专利名称：一种羟基红花黄色素a的含量测定方法红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花。具活血通经、散瘀止痛之功效。轻基红花黄色素A (Hydroxy safflor yellow A，HSYA)在红花黄色素提取物中含量较高，为红花活血化瘀活性有效成分之一。HSYA是一种查耳酮葡萄糖苷，由其结构特征可知此化合物稳定性差。HSYA在高于60°C时，温度越高，加热时间越长越不稳定；光照对 HSYA的稳定性也有一定影响，最好避光保存；HSYA的稳定性随pH值增大而减小，其在酸性介质中较为稳定。羟基红花黄色素A对照品较为昂贵，在生产质量控制过程中，由于其不稳定，如果采用外标法测定其含量，每次在检测前均需要临时配制对照品溶液，因此造成检验成本非常高。内标法是以一定量的纯物质为内标物，加入到已知质量的试样中，根据峰面积和质量由内标法计算公式得出待测组分含量，这种方法定量准确，对操作条件要求不高，但内标物不易找到。
本发明的目的是提供一种羟基红花黄色素A的含量测定方法，本发明方法采用高效液相色谱法，色谱条件及测定方法如下 色谱条件色谱柱为C18色谱柱，规格为4. 6 X 250mm，5 ii m ;流动相0. 5%冰乙酸水溶液甲醇-72:28，检测波长为355nm ;流速I. Oml/min ;柱温30°C ;理论塔板数以金丝桃苷计不少于4000 ； 供试品溶液的配制取待测物适量，精密称定，加水制备成含羟基红花黄色素A0. Img/ml的溶液滤过即得； 校正因子测定取金丝桃苷对照品适量，精密称定，加甲醇配制浓度为0.05mg/ml的溶液，摇匀，作为内标溶液；另取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加25%甲醇配制浓度为0. 10mg/ml的对照品溶液；精密吸取两种对照品溶液各Iml混合，摇匀，滤过，精密吸取IOu I注入高效液相色谱仪，计算校正因子； 测定法精密吸取供试品溶液及内标物溶液各I. 0ml，混匀，滤过，吸取10 u I注入高效液相色谱仪，测定，以内标法计算含量，即得。本发明羟基红花黄色素A的含量测定方法，可以测定各种制剂中羟基红花黄色素A的含量，优选测定红花提取物、注射用红花冻干粉针或者pH值为5. 5-7. 5的红花提取物溶液羟基红花黄色素A的含量。本发明所述“取待测物适量”是中国药典中的标准描述方式，测定时检验人员根据待测物标准的最低含量标准、含量测定时配制样品的容量瓶大小，以及最终样品浓度“含羟基红花黄色素AO. lmg/ml的溶液”共同计算确定取样量，这是本领域技术人员的公知常识，而这里的含羟基红花黄色素AO. lmg/ml的溶液，也并非真实的供试品溶液浓度，仅为计算取样量提供依据。同样“羟基红花黄色素A对照品适量”和“金丝桃苷对照品适量”也是中国药典中的标准描述方式，药典测定时检验人员根据对照品的含量配制样品的容量瓶大小，以及对照品溶液的最终浓度确定取样量，这也 是本领域技术人员的公知常识。本发明方法测定羟基红花黄色素A的含量可从多个方面评价其可行性，评价方法如下 1.仪器、试剂与材料
Agilent 1100系列高效液相色谱仪，VWD紫外检测器；Sartorius BSllOS分析天平，岛津UV2550紫外-可见分光光度计；Millipore AlO型超纯水机；BINDER KBF240型恒温恒湿箱，YB-2型澄明度检测仪等。甲醇为色谱纯，冰醋酸为优级纯；其余试剂、试药均为分析纯。
羟基红花黄色素A对照品(购自中国药品生物制品检定所，批号111637-200705，供含量测定用)；金丝桃苷对照品(购自中国药品生物制品检定所，批号111521-200303，供含量测定用)；红花提取物、注射用红花冻干粉针、不同PH值红花提取物溶液为河北以岭医药研究院实验室自制。2.方法与结果
2.I色谱条件色谱柱Waters symmetry C18色谱柱,规格为4. 6 X 250mm, 5 ii m ;流动相0. 5%冰乙酸水溶液甲醇-72:28，金丝桃苷为内标物，检测波长为355nm ;流速I. Oml/min ;柱温30°C，理论塔板数以金丝桃苷计不少于4000。2.2羟基红花黄色素A含量测定方法学考察 2. 2. I检测波长的选择
精密称取羟基红花黄色素A对照品适量，加25%甲醇配制浓度为0. 1387mg/ml的对照品溶液，精密称取金丝桃苷对照品适量，加甲醇配制浓度为0. 04744mg/ml的对照品溶液，精密吸取两种对照品溶液混合，微孔滤膜过滤，进行全波长扫描，截取羟基红花黄色素A光谱图，见

图1，结果表明羟基红花黄色素A在403nm处有最大吸收，截取金丝桃苷光谱图，见图2,结果表明金丝桃苷在355nm处有最大吸收，比较355nm及403nm色谱图，结果355nm色谱图中，羟基红花黄色素A金丝桃苷响应值相当。因此选择355nm为检测波长。2. 2. 2分离度考察
分别吸取羟基红花黄色素A对照品溶液、金丝桃苷对照品溶液及两种对照品混合溶液，注入液相色谱仪记录色谱图，此条件下羟基红花黄色素A保留时间21.0min，金丝桃苷保留时间29. Omin，两者分离度较好，见图3、图4和图5。2. 2. 3校正因子测定
取金丝桃苷对照品溶液和羟基红花黄色素A对照品溶液各5ml，置IOml量瓶中，摇匀，用0. 45 y m微孔膜过滤，重复进样5次做校正因子试验。计算校正因子得I. 4894，计算RSD为 0. 45%o2.2.4线性关系实验
精密称取羟基红花黄色素A对照品13. 87mg，置IOOml量瓶中，加25%甲醇溶解并定容至刻度，作为贮备液。精密吸取2. 0,3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,7. Oml羟基红花黄色素A溶液置于IOml量瓶中，各加入浓度为0. 04744mg/ml金丝桃苷内标物溶液3. Oml,用甲醇稀释成浓度分别为 0. 02774、0. 04161、0. 05548、0. 06935、0. 08322、0. 09709 mg/ml 的溶液。精密吸取lOiil，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，以羟基红花黄色素A浓度为横坐标，金丝桃苷与羟基红花黄色素A峰面积比值值为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明羟基红花黄色素A在浓度为0. 02774 0. 09709 mg/ml范围内呈良好线性关系，回归方程为Y=50. 424X-0. 0318，相关系数r=0. 9994。2.2.5稳定性实验
制备对照品溶液及供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12小时进样，测定峰面积，考察对照品和供试品溶液的稳定性。结果表明，对照品溶液和供试品溶液在12小时内检测，峰面积基本稳定，RSD值分别为I. 09%和I. 01%。2.2.6重复性实验 取同一批样品，设高、中、低三个浓度，每个浓度平行3份，按供试品溶液制备方法，分别进行制备，测定，试验结果表明，高、中、低三个不同浓度水平的RSD为I. 48%。2.2.7回收率实验
取同一批样品，设置高、中、低三个浓度水平，每个浓度平行3份，各浓度水平对照品加入量与所取供试品含量之比分别为I :1. 5、1 :1、1 :0. 5。按照供试品溶液制备方法进行制备，测定，计算回收率，结果高、中、低三个不同浓度水平平均回收率为98. 3%，RSD为
I.56%。2. 3供试品测定
精密称取红花提取物30mg，置200ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。精密吸取上述溶液及金丝桃苷溶液各I. Oml，混匀，经0. 45 y m微孔膜过滤，备用。精密称取注射用红花冻干粉针200mg，置50ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。精密吸取上述溶液及金丝桃苷溶液各I. Oml，混匀，经0. 45 y m微孔膜过滤，备用。精密吸取不同pH值红花提取物溶液与金丝桃苷溶液各I. Oml，混匀，经0. 45 U m微孔膜过滤，备用。对上述三种样品三批进行羟基红花黄色素A含量测定，结果见下表I 表I不同样品羟基红花黄色素A含量测定结果


本发明提供了一种羟基红花黄色素A的含量测定方法，本发明方法是在供试品中加入内标物质金丝桃苷，再经过高效液相色谱仪分析，以试样中待测组分和内标物的响应信号(峰面积)之比确定待测组分的浓度，该方法符合药物制剂质量控制的要求，可有效控制羟基红花黄色素A在液体、固体型制剂中稳定性的质量。