一种生物发酵法转化甘油生产二羟基丙酮的方法【技术领域】，具体为葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)菌株GlO发酵所产生的甘油脱氢酶对甘油进行氧化生产二羟基丙酮的新方法。技术背景[0002]二羟基丙酮是一种天然存在的酮糖，具有生物可降解性，可食用且对人体和环境无毒害、其化学性质活泼，用途广泛且使用量大，是一种重要的医药中间体、化工原料以及食品添加剂、化妆品仿晒剂的成分，也可作为抗病毒试剂，同时可用于果蔬、水产品、肉制品的防腐保鲜。[0003]二羟基丙酮属于天然产物，提取难度大，且价格昂贵，难以形成商业规模。人们利用其三碳酮糖的结构特点进行化学合成，但要使用昂贵的催化剂，使得其成本高昂，很难进入商业化生产。日前国外有报道，英国BP石油公司实现了利用甲醛法生产1，3_ 二羟基丙酮并申报了专利，然而由于甲醛法生产1，3-二羟基丙酮污染大，设备投资大，产业化推广难度大。国内对于二羟基丙酮的工业化生产虽有使用分批生物发酵法生产，但由于能承载的底物甘油浓度低，发酵物质消耗率高，能源、水资源消耗严重，废物排放量较大等缺点限制了二羟基丙酮的发展。[0004]微生物转化甘油生 产二羟基丙酮的原理就是利用微生物代谢产生的甘油脱氢酶，使甘油分子结构中2位C上的羟基发生反应，生成二羟基丙酮。因此，理论上凡是能够利用甘油，并具有相应的甘油脱氢酶系的微生物进行二氢基丙酮的生产都具有反应条件温和、底物利用率高、副产物少、工艺简单易于控制等优点。自1898年Bertrand发现利用细菌可以将甘油转化成二羟基丙酮后，各国科研人员对微生物发酵甘油生产二羟基丙酮进行了多方面研究，发现真正具有生物转化二羟基丙酮工业价值的微生物主要是醋酸杆菌、葡萄糖酸杆菌、酵母和脉孢菌等，其中醋酸杆菌属的氧化葡萄糖酸杆菌是工业发酵生产二羟基丙酮的重要菌种。发酵工艺有间歇发酵培养法、固定化细胞法、静息细胞法、流加发酵培养法和多阶反应器连续生产法等。[0005]国外早在20世纪70年代就开始研究生物转化法生产二羟基丙酮，现已在美国、英国、德国和日本实现工业化应用，代表企业为日本大赛璐化学工业公司，年产能为1100吨左右。我国微生物发酵法生产二羟基丙酮的研发晚于国外，主要有浙江工业大学、华东理工大学、天津工业微生物研究所等单位进行了相关的研究开发工作，现有上海百众化工采用分批发酵法生产二羟基丙酮，但发酵过程中，若底物甘油和产物二羟基丙酮的浓度过高时(累计达到或超过80-120g/L时)，就会产生高渗透压，从而使得发酵菌体裂解、失活。由于底物甘油浓度受到限制，使得整个工艺的产率降低，水、电、燃气、原料消耗较大，生产时间较长，从而导致成本增加。[0006]因此，鉴于二羟基丙酮的广阔市场应用前景和很好的社会效益，解决二氢基丙酮生物发酵法生产中存在的上述问 题是目前面临的一个迫切任务。
[0007]本发明的目的是提供一种发酵法生产二羟基丙酮的方法，可以克服目前二羟基丙酮生产过程中菌株耐甘油浓度低、分批发酵易使菌体裂解失活以及后续分离提取产品工艺中存在的工序复杂、分离能力小、成本高及产品回收率低等问题。本发明采用高甘油耐性菌株有效提高了菌株的二羟基丙酮的生产能力，采用二阶反应器，待发酵液浓度超过界定数值时会自动流出发酵液，从而使得反应可以继续。
[0008]本发明提供的一种生物发酵法转化甘油生产二羟基丙酮的新工艺，其步骤包括:
[0009]I)高效率生产菌株发酵生产二羟基丙酮
[0010]将葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)GlO种子液接种于灭菌过的发酵培养基中，在发酵过程中通过氢氧化钠或盐酸溶液来控制PH值，此发酵过程在第一阶反应器中完成，之后将菌悬液混以海藻酸钠溶液和氯化钙溶液流放到第二阶反应器，甘油经灭菌后流加入第二阶反应器中，待甘油浓度在第二阶反应器中聚集到一定程度后，反应器下部的压力感应膜会控制阀门打开流出发酵液；
[0011]2)从发酵液中提取二羟基丙酮
[0012]采用离心或絮凝法除去发酵液中的菌体，将去除菌体的发酵液按10~100: I的比例浓缩，浓缩液上层析柱，采用阳离子交换树脂，石油醚湿法装柱，以乙酸乙酯-丙酮混合溶剂为流动相，温度为10~20°C，床层高径比为15~50，进样体积比为0.0.1~0.1BV,流速为0.1~0.8BV/h，收集二羟基丙酮洗脱液，真空浓缩，得到二羟基丙酮粗品；将二羟基丙酮粗品溶于乙酸乙酯或丙酮中回流0.5~lh，将反应液冷却至(TC~_15°C，有晶体析出，经过滤、真空干燥得到二羟基丙酮晶体。
[0013]本发明提供的利`用微生物发酵法氧化甘油生产二羟基丙酮的方法具有突出的特
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[0014]I) 二阶段反应器连续生产二羟基丙酮，可分别创造适合微生物细胞生长及产物生产的良好环境，避免了高浓度底物、高浓度二羟基丙酮对细胞生长及甘油到二羟基丙酮转化过程的抑制作用，实现了细胞的充分增殖和与产物的生产；
[0015]2)在第二阶段的反应器中，采用甘油流加的方式，有效控制反应器内底物甘油和产物二羟基丙酮的浓度，从而避免了高渗透压的产生，减缓菌体衰老速度，提高菌体利用率。
[0016]3)采用阳离子交换吸附技术分离纯化二羟基丙酮，在连续发酵过程中利用膜的选择性滤过作用，即时引出二羟基丙酮，使反应和分离同时进行，简化了工艺过程，缩短了工艺时间，提高了产品收率，降低了溶剂消耗和环境污染。



[0017]图1微生物发酵法转化甘油生产二羟基丙酮的工艺流程图
[0018]下面通过实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的。
[0019]实施例1[0020](I)将高甘油耐性葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)菌株GlO接种于加入灭菌发酵培养基的第一阶反应器中，发酵培养基为:酵母粉:I %，蛋白胨:3%，(NH4)2SO4:0.3%,, NH2PO4:0.05%, MgSO4:0.01%, CaCO3:0.05%，用蒸馏水配制，用 NaOH 溶液将PH值调到7.0，经120°C和高压灭菌。
[0021](2)将第一阶反应器中的菌悬液加入5%海藻酸钠溶液和2% CaCl2溶液，混合均匀流放到第二阶反应器，温度30-35°C，转速300r/min，通风量2vvm、pH值5.0左右，以15L/h的速度流加甘油进行生物催化反应，在第二阶反应器出口增加压力感应器，当甘油浓度达到400g/L时，会自动流出反应液。
[0022](3)用离心机对反应液进行离心，取上清液浓缩得浓缩液，浓缩液上层析柱，采用PUROLITE PCR钙型离子交换树脂，石油醚湿法装柱，采用体积比为70: 30的乙酸乙酯-丙酮混合溶剂为流动相，温度为10°C，床层高径比为25，进样体积比为0.05BV，流速为0.25BV/h，收集二羟基丙酮流出液，进行真空浓缩，将二羟基丙酮粗品溶于乙酸乙酯或丙酮中回流0.5h，将反应液冷却至0°C左右，有晶体析出，经过滤、真空干燥得到二羟基丙酮晶体。
[0023](4)底物甘油浓度400g/L时，二羟基丙酮浓度368g/L，连续发酵420小时，甘油转化率为92.3%，收率为80 %。
[0024]实施例2
[0025](I)将高甘油耐性葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)菌株GlO接种于加入灭菌发酵培养基的第一阶反应器中，发酵培养基为:酵母粉:4%，蛋白胨:1%,(NH4)2SO4:0.1 %,, NH2PO4:0.02%, MgSO4:0.05%, CaCO3:0.05%，用蒸馏水配制，用 NaOH 溶液将PH值调到5.0，经120°C和高压灭菌。
[0026](2)将第一阶反应器中的菌悬液混以8%海藻酸钠溶液和2% CaCl2溶液混合，流放到第二阶反应器，温度30-35°C，转速300r/min，通风量2vvm、pH值5.0左右，以20L/h的速度流加甘油进行生物催化反应，在第二阶反应器出口增加压力感应器，当甘油浓度达到400g/L时，会自动流出反应液。
[0027](3)用离心机对反应液进行离心，取上清液浓缩得浓缩液，浓缩液上层析柱，采用PUROLITE PCR钙型离子交换树脂，石油醚湿法装柱，采用体积比为65: 35的乙酸乙酯-丙酮混合溶剂为流动相，温度为15°C，床层高径比为30，进样体积比为0.08BV，流速为0.5BV/h，收集二羟基丙酮流出液，进行真空浓缩，将二羟基丙酮粗品溶于乙酸乙酯或丙酮中回流
0.5h，将反应液冷却至10°C左右，有晶体析出，经过滤、真空干燥得到二羟基丙酮晶体。
[0028](4)底物甘油浓度400g/L时，二羟基丙酮浓度361g/L，连续发酵420小时，甘油转化率为90.1%，收率为79%。
[0029]实施例3
[0030](I)将高甘油耐性葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)菌株GlO接种于加入灭菌发酵培养基的第一阶反应器中，发酵培养基为:酵母粉:6%，蛋白胨:4%,(NH4)2SO4:0.1 %,, NH2PO4:0.02%, MgSO4:0.05%, CaCO3:0.03%，用蒸馏水配制，用 NaOH 溶液将PH值调到4.0，经120°C和高压灭菌。
[0031](2)将第一阶反应器中的菌悬液混以10%海藻酸钠溶液和4% CaCl2溶液混合，流放到第二阶反应器，温度30-35°C，转速400r/min，通风量2vvm、pH值5.0左右，以25L/h的速度流加甘油进行生物催化反应，在第二阶反应器出口增加压力感应器，当甘油浓度达到400g/L时，会自动流出反应液。
[0032](3)用离心机放反应液进行离心，取上清液浓缩得浓缩液，浓缩液上层析柱，采用PUROLITE PCR钙型离子交换树脂，石油醚湿法装柱，采用体积比为50: 50的乙酸乙酯-丙酮混合溶剂为流动相，温度为15°C，床层高径比为50，进样体积比为0.03BV，流速为0.5BV/h，收集二羟基丙酮流出液，进行真空浓缩，将二羟基丙酮粗品溶于乙酸乙酯或丙酮中回流lh，将反应液冷却至5°C左右，有晶体析出，经过滤、真空干燥得到二羟基丙酮晶体。
[0033](4)底物甘油浓度400g/L时，二羟基丙酮浓度349g/L，连续发酵420小时，甘油转化率为87.3%，收率为72 %。
[0034]实施例4
[0035](1)将高甘油耐性葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)菌株GlO接种于加入灭菌发酵培养基的第一阶反应器中，发酵培养基为:酵母粉:5%，蛋白胨:3%,(NH4)2SO4:0.45%, NH2PO4:0.02%, MgSO4:0.05%, CaCO3:0.02%，用蒸馏水配制，用 NaOH 溶液将PH值调到4.0，经120°C和高压灭菌。
[0036](2)将第一阶反应器中的菌悬液混以8%海藻酸钠溶液和6% CaCl2溶液混合，流放到第二阶反应器，温度30-35°C，转速400r/min，通风量2vvm、pH值5.0左右，以20L/h的速度流加甘油进行生物催化反应，在第二阶反应器出口增加压力感应器，当甘油浓度达到400g/L时，会自动流出反应液。
[0037](3)用离心机放反应液进行离心，取上清液浓缩得浓缩液，浓缩液上层析柱，采用PUROLITE PCR钙型离子交换树脂，石油醚湿法装柱，采用体积比为50: 50的乙酸乙酯-丙酮混合溶剂为流动相，温度为15°C，床层高径比为50，进样体积比为0.03BV，流速为0.5BV/h，收集二羟基丙酮流出液，进行真空浓缩，将二羟基丙酮粗品溶于乙酸乙酯或丙酮中回流lh，将反应液冷却至5°C左右，有晶体析出，经过滤、真空干燥得到二羟基丙酮晶体。
[0038](4)底物甘油浓度400g/L时，二羟基丙酮浓度355g/L，连续发酵420小时，甘油转化率为89.2 %，收率为78 %。