金核霉素的生物合成基因簇及其应用的制作方法[0002]金核霉素(aureonuclemycin)是1987年从金色链霉菌苏州变种(Streptomycesaureus var.suzhoueusis n.var Yen et al,中国微生物菌种保藏管理委员会编号CGMCCN0.0122 ;中国专利申请CN87100250)的发酵产物中分离得到的。作为一种优质的农用抗生素，金核霉素得到了广泛的应用。[0003]金核霉素及其结构类似物的化学合成已经由Nicholas J.Newcombe与SatoshiIchikawa等人作过深入研究,经过一个核心的由SmI2催化的Aldol反应形成C-糖苷键,实现金核霉素骨架结构的形成，然后经过多步反应实现环化和立体结构控制，生成终产物。化学合成经历的步骤繁琐,试剂复杂昂贵,并且合成过程中立体控制困难。Satoshi Ichikawa等人合成herbicidinB过程中，开始得到的产物并不是目标产物herbicidinB,而是它的异构体，他们经过分析后，改变了策略才成功的得到了 herbicidinB，但是产量很低，不能做为工农业生产用途。[0004]上海市农药研究所，经过二十年的努力，通过“试差法”，改变、调整发酵参数，摸索出了适合金核霉素生产的发酵条件，使金核霉素的产量得到了很大提高。但是仍然满足不了农业应用方面对金核霉素大量且质优价廉的要求；通过对其发酵液的HPLC检测，发现在发酵条件下，发酵液中除了金核霉素作为主要产物外，还有一种占很大比例的副产物5-脱氧次黄嘌呤核苷，将它的结构与金核霉素对比，发现其骨架结构与金核霉素具有很大的相似性，而且由于该副产物总是伴随着金核霉素的产生而产生。然而，迄今为止本领域尚未揭示金核霉素合成基因簇。 [0005]因此，本领域急需了解金核霉素生物合成相关的基因或基因簇，以便研究金核霉素的生物合成途径，进而通过基因工程和代谢工程手段提高金核霉素产量。
[0006]本发明的目的就是提供涉及金核霉素的生物合成基因簇，及其克隆、功能研究和应用。[0007]在第一方面，本发明提供一种金核霉素生物合成基因的集合，所述基因集合由编码AnmB蛋白的基因、编码AnmC蛋白的基因、编码AnmD蛋白的基因、和编码AnmE蛋白的基因构成。
[0008]在一优选例中，所述的AnmB蛋白包括选自下组的多肽:
[0009](a)氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的多肽；或
[0010](b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个(较佳地1-10个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽；
[0011]所述的AnmC蛋白包括选自下组的多肽:
[0012](a)氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示的多肽；或
[0013](b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个(较佳地1-10个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽；
[0014]所述的AnmD蛋白包括选自下组的多肽:
[0015](a)氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的多肽；或
[0016](b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个(较佳地1-10个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽；和
[0017]所述的AnmE蛋白包括选自下组的多肽:
[0018](a)氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的多肽；或
[0019](b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个(较佳地1-10个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽。
[0020]在第二方 面，本发明提供一种金核霉素生物合成基因簇，所述基因簇包括金核霉素生物合成涉及的4个基因，所述基因簇核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第5294-10434位碱基所示，具体为:
[0021]I)基因anmB，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第5294-6964位碱基所示，编码的蛋白为腺苷高半胱氨酸水解酶，长度为556个氨基酸；
[0022]2)基因anmC，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第6957-8057位碱基所示，编码的蛋白为脱氢酶，长度为366个氨基酸；
[0023]3)基因anmD，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第8054-9172位碱基所示，编码的蛋白为氧化还原酶，长度为372个氨基酸；和
[0024]4)基因anmE，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1的第9169-10434位碱基所示，编码的蛋白为radical SAM相关蛋白，长度为421个氨基酸。
[0025]在第三方面，本发明提供本发明第二方面所述的金核霉素生物合成基因簇所编码的编码蛋白。
[0026]在一优选例中,所述的编码蛋白为AnmB蛋白、AnmC蛋白、AnmD蛋白和AnmE蛋白，其氨基酸序列分别如SEQ ID N0:3-6所示。
[0027]在第四方面，本发明提供本发明第一方面所述的金核霉素生物合成基因的集合，或第二方面所述的金核霉素生物合成基因簇，或第三方面所述的编码蛋白的用途，其用于合成抗生素金核霉素、金核霉素的药学上可接受的盐及类似物。
[0028]在另一优选例中，所述的合成包括生物合成、催化合成、固定化酶合成。
[0029]在第五方面，本发明提供一种载体，所述载体含有第一方面所述的金核霉素生物合成基因的集合，或含有第二方面所述的金核霉素生物合成基因簇。
[0030]在一优选例中，所述表达载体上含有多拷贝的金核霉素生物合成基因的集合，或多拷贝的金核霉素生物合成基因簇。[0031]在另一优选例中，所述的载体包括表达载体、穿梭载体。
[0032]在另一优选例中,所述的载体包括质粒、或粘粒。
[0033]在第六方面，本发明提供一种重组的宿主细胞，含有第五方面所述的载体或染色体上整合有单拷贝或多拷贝的外源的第一方面所述的金核霉素生物合成基因的集合，或单拷贝或多拷贝的第二方面所述的金核霉素生物合成基因簇。
[0034]在另一优选例中，所述宿主细胞包括链霉菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。
[0035]在另一优选例中，所述宿主细胞包括金色链霉菌、变铅青链霉菌、白色链霉菌和天蓝色链霉菌。更佳地，所述宿主细胞来自金色链霉菌苏州变种或变铅青链霉菌TK64。
[0036]在第七方面，本发明提供一种产生金核霉素的方法，包括步骤:培养第六方面所述的宿主细胞，从而表达金核霉素；以及从培养体系中分离金核霉素。
[0037]在第八方面，本发明提供一种金色链霉菌，所述金色链霉菌是金色链霉菌苏州变种(CGMCC N0.0122)的突变株，所述突变株中金核霉素生物合成基因簇中的一个或多个基因失活，从而不产生金核霉素。
[0038]在另一优选例中，所述失活的基因选自anmB、anmC, anmD或anmE。
[0039]在另一优选例中，所述的失活包括中断失活、缺失失活、插入失活。
[0040]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。



[0041]下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
[0042]图1显示了金核霉素的化学结构。
[0043]图2显示了基因组文库黏粒的PCR筛选电泳图。各泳道如下:
[0044]M:分子量标准；
[0045]1:包含金核霉素生物合成基因簇的黏粒2H-2 ；
[0046]2:包含金核霉素生物合成基因簇的黏粒17C-10。
[0047]图3显示了金核霉素生物合成基因簇的基因分布图。
[0048]图4显示了金核霉素产生菌及基因敲除突变株的发酵产物分析。自上而下分别是金核霉素产生菌野生型菌株(WT)、anmA同框敲除突变株(Λ anmA)、anmB同框敲除突变株(Δ anmB)、anmC同框敲除突变株(Λ anmC)、anmD同框敲除突变株(Λ anmD)、anmE同框敲除突变株(Λ anmE)、anmG同框敲除突变株(Λ anmG)的发酵产物HPLC分析,及野生型中金核霉素的质谱图(LC-MS)。
[0049]图5显示了金核霉素生物合成基因簇在变铅青链霉菌(S.lividans)TK64中异源表达的发酵产物分析。图A为异源表达突变株S.lividans B-E的发酵产物HPLC图，图B为异源表达宿主菌野生型菌株S.lividans TK64的发酵产物HPLC图，图C为S.lividansB-E的发酵产物中金核霉素的质谱图(LC-MS)。
[0050]图6显示了同框敲除双交换质粒构建方法示意图。
[0051]图7显示了同框敲除突变株基因型PCR验证电泳图。从上到下分别是anmA同框敲除突变株(Λ anmA)、anmB同框敲除突变株(Λ anmB)、anmC同框敲除突变株(Λ anmC)、anmD同框敲除突变株(Λ anmD)、anmE同框敲除突变株(Λ anmE)和anmG同框敲除突变株(Λ anmG)的基因型PCR验证电泳图。

[0052]本发明人经过广泛而深入的研究，首次从金核霉素产生菌金色链霉菌苏州变种(CGMCC N0.0122)中鉴定并分离出金核霉素的生物合成基因簇，所述整个基因簇共包含4个基因，即anmB、anmC,anmD和anmE。此外,本发明人还构建了含金核霉素的生物合成基因簇(或基因)的载体和工程菌，并成功进行了金核霉素异源表达。在此基础上完成了本发明。
[0053]金核霉素
[0054]金核霉素是一种核苷类抗生素，于1987年从金色链霉菌苏州变种的发酵产物中分离得到，其由一分子腺苷与一分子葡萄糖缩合、环化而成(图1)，化学结构类似于日本三共株式会社发表的除草素Herbicdins。
[0055]金核霉素具有良好的抗菌活性，对黄单胞杆菌(Xanthomonas)引起的植物细菌病害，如柑橘溃瘍病、水稻细菌性条斑病，特别是水稻白叶枯病(Xanthomonas Oryzae)有很好的治疗效果，同时金核霉素还具有使病斑叶复绿的功能。因此，金核霉素作为优质的农用抗生素得到广泛应用。
[0056]金色链霉菌苏州变种(Streptomyces aureus var.suzhoueusis n.var Yen etal)
[0057]金色链霉菌(Streptomyces aureus)是链霉菌是一种,其孢子丝呈紧密螺旋形，有的菌株柔曲、松敞螺旋形；其孢子呈球形、卵圆形，表面光滑。而金色链霉菌苏州变种(Streptomyces aureus var.suzhoueusis n.var Yen et al)是属于金色链霉菌类群，其气生菌丝呈螺旋状，一般在2-6圈左右；孢子呈球形或卵形，大小不均，孢子表明光滑；不能在纤维素上生长。
[0058]一种产生金核霉素的金色链霉菌苏州变种可获自中国微生物菌种保藏管理委员会，编号 CGMCC N0.0122。
[0059]金核霉素生物合成基因的集合
[0060]本发明所述的金核霉素生物合成基因的集合(set)，表示由编码AnmB蛋白的基因、编码AnmC蛋白的基因、编码AnmD蛋白的基因、编码AnmE蛋白的基因构成的基因集合。
[0061]如本文所用，“本发明多肽”或“本发明蛋白”可互换使用，指金核霉素生物合成相关蛋白，包括AnmB蛋白、AnmC蛋白、AnmD蛋白和AnmE蛋白。
[0062]本领域普通技术人员不难知晓，在多肽的某些区域(如非必要区域)改变(添加、缺失或取代)少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如适当替换氨基酸得到的序列并不会影响其活性(可参见Watson等，Molecular Biology of The Gene,第四版，1987,The Benjamin/Cummings Pub.C0.P224)。因此,就本领域普通技术人员而言,能够实施这种替换或改变并且仍获得具有所需生物活性的多肽。
[0063]因此，所述的AnmB蛋白包括选自下组的多肽:(a)氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示的多肽；或(b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽；所述的AnmC蛋白包括选自下组的多肽:(a)氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示的多肽；或(b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽；所述的AnmD蛋白包括选自下组的多肽:(a)氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示的多肽；或(b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽；所述的AnmE蛋白包括选自下组的多肽:(a)氨基酸序列如SEQ IDN0:6所示的多肽；或
(b)包含(a)所限定的序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的序列，且基本具有(a)所限定的多肽功能的由(a)衍生的多肽。其中，一个或多个包括1-50个，较佳地1-20，更佳地1-10个，最佳地1-5个。
[0064]在本发明中，本发明的“多肽”包括与氨基酸序列如SEQ ID N0:3_6所示的多肽相t匕，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异的多肽可根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生。
[0065]