专利名称：含羟基红花黄色素a的红花有效组分制备方法和用途的制作方法心血管疾病是危害人类健康的第一杀手，近年来，随着我国人口老年化以及人们 工作、生活、饮食结构及环境等的变化，冠心病等心脑血管疾病的发生率也逐年增多，严重 威胁着人民的身心健康。天然产物中许多活性物质具有抗心肌缺血、缺氧作用，其中一些已 开发成治疗冠心病和心绞痛的新药。因而从天然产物中寻找具有抗心肌缺血、缺氧生理活 性的有效物质，是发现、开发新药的有效途径之一。我国药用生物资源十分丰富，其生理活 性物质是研究和发现新药先导化学物，开发新药的天然宝库。目前，我国从天然产物中提取 活性物质，用于开发成治疗冠心病、安全性好、毒性低的新药还很少，从天然产物中提取活 性物质，开发成具有抗心肌缺血，用于治疗冠心病和心绞痛的新药，具有重要应用价值和广 阔发展前景。红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的管状花。性味性温，味辛，具 有活血通径、散瘀止痛的功效。含有红花黄色素(Safflor yellow)、红花苷(Carthamin)、 15 α，20β_ 二 羟基- Δ 4-娠烯 _3_ 酮(15 α，20 β -Dihydroxy-Δ 4-pregnen-3_one)、 木犀草素-7-葡萄糖苷(Luteolin-7-glucoside)、红花醌苷(carthamone)、新红花苷 (neo-cqrthamin)、腺嘌呤核苷(adenosine)、黄色素(safflor yellow Α)、山柰酚、槲皮素 及山柰酚-3-葡萄糖苷、槲皮素-3-葡萄糖苷、桷皮素-7-葡萄糖苷、山柰酚-3-芸香糖苷 和芦丁(rutin)、红花多糖等化合物。现代药理研究表明红花水提取物及红花水溶性混合物-红花黄色素有增加冠脉 血流量及心肌营养性血流量的作用，在兔、大鼠、犬等造成实验性心肌缺血或心肌梗塞的动 物模型上，红花及其制剂均有不同程度的对抗作用。红花可使因垂体后叶素引起的大鼠或 家兔急性心肌缺血有明显保护作用；可使反复短暂阻断冠状动脉血流造成麻醉犬急性心肌 缺血的程度明显减轻，范围缩小，心率减慢，并保护急性心肌梗塞区的边缘，缩小梗塞范围 及降低边缘区心电图ST段抬高的幅度，从而改善缺血心肌氧的供求关系。红花具有非常显 著地抑制ADP诱导的家兔血小板聚集作用，并对ADP已聚集的血小板也有非常明显的解聚 作用。红花尚可明显延长家兔血浆复钙时间、凝血酶原时间和凝血时间。表明它能同时影 响体内和体外的凝血系统。此外，红花油有降低血脂作用。红花具有以上对心血管系统的 明显药理作用，因此，从红花中分离出有效组分，开发出治疗心血管疾病的现代中药具有重 要的意义。
本发明的目的在于提供一种红花有效组分的制备方法，通过以下步骤实现将红 花药材加入乙酸乙酯和乙醇，加热提取，药渣加乙醇水溶液提取，将提取液浓缩成浸膏，用 反相硅胶柱对其进行分离，首先用低浓度甲醇作为流动相，得洗脱液I，弃之，然后改用高浓 度甲醇作为流动相，得洗脱液II，将洗脱液II浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分 离得到的样品；制备色谱的分离条件色谱柱为制备柱，流动相为水和乙腈，梯度洗脱。所 述红花有效组分主要含有羟基红花黄色素A和6-羟基山柰酚-3，6，7-三葡萄糖苷。优选的，本发明的红花有效组分制备方法，包括下列步骤取红花药材，将其粉碎 后加入体积比为1:1的乙酸乙酯和乙醇，加热回流1小时，提取2次，滤液合并得提取液I。 药渣加入70%乙醇，加热回流1小时，提取2次，滤液合并得提取液II，将提取液II浓缩 成浸膏，用50%甲醇溶解浸膏，采用ODS-C18柱对其进行分离，首先用5%甲醇作为流动相， 得洗脱液I，然后改用70%甲醇作为流动相，得洗脱液II，浓缩干燥后得样品；用制备液相 色谱继续分离得到的样品制备色谱的分离条件色谱柱为制备柱(ZORBAX SB C18； 21. 2mm χ 250mm, 7 μιη ),流动相为水A和乙腈B，梯度洗脱程序如下0min时，流动相A为90%的 水，流动相B为10%的乙腈溶液；40 min时，流动相A为65%的水，流动相B为35%的乙腈 溶液；流速为lOml/min，柱温为室温；样品经制备液相色谱分离，在4. 8^7. ^iin时间段收集 溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。本发明的另一个目的是提供所述有效组分在制备治疗和预防心血管疾病药物中 的应用。经药理实验证明，本发明提供的红花有效组分对心肌细胞有一定的保护作用。本发明的红花有效组分可以作为活性成分，加入药剂学上接受的辅料，按照药剂 学上记载的制剂的制备方法制成制剂。所述的制剂包括注射液、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣 片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、 丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩片、微丸等。本发明的有益效果为提供的制备方法设计合理，能快速准确地得到有效成分，在 生产中更易于药物的质量控制。根据本发明方法制备获得的红花有效组分可在制备治疗和 预防心血管疾病药物中的应用。图1是红花有效组分的HPLC色谱图，图中1为6-羟基山柰酚-3，6，7-三葡萄糖 苷，2为羟基红花黄色素A。将红花药材加入乙酸乙酯和乙醇，加热提取得提取液I，弃之。药渣加入乙醇水溶液，加 热提取得提取液II，将提取液II浓缩成浸膏，用50%甲醇溶解浸膏，采用ODS-C18柱对其进 行分离，首先用低浓度甲醇作为流动相，得洗脱液I，然后改用高浓度甲醇作为流动相，得洗脱液II，浓缩干燥后得样品；用制备液相色谱继续分离得到的样品，经制备液相色谱分离， 在4. 8^7. 4min时间段收集溶液，浓缩干燥后得到有效组分。实施例二红花有效组分的制备
取红花药材250g加入体积比为1:1的乙酸乙酯和乙醇，加热回流1小时，提取2次，滤 液合并得提取液I。药渣加入70%乙醇，加热回流1小时，提取2次，滤液合并得提取液II，将 提取液II浓缩成浸膏，用50%甲醇溶解浸膏，采用ODS-C18柱对其进行分离，首先用5%甲醇 作为流动相，得洗脱液I，然后改用70%甲醇作为流动相，得洗脱液II，浓缩干燥后得样品； 用制备液相色谱继续分离得到的样品制备色谱的分离条件色谱柱为制备柱(ZORBAX SB C18 ； 21. 2mm χ 250mm, 7 μιη )，流动相为水A和乙腈B,梯度洗脱程序如下=Omin时，流动相 A为90%的水，流动相B为10%的乙腈溶液；40 min时，流动相A为65%的水，流动相B为 35%的乙腈溶液；流速为lOml/min，柱温为室温；样品经制备液相色谱分离，在4. 8 7. 4min 时间段收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。该有效组分主要含有羟基红花黄色素 A和6-羟基山柰酚-3，6，7-三葡萄糖苷。实施例三红花有效组分分析
色谱条件色谱柱Agilent Zorbax6厕X 150 mm,^ Pm)；采用梯度洗
脱，流动相A相为0. 2%冰醋酸水溶液，流动相B相为含0. 2%冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脱 程序如下0分钟时，流动相A为90%的0. 2%冰醋酸水溶液、流动相B为10%的0. 2%冰醋 酸的乙腈溶液；20分钟时，流动相A为70%的0. 2%冰醋酸水溶液、流动相B为30%的0. 2% 冰醋酸的乙腈溶液；30分钟时，流动相A为50%的0. 2%冰醋酸水溶液、流动相B为50%的 0.2%冰醋酸的乙腈溶液；35分钟时，流动相A为50%的0. 2%冰醋酸水溶液、流动相B为50% 的0. 2%冰醋酸的乙腈溶液；流速0. 5mL/min ；检测波长322 nm ；柱温30°C ；进样量5 μ L。供试品溶液的制备称取本品，用甲醇溶液溶解在量瓶中，稀释至刻度，摇勻， 10000 rpm离心10 min，取上清液即得。测定方法精密吸取供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。红花有效组分的 色谱图见图1。实施例四滴丸制剂的制备
取红花有效组分0. 5g与10. 5g聚乙二醇-20000混合均勻，加热熔融，化料后移至滴丸 滴灌中，药液滴至6、°C液体石蜡中，除油，制得滴丸400粒。实施例五冻干粉针剂的制备
取红花有效组分0. 5g、葡萄糖4. 5g、硫代硫酸钠0. 9g和蒸馏水1000ml，上述组分混合 均勻后，分装400支，冷冻干燥，即得。实施例六红花组分的活性评价实验
1.红花组分对H》2损伤心肌细胞的保护作用
体外培养H9C2心肌细胞，培养液为DMEM(高糖)+10%FBS (G) +1%非必需氨基酸+0. 1%双 抗。取对数生长期细胞置于96孔细胞培养板上，恒温培养M h后，加入200 μ mol/mL H2O2 损伤心肌细胞30 min,再加入终浓度为50 μ g/mL的红花组分孵育M h，采用MTT法测定细 胞活力。结果表明，该组分对H2O2损伤心肌细胞的保护率为11.57%。2.红花组分对缺氧复氧损伤心肌细胞的保护作用
体外培养H9C2心肌细胞，培养液为DMEM(高糖)+10%FBS (G) +1%非必需氨基酸+0. 1%双抗。取对数生长期细胞置于96孔细胞培养板上，恒温培养M h后，在缺氧小室中培养6 h。 缺氧结束后，取出细胞培养板加入经无糖Hank’ s稀释的终浓度为50μ g/mL的红花组分，在 正常培养条件下孵育6 h，取细胞培养上清液测定乳酸脱氢酶(LDH)含量。结果表明，该组 分对缺氧复氧损伤的心肌细胞保护率为8. 18%。


本发明提供一种红花有效组分，该有效组分主要含有羟基红花黄色素A和6-羟基山柰酚-3，6，7-三葡萄糖苷。药材通过加热提取，浓缩，反相硅胶柱分离，洗脱，洗脱液浓缩干燥，再用制备液相色谱继续分离，收集溶液，溶液经浓缩干燥后得到有效组分。本发明提供的红花有效组分可在制备治疗、预防心血管疾病药物中的应用。本发明方法设计合理，能快速准确地得到有效成分，在生产中更易于药物的质量控制。