一种适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体及其应用的制作方法 【技术领域】，更具体地设及一种适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表 达载体及其应用。 [0002] 质粒作为应用最广泛的基因表达载体，可帮助外源基因转入受体细胞，并为其提 供在受体细胞中的复制或整合能力及扩增与表达能力。质粒是细菌中一种独立于染色体之 外的可自主复制的双链环状DNA分子，它含有独特的复制起始位点（ori)，有的还含有特定 的复制子结构（replicon)，质粒的拷贝数与它的复制结构息息相关。 [0003] 氧化葡萄糖酸杆菌佑.oxydans)含有多种膜结合脱氨酶，可不完全氧化醇、醒等 化合物生成相应的醒、酬和酸，其独特的不完全氧化特性使得它具有广泛的工业应用价值。 利用基因重组技术在氧化葡萄糖酸杆菌中过表达脱氨酶基因，可在很大程度上增加单位 质量菌体的酶活，提高相关产物的合成效率。目前，广泛用于G. oxydans基因表达的质粒 主要是广宿主质粒地BR1MCS系列，但是该质粒拷贝数较低。近来，少数研究者报导了基 于广宿主质粒地BR1MCS或G. oxydans内源性质粒而改造的质粒。例如，Verena等人将编 码G. oxydans核糖体蛋白L35和L13的基因的启动子区域整合到广宿主质粒地BR1MCS-2 中，构建了强启动子载体地BRlp264和中等强度启动子载体地BRlp452,有利于满足不同 程度蛋白表达水平的要求（参见 VerenaKallrdk, Maria Meyer, UweD巧penmeier, Paul Schweiger. Construction of expression vectors for proteinproduct ion in Gluconobacteroxydans. Journal of Biotechnology, 2010, 150:460-465.)。本发明人曾 W G. oxydans内源性质粒pG0X3为基础，构建了基因表达质粒pZLl。该质粒包含了 pG0X3中与 质粒分配有关的par基因和与复制有关的rep基因，W及质粒PUC19的氨节抗性基因和复 制起始区origin,因而该质粒在大肠杆菌及氧化葡萄糖酸杆菌中均可自主复制（参见Lin Zhang, Jinping Lin, Yushu Ma, Dongzhi Wei, Ming Sun. Construction of a Novel Shuttle Vector for Use in Gluconobacteroxydans. MolBiotechnol, 2010,46:227-233.)。然而， 该些质粒在G. oxydans中的拷贝数普遍较低，该大大限制了 G. oxydans的工业应用潜能及 科学研究进程。

[0004] 本发明的目的是提供一种适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体及其应用，从 而解决现有技术中的质粒在氧化葡萄糖酸杆菌中的拷贝数普遍较低，导致氧化葡萄糖酸杆 菌的工业应用受到限制的缺陷。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明采用W下技术方案：
[0006] 提供一种适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体，所述基因表达载体是；1)将 质粒地BR1MCS-5中的r巧基因启动子-35区"TTGACT"序列定点突变为"TTGACA"序列得 到的质粒（即将序列1689bp处的碱基T替换为碱基A得到的质粒），或将质粒地BR1MCS-5 中的rep基因启动子-10区"CATAAT"序列定点突变为"TATAAT"序列得到的质粒（即将序 列1707bp处碱基C替换为碱基T得到的质粒），或W上两处均定点突变得到的质粒，其中， 所述质粒地BR1MCS-5序列如SEQ ID NO ;1所示；或2)其他W PBBRIMCS质粒为基础的、且 与地BR1MCS质粒具有相同的rep基因作为复制起始区的质粒发生与1)相同的碱基替换所 得到的质粒。
[0007] 本发明所提供的基因表达载体W广泛用于氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌构建的 质粒地BR1MCS-5或W地BR1MCS质粒为基础的衍生质粒为骨架，将其与复制有关的rep基 因启动子的-35区和-10区分别突变为保守序列"TTGACA"和"TATAAT"，从而增强该启动子 的强度，W增加rep基因的表达量，进而提高质粒的拷贝数。
[000引所述衍生质粒包括所有W地BR1MCS质粒为基础的、且与地BR1MCS质粒具有相同 的rep基因作为复制起始区的质粒。
[0009] 该些衍生质粒可 W 是；pBBRlMCS-1、pBBRlMCS-2、pBBRlMCS-3、pBBRlMCS-4、 祀XG0X、pBBRl-p264、地BR1-P452等等。由于该些衍生质粒均具有与地BRIMCS质粒相同的 r巧基因，即与地BR1MCS-5相同的r巧基因作为复制起始区，因此在经过相同的定点突变后 该些衍生质粒能实现与质粒地BR1MCS-5经过相同的定点突变后的相同的技术效果。
[0010] 本发明还提供一种如上所述的适用于氧化葡萄糖酸杆菌的基因表达载体的应用， 所述基因表达载体在氧化葡萄糖酸杆菌中能够有效表达同源基因或异源基因，尤其能够更 有效地表达同源基因。
[0011] 所述同源基因可W是氧化葡萄糖酸杆菌膜结合葡萄糖酸-2-脱氨酶（ga2化）基 因，所述异源基因可W是绿色巧光蛋白（GF巧基因。
[0012] 本发明还提供了所述基因表达载体在氧化葡萄糖酸杆菌中表达氧化葡萄糖酸杆 菌膜结合葡萄糖酸-2-脱氨酶基因的应用，W及绿色巧光蛋白基因的应用。
[0013] 所述基因表达载体在氧化葡萄糖酸杆菌中对膜结合葡萄糖酸-2-脱氨酶基因的 有效表达还可用于2-酬基-D-葡萄糖酸高产基因工程菌的构建。
[0014] 还提供一种重组载体，所述重组载体通过如上所述的基因表达载体构建。
[0015] 还提供一种重组菌，所述重组菌含有如上所述的基因表达载体。
[0016] 本发明提供的基因表达载体通过在常用载体的基础上进行特定位点的突变，使其 在氧化葡萄糖酸杆菌中的拷贝数得到明显提高。并且经证明该载体具有在氧化葡萄糖酸杆 菌中能有效表达同源基因或异源基因的功能，与广泛应用于氧化葡萄糖酸杆菌中基因表达 的载体地BR1MCS-5质粒相比，本发明提供的基因表达载体在氧化葡萄糖酸杆菌中具有更 高的拷贝数，可用于在氧化葡萄糖酸杆菌中进行基因表达和未知功能基因的探索研究，尤 其可用于2-酬基-D-葡萄糖酸高产基因工程菌的构建。




[0017] 图1为实时定量PCR法测定质粒相对拷贝数的结果；
[001引 图2为PCR扩增得到的启动子化巧的电泳图谱；其中，左边泳道为DNA Marker,分 子标准从小到大依次为10化P，30化P，80化P，1500bp，200化P，3000bp ;右边泳道为化巧基 因片段；
[0019] 图3为PCR扩增得到的ga2化基因的电泳图谱；其中，左边泳道为DNA Marker,分 子标准从小到大依次为 300bp，500bp，800bp，1500bp，2000bp，3000bp，5000bp ;右边泳道为 ga2化基因片段；
[0020] 图4为各个重组菌与野生菌中ga2化转录水平的比较；
[0021] 图5为各个ga2化过表达菌催化葡萄糖酸钢（GA)的反应初速度的比较，即比较相 同条件下反应化后生成产物2KGA的浓度；
[0022] 图6为各菌在化发酵罐中W GA为底物生产2KGA的过程比较；
[002引图7为PCR扩增得到的GFP基因的电泳图谱；其中，左边泳道为DNA Marker,分子 标准大小从小到大依次为 300bp，500bp，800bp，1500bp，2000bp，3000bp，5000bp ;右边泳道 为GFP基因片段；
[0024] 图8为各表达GFP的重组菌在巧光共聚焦显微镜下的巧光照片；其中，（A) 为 G. 0巧dans/pBBRlMCS-GFP 的照片，炬）为 G. 0巧dans/pBBRlO-GFP 的照片，（C)为 G. oxydans/地BR35-GFP的照片，值）为G. oxydans/地BR3510-GFP的照片，巧）为对照菌 G. oxydans/地BR1MCS 的照片；
[0025] 图9为重组菌G. oxydans/地BR35-GFP与原始质粒GFP表达菌G. oxydans/ pBBRlMCS-GFP中GFP转录水平的对比。


[0026] W下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，W下实施例仅用于说明本 发明而非用于限制本发明的范围。
[0027] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，参照《分子克隆指 南》（New York:Cold Spring 化rbor L油oratory Press, 1989)中所述条件。
[002引下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0029] 虽然W地BR1MCS质粒为基础的、且与地BR1MCS质粒具有相同的r巧基因作为 复制起始区的所有衍生质粒，例如地BR1MCS-1、地BR1MCS-2、pBBRlMCS-3、地BR1MCS-4、 祀XG0X、pBBRl-p264、地BR1-P452等等在实施本发明的碱基替换之后均能实现本发明的技 术效果，但是由于篇幅限制，本说明书仅W质粒地BR1MCS-5作为示例示出而非限制，应当 理解，W地BR1MCS质粒为基础的衍生质粒均能实现本发明的技术效果。
[0030] 质粒 pBBRlMCS-5 ;参考 Kovach, M. E.，Elzer, P. H.，Steven Hill, D. , Robertson, G. T. , Farris, M. A. , Roop II, R. M. , Peterson, K. M. , (1995)Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Genel66, 175-176。
[0031] 培养基；
[003引 LB培养基；10g^ ^Cl，10g^蛋白腺，5g^酵母粉。
[0033] 山梨醇培养基；80g^酵母粉，80g^山梨醇，Ig^磯酸二氨钟，0. 3g^硫酸儀， 0. Ig^谷氨酷胺。
[0034] 固体培养基；液体培养基中加入1. 5%的琼脂。
[0035] 实施例1 ;质粒基因的定点突变
[0036] 质粒DNA的定点突变选用T0Y0B0公司的KOD-Plus-Mutagenesis Kit按照说明书 进行操作。首先，按照说明书的要求设计并合成引物（引物由上海捷瑞生物工程有限公司 合成），其序列如下：
[0037] M35-F ；CAGCCACTTTTACGCAACGCATAATT ；
[0038] M35-R ；TCAATTACAGATTTTCTTTAACCTACGCAATG ；
[0039] M10-F ；GIATAATTGTTGTCGCGCTGCCGAAAAG ；
[0040] MIO-R ；GTTGCGTAAAAGTGGCAGTCAATTACAG ；
[004U 其中，质粒地BRIO由-10区的点突变产生，pBBR35由-35区的点突变产生， 地BR3510则由-10区和-35区2轮点突变后产生。
[0042] 冰上配置反应液进行反向PCR，具体条件如下：
[0043] 反应体系；lOXBuffer for iPCR 2. 5yl，质粒地BRlMCS-5(50yl)，引物各 0. 75 y l，2mMdNTPs 2. 5 y 1，K孤-Plus-0. 5 y 1，dd&O 10 y 1 ;
[0044] 反应过程；94°C 2min，98°C 10s，68°C 5min，6 个循环，4°C保存。
[0045] PCR反应结束后，向PCR反应液中加入1 y 1 Dpnl，混匀，37°C保温2h，W去除其中 的模板质粒，提高突变子得率。
[0046] 化nl酶处理后，向体系中加入连接酶，使产物自身环化，具体条件如下：
[0047] 连接体系；Dpnl 酶切后的产物 2 y 1，dd&O 7 y 1，Ligation hi曲 5 y 1， T4Polynucleotide Kinase 1u1 ;
[0048] 反应条件；16它保温化。
[0049] 将上述连接产物转化大肠杆菌畑5 a，通过基因测序筛选阳性克隆。
[0050] 实施例2 ;质粒相对拷贝数的检测
[0化^ 质粒的相对拷贝数通过实时定量PCR法进行检测，W G. oxydans低拷贝内源性质 粒PG0X3作为参照，提取重组菌的总质粒作为模板，SYBR巧光染料购自北京康为世纪有限 公司。首先，设计和合成引物如下（引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成）：
[0052] qpBBR-F ；CGGATTCACCGTTTTTATCAGGCTC ；
[0053] qpBBR-R ；AGTGTGACCGTGTGCTTCTCAAATG ；
[0054] qpG0X3-F ；GTATTGGGCTGCGTTCGT ；
[00巧]qpG0X3-R ;AATGGGTTTCATGGTGGC ;
[0化6]反应体系（20 yl) ;2XFastSYBR Green Master Mix 10 yl，引物各0.5 ylidd&O 8 y 1，模板1 y 1。每个样品重复3次；
[0化7]反应条件；94°C 5min，94°C 30s，57°C 30s，40 个循环。
[0化引结果如图1所示，改造后的新质粒在G. oxydans中的拷贝数均比原始质粒 pBBRlMCS-5的拷贝数高。
[0059] 实施例3 种质粒的应用
[0060] 3. 1、表达ga2化基因的重组质粒的构建
[0061] 选择G. oxydans中的强启动子化巧作为表达目的基因ga2化的启动子，设计并合 成引物如下（引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成）：
[0062] P化fB-F ：ACTGAGCTCCGATGGTAAGAAATCCACTGC ；
[0063] P化fB-R ：ATATCTAGACCAAAACCCCGCTCCACC ；
[0064] ga2化-F ； CTATCTAGAGGAGAAACCTGTGCCCCCCATG ；
[00化]ga2化-R ；GAGGGATCCTTCAGTTCAGTGAGACCGCATCATC ；
[0066] W G. oxydans基因组为模板，分别PCR扩增化巧启动子片段和ga2化基因片段； 其中，化巧启动子两端含SacI和甜al酶切位点，ga2化两端含甜al和BamHI酶切位点。 反应条件如下：
[0067] 反应体系；2XPCR mix 25^1，引物各 1.5yl，模板 lyl，ddH2〇 21yl ;
[0068] 反应条件；（UifB)95°C 5min，95°C 30s，60°C 30s，72°C lmin，25 个循环，72°C 10min，4。保存；（ga2化）95°C 5min，95°C 30s，60°C 30s，72°C 4min，25 个循环，72°C 10min，4° 保存。
[0069] 将PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，如图2、图3所示，化巧片段长约5(K)bp， ga2化片段长约3800bp。用胶回收试剂盒将目的片段回收，化巧片段用SacI和甜al内切 酶37°C处理2小时，纯化后与同样酶切处理的质粒连接，转化大肠杆菌，转化子经PCR验证 后送测序，序列正确的保种并提质粒用于下一步构建。
[0070] ga2化片段用甜al和BamHI内切酶37°C处理2小时，纯化后分别与同样酶切处理 的已连有化巧启动子的质粒连接，转化大肠杆菌，转化子经PCR验证后送测序，序列正确的 保种。由此产生地BRlMCS-ga2化、地BR10-ga2化、地BR35-ga2化、地BR3510-ga2化四种过 表达ga2化基因的重组质粒。
[0071] 3. 2、表达ga2化的G. oxydans基因工程菌的获得
[0072] 将上述重组质粒转化E. coli后，用S亲本接合法将重组质粒导入G. oxydans。具 体为；供体菌E. coliD册a及含质粒地2013的辅助菌E. coli皿101在LB培养基中培养lOh 左右，受体菌G. oxydansDSM2003在山梨醇培养基中培养1化左右。分别取3种菌的菌液 lml，6, OOOrpm离屯、Imin，弃上清。用无菌山梨醇培养基分别洗漆3种菌体2次，6, OOOrpm离 屯、Imin，弃上清。用1ml山梨醇培养基将S种菌体合并到一个EP管，6,000巧111离屯、1111111，弃 掉850 y 1上清，剩余物用移液器混匀，涂布于无抗性的山梨醇固体平板上，于30°C倒置培 养过夜。再将无抗板上的菌膜用3ml无菌山梨醇培养基洗下，取200 y 1菌液涂布到含有头 抱西了钢和硫酸庆大霉素的双抗山梨醇固体平板上，于30°C倒置培养2?4天。挑取双抗板 上的单菌落于山梨醇液体培养基中培养20?2化，提取质粒进行PCR验证。获得的阳性克隆 用甘油保种备用。由此得到重组菌G. oxydans/地BRlMCS-ga2化、G. o;sydans/地BRl〇-ga2化、 G. oxydans/地BR35-ga2化、G. oxydans/地BR351〇-ga2化。同时将空质粒地BR1MCS-5 转入 G. oxydans作为空白对照。
[0073] 3. 3、各ga2化重组菌中ga2化基因转录水平的检测
[0074] ga2化基因的转录水平用实时定量PCR的方法检测，W重组菌cDNA作为模板， leSrRNA为内参，W插入空白质粒的原始菌为对照，比较各重组菌中ga2化转录水平相对于 对照菌中的倍数。首先按实时定量PCR的要求设计并合成如下引物：
[00巧]ql6S-F ;GCGGTTGTTACAGTCAGATG ;
[0076] ql6S-R ；GCCTCAGCGTCAGTATCG ；
[0077] qga2dh-F ;CCAGAACCTGTCCCAGTCCAC ;
[0078] qga2化-R ;CAGAAAGGCTGCGAGTTGAC ;
[0079] 模板的获得；G. oxydans培养至对数中后期，取15ml菌液离屯、后，用takara公司 的RNAiso plus试剂按说明书的方法提取RNA。获得的RNA用核酸定量仪将浓度稀释至小 于 lyg/yl，再用 taraka 公司的PrimeScript? RT reagent Kit with 曲 NARraser 试剂 盒按说明书的方法进行反转录，获得的cDNA作为实时定量PCR的模板。
[0080] 反应的体系与条件同实施例2中实时定量PCR的反应体系与条件。
[0081]结果如图 4 所不。重组菌 G. oxydans/地BRlMCS-ga2化、G. oxydans/地BRl〇-ga2化、 G. oxydans/地BR35-ga2化、G. o;sydans/地BR351〇-ga2化中ga2化的转录水平分别是原始菌 的3. 6倍、9. 1倍、4. 4倍和21. 4倍。可见改造后的S种质粒过表达ga2化的能力均比原始 质粒高。
[0082] 3. 4、S种ga2化重组菌催化活性的检测
[008引将S种重组菌及原始质粒过表达菌培养至对数中后期，800化pm离屯、lOmin，用 50mMp册.8的PBS洗漆两次，作为催化反应的静息细胞。用lOOmMp册.8的PBS配置10ml反 应体系，其中细胞lOg/1(湿重），葡萄糖酸钢佑A)40g^。反应化后，取样HPLC检测产物 2-酬基葡萄糖酸钢（2KGA)的生成量，W检测重组菌催化活性。
[0084] HPLC 检测条件：色谱柱为 ICSep C0REGEk87册(Transgenomic, USA)，柱温为 35°C，流动相为0. 008N H2SO4,流速为0. 35ml/min，检测波长为210nm。
[0085] 结果如图5所示。=种改造质粒过表达ga2化的菌株催化活性均比原始质粒过表 达的要局。
[0086] 综上所述，本发明的=种质粒是=种拷贝数比原始质粒高的质粒，且能更有效地 在G. oxydans中表达基因。
[0087] 3. 5、重组菌 G. oxydans/地BR3510-ga2化生产 2KGA 的应用
[0088] 根据3. 4的研究结果，重组菌G. oxydans/地BR3510-ga2化是ga2化催化活性提高 最多的菌株，因而将反应体系放大到1.化W考察其催化GA生产2KGA能力的提高程度，并 W转入空质粒的野生菌G. oxydans/地BR和原始质粒过表达菌G. oxydans/地BRlMCS-ga2化 作为对照。在化发酵罐中培养G. oxydans至对数后期，80(K)巧m离屯、20min，称取菌体加 入到发酵罐中，加入用蒸馈水溶解的葡萄糖酸钢（GA)溶液至总体积为1.化，使得细胞浓度 为30g/l (湿重），葡萄糖酸钢浓度为300g^，通入无菌空气，控制温度为30°C、p册.5、转速 eOOrpm开始反应，定时取样，样品离屯、取上清进行检测。
[0089] 结果如图6所示。重组菌G. oxydans/地BR3510-ga2化仅用1化就可将底物葡 萄糖酸钢完全消耗，产物2KGA的浓度达到320g/l，但是原始质粒过表达菌G. oxydans/ pBBRlMCS-ga2化和转入空质粒的野生菌G. oxydans/地BR则分别需要2化和4她才能完全 反应。可见改造后的质粒能在G. oxydans中更有效地表达基因ga2化。
[0090] 3. 6、用S种质粒表达外源基因GFP
[0091] 表达GFP的重组质粒的构建方法同3. 1，同样选用化巧启动子，GFP片段引物如 下：
[009引 GFP-F ：ACGTCTAGAAGAAAGACGATGGCTAGCA ；
[0093] GFP-R ； CGCGGATCCTTATTTGTACAGTTCATCCA ；
[0094] W质粒阳T28a-GFP(购自美国绿阳生物医药有限公司）为模板扩增GFP基因片 段，PCR反应体系与条件同扩增化巧。片段电泳图如图7所示，GFP片段长约72化P。由此 构建地BR1MCS-GFP、pBBRlO-GFP、PBBR35-GFP、PBBR3510-GFP 四种表达 GFP 基因的重组质 粒。
[0095] 表达GFP的G. oxydans基因工程菌的构建方法同3. 2,由此获得重组菌 G. oxydans/pBBRlMCS-GFP、G. oxydans/地BRIO-GFP、G. oxydans/地BR35-GFP、G. oxydans/ 地BR3510-GFP。
[0096] 3. 7、各GFP重组菌中巧光蛋白表达的检测
[0097] 各GFP重组菌先于试管中培养22h，再W 1 %的接种量转接到盛有50ml山梨醇培 养基的摇瓶中培养22h，获得的菌液于4°C、800化pm离屯、lOmin，用50mM P册.0的PBS缓冲 液洗漆2遍，重悬后滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片，用吹风机小屯、吹干，放到巧光共聚焦 显微镜（N化on，TE2000-U)下进行观察，并拍照记录。
[009引检测结果如图8所示，四种载体表达GFP的重组菌均有巧光，而对照菌则无巧 光，说明本发明的S种质粒均可使GFP基因在G. oxydans中成功表达，其中，G. oxydans/ 地BR35-GFP检测到的巧光最强。
[0099] 3. 8、重组菌G. oxydans/地BR35-GFP相对于原始质粒重组菌G. oxydans/ pBBRlMCS-GFP中GFP基因转录水平的检测
[0100] GFP基因转录水平的检测方法同3. 3中ga2化转录水平的检测方法，其中，所用检 测GFP片段的引物为：
[0101] qGFP-F ；GTTCAATGCTTTTCCCGTTATCC ；
[0102] qGFP-R ；CGTCTTGTAGTTCCCGTCAT
[0103] 结果如图9所示。G. oxydans/地BR35-GFP中GFP的转录水平相当于原始质粒重组 菌G. oxydans/地BR1MCS-GFP中的1. 7倍。可见质粒地BR35在G. oxydans中能更有效地表 达外源基因GFP。
[0104] W上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用W限定本发明的范围，本发明的上 述实施例还可W做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的 简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为 常规技术内容。