从发酵罐中放出，即停止发酵。本领域技术人员应该理解的是，为了得到纯度较高的赖氨酸产品，本发明方法还包括从放料或放罐的溶液中提取赖氨酸。对于提取赖氨酸的方法无特殊要求，可以采用本领域常用的各种方法，例如，采用连续离子交换分离提取方法，向放料或放罐的溶液中加入大量的浓硫酸调PH至2. 0-3. 0进行酸化，酸化后经过金属膜或陶瓷膜过滤除去菌体，得到赖氨酸膜滤液即赖氨酸清液，或将酸化后的赖氨酸发酵液经絮凝过滤除菌体后得到赖氨酸清液，除菌体后的赖氨酸清液采用强酸型阳离子交换树脂进行吸附交换，树脂吸附饱和后用稀氨水进行洗脱，洗脱下来的赖氨酸经浓缩、盐酸调节PH值、结晶、固液分离、烘干，得到赖氨酸盐酸盐成品；或者在放料或放罐的溶液中加入酸，使赖氨酸发酵液酸化，经过滤或离心等方法除去菌体。在除去菌体后的赖氨酸清液中加入氢氧化钙调节PH值至8. 0-11. 5，使赖氨酸清液中的盐、胶体等杂质生成不溶物，经固液分离后得到赖氨酸溶液，将赖氨酸溶液浓缩至每毫升赖氨酸溶液中赖氨酸的含量为0. 6-0. 8g，再经过过滤可以得到高纯度的赖氨酸溶液，然后经浓缩、盐酸调节PH值、结晶、固液分离、烘干，得到赖氨酸盐酸盐成品。本发明中，对发酵培养的条件无特殊要求，可以采用本领域常用的条件，优选为 温度为30-32°C，压力为0. 05-0. lMPa，pH值为6. 7-7. 0，通气量为0. 5-1. 2立方米空气/立方米的培养基/分钟。本发明中，碳源优选为淀粉质原料糖化清液。淀粉质原料糖化清液既可以采用干法制糖工艺制备，也可以采用湿法制糖工艺制备。从工艺简单、设备投资少，生产成本较低的方面考虑，优选通过干法制糖工艺制备。干法制糖工艺是指淀粉质原料不经浸泡直接进行破碎和酶解。干法制糖工艺可以包括将淀粉质原料粉碎，将淀粉质原料粉碎后的产物调浆，并加入淀粉酶对淀粉进行第一次水解；对第一次水解产物进行固液分离，并在得到的液相组分中加入糖化酶进行第二次水解，得到淀粉质原料糖化清液。优选地，粉碎使淀粉质原料过 30目筛的通过率大于75%，更优选过30目筛的通过率为100%。调浆的方法为本领域技术人员所熟知，但优选地，调浆的方法可以包括将淀粉质原料粉碎后的产物加入到水中混合均勻，水的加入量使得到的浆液的波美度可以为9-17Β °。术语“波美度”是表示溶液浓度的一种方法，是通过波美比重计检测溶液得到的度数。根据本发明，在第一次水解中，以每克粉碎后的产物的干重计，淀粉酶的用量可以为10-30酶活力单位，酶解的温度可以为88-92°C，酶解的时间可以为90-120分钟，酶解的 PH值可以为5. 5-6. 0。固液分离的条件没有特别的限定，优选地，固液分离的条件使得到的液相组分中的固含量为19-22重量％，更优选为20-21重量％。根据本发明，在第二次水解中，以每克液相组分计，糖化酶的用量可以为110-130 酶活力单位，酶解的温度可以为55-65°C，酶解的时间可以为420-600分钟，酶解的pH值可以为 4. 0-4. 5。本发明酶活力单位的定义为在pH值为6. 0、温度为70°C的条件下，1分钟将1毫
克淀粉转化为还原性糖所需的酶量为一个酶活力单位。淀粉酶是指能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，所述淀粉酶一般包括α -淀粉酶、β-淀粉酶。
α-淀粉酶又称淀粉1，4_糊精酶，它能够任意地、不规则地切开淀粉链内部的 α-1,4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖。生产此酶的微生物主要有枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉和根霉。β -淀粉酶又称淀粉1，4-麦芽糖苷酶，能够从淀粉分子非还原性末端切开1，4_糖苷键，生成麦芽糖。此酶作用于淀粉的产物是麦芽糖与极限糊精。此酶主要由曲霉、根霉和内孢霉产生。根据本发明，优选使用α -淀粉酶。根据本发明，糖化酶优选为α -1,4-葡萄糖水解酶。按照本发明，淀粉质原料可以为本领域公知的各种可以用于酶解、发酵制备赖氨酸的含有淀粉的原料，例如，可以选自玉米、薯类(如木薯)和小麦中的一种或几种。本发明中，氮源的种类为本领域技术人员所公知，例如，可以为铵盐。当氮源为铵盐时，发酵液中氮的浓度以铵根离子的浓度表示，氮的浓度控制在0. 35-0. 8克/升，则铵根离子的浓度控制在0. 5-1. 0克/升。本发明中，发酵培养基的成分无特殊要求，可以采用本领域常用的赖氨酸发酵培养基，例如，可以用淀粉质原料糖化清液、糖蜜、玉米浆、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、苏氨酸、蛋氨酸和谷氨酸等配制发酵培养基。根据本发明，每升发酵培养基中各原料的用量可以在很大范围内改变，优选情况下，每升发酵培养基中，淀粉质原料糖化清液的用量可以为 40-60克，糖蜜的用量可以为30-50克，玉米浆(干重为20-50重量％ )的用量可以为20-40 克，硫酸铵的用量可以为20-40克，磷酸氢二钾的用量可以为0. 5-1. 5克，硫酸镁的用量可以为0. 4-0. 6克，苏氨酸的用量可以为0. 1-0. 3克，蛋氨酸的用量可以为0. 1-0. 3克，谷氨酸的用量可以为0. 2-0. 4克。另外，本领域技术人员应该理解的是，接入种子罐进行培养的菌种为经过活化后进行增殖培养后的菌种。活化和增殖培养为本领域的公知常识，在此不再赘述。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述
中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。实施例以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。在下述实施例和对比例中OD值测定将取样的发酵液进行沈倍稀释，采用722Ν可见光分光光度计，在波长 562纳米可见光下测定吸光值。按照GB/T5009. 7-2008的方法测定发酵液中还原性糖的浓度。按照GB3595-83的方法测定发酵液中铵根离子的浓度。按照GB10794-89标准检测发酵液中的赖氨酸浓度(以赖氨酸盐酸盐计)。
单罐供酸量=(放罐的赖氨酸浓度X放罐体积+中间放料赖氨酸浓度X中间放料体积)。转化率(％ )=单罐供酸量/总糖的重量X100%，其中总糖的重量包括种子罐用糖重量和发酵罐用糖重量。以下实施例使用的黄色短杆菌A均为本发明的上述黄色短杆菌(该菌株于2011 年10月14日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC5341)。实施例1本实施例用于说明本发明提供的赖氨酸的制备方法。(1)将收获的100重量份玉米通过机械加工将玉米颗粒粉碎，使玉米粉过30目筛的通过率为80%。(2)将粉碎后的产物加水调浆至12Β °，相对于每克粉碎产物的干重，加入20个酶活力单位的淀粉酶(诺维信公司，α -淀粉酶)，在90°C、ρΗ为5. 5的条件下酶解100分钟，得到酶解产物。其中，将酶解产物通过用液压式板框压滤机进行压滤，分离出酶解清液 (固含量为20重量％)；之后加入115个酶活力单位的糖化酶(α-1，4_葡萄糖水解酶，诺维信公司)，在60°C、ρΗ为4. 5的条件下酶解420分钟，得到淀粉质原料糖化清液。(3)使用步骤(2)得到的淀粉质原料糖化清液配制种子罐培养基，具体组成为相对于每升种子罐培养基，淀粉质原料糖化清液的用量为35克，玉米浆(干重为35重量％ ) 的用量为80克，磷酸氢二钾的用量为1. 0克，硫酸镁的用量为0. 5克，硫酸铵的用量为10 克，苏氨酸的用量为0. 2克，蛋氨酸的用量为0. 2克。将培养基加热到121°C消毒，维持20分钟后降温至31°C并保持恒定。开启搅拌，调节罐压为0. IMPa，按照通风量与培养基1 0.5 体积比通入无菌空气，用氨水调节pH至6. 8并保持恒定。然后将黄色短杆菌A活化和增殖后接入种子罐中进行培养，培养过程中每隔120分钟取样镜检并测定OD值，当镜检菌体形态正常且OD值达到0. 95时停止培养，得到成熟种子液。(4)使用步骤( 得到的淀粉质原料糖化清液配制发酵培养基，具体组成为相对于每升发酵培养基，淀粉质原料糖化清液的用量为50克，糖蜜(产地新疆)的用含量为40 克，玉米浆(干重为35重量％ )的用量为30克，硫酸铵的用量为30克，磷酸氢二钾的用量为1. 0克，硫酸镁的用量为0. 5克，苏氨酸的用量为0. 2克，蛋氨酸的用量为0. 2克，谷氨酸的用量为0. 3克。培养基加热到121°C消毒30分钟后降温至31°C并保持恒定，用氨水调节 ρΗΜ6·9。(5)在发酵罐中装入步骤(4)配制好的发酵培养基，发酵培养基体积为发酵罐体积的50%。使用步骤C3)所得的成熟种子液，接入发酵罐的培养基中进行发酵培养，以接种后的发酵培养基为基准，步骤C3)所得的成熟种子液的接种量为15体积％。接种后连续流加步骤( 得到的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵，流加步骤( 得到的淀粉质原料糖化清液的量使发酵液中还原性糖的浓度控制在6-8克/升，流加硫酸铵的量使发酵液中铵根离子的浓度控制在0. 6-0. 8克/升，将罐压控制为0. IMPa,发酵温度控制为31°C，通气量为 0. 7立方米空气/立方米的培养基/分钟，并用液氨调节pH维持在6. 9进行发酵培养，流加步骤( 得到的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵至发酵罐体积的75%时放料，放料体积为放料前发酵罐中发酵液体积的8%。发酵培养60小时后放罐。测定放罐的赖氨酸浓度(即终点赖氨酸含量，下同)和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。实施例2本实施例用于说明本发明提供的赖氨酸的制备方法。淀粉质原料糖化清液的制备方法、种子罐培养基配方、种子罐成熟种子液培养方法、发酵罐培养基配方均与实施例1相同。发酵罐中的培养基体积为发酵罐体积的40%。将成熟种子液接入发酵罐的培养基中进行发酵培养，以接种后的发酵培养基为基准，种子液的接种量为12体积％。接种后连续流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵，流加制得的淀粉质原料糖化清液的量使发酵液中还原性糖的浓度控制在5-7克/升，流加硫酸铵的量使发酵液中铵根离子的浓度控制在0. 5-0. 7克/升，将罐压控制为0. 08MPa,发酵温度控制为30°C，通气量为0. 7立方米空气/立方米的培养基/分钟，并用液氨调节PH维持在6. 7进行发酵培养，流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵至发酵罐体积的70%时放料，放料体积为放料前发酵罐中发酵液体积的5%。发酵培养63小时后放罐。测定放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度， 计算单罐供酸量和转化率见表1。实施例3本实施例用于说明本发明提供的赖氨酸的制备方法。淀粉质原料糖化清液的制备方法、种子罐培养基配方、种子罐成熟种子液培养方法、发酵罐培养基配方均与实施例1相同。发酵罐中的培养基体积为发酵罐体积的60%。将成熟种子液接入发酵罐的培养基中进行发酵培养，以接种后的发酵培养基为基准，种子液的接种量为18体积％。接种后连续流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵，流加制得的淀粉质原料糖化清液的量使发酵液中还原性糖的浓度控制在8-10克/升，流加硫酸铵的量使发酵液中铵根离子的浓度控制在0. 8-1. 0克/升，将罐压控制为0. 05MPa，发酵温度控制为32°C，通气量为0. 7立方米空气/立方米的培养基/分钟，并用液氨调节PH维持在7. 0进行发酵培养，流加制得的淀粉质原料糖化清液和硫酸铵至发酵罐体积的80%时放料，放料体积为放料前发酵罐中发酵液体积的10%。发酵培养57小时后放罐。测定放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。对比例1按照实施例1的方法发酵制备赖氨酸，不同的是，接入的黄色短杆菌菌株为黄色短杆菌FB21 (购自江南大学)，测定放罐的赖氨酸浓度和中间放料的赖氨酸浓度，计算单罐供酸量和转化率见表1。表 1
终点赖氨酸含量(g/100ml)单罐供酸量(吨)转化率(% )实施例116. 2138. 7952. 24实施例216. 5739. 2153. 65
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本发明提供了一种黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)，该黄色短杆菌的保藏编号为CGMCC5341。还提供了上述黄色短杆菌在发酵制备赖氨酸中的应用及发酵制备赖氨酸的方法，该方法包括在生成赖氨酸的条件下，将上述黄色短杆菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液。本发明提供的黄色短杆菌(该菌株于2011年10月14日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC5341)，作为发酵菌种制备赖氨酸，可提高终点赖氨酸含量、单罐供酸量和转化率。