一种脂肪酸合成酶抑制剂及其制造方法与应用制作方法

田维熙, 李丽春, 张睿, 吴哓东

2003年12月31日

2002年6月14日

2002年6月14日

田维熙

A61P3/04GK1463737SQ0212401

合成酶 抑制剂 脂肪酸 制造

1.脂肪酸合成酶抑制剂，是用有机溶剂或/和水从中药首乌藤中萃取出的物质2.根据权利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制剂，其特征在于所述有机溶剂为极性有机溶剂，其中，优选乙醇3.根据权利要求2所述的脂肪酸合成酶抑制剂，其特征在于所述乙醇的浓度为20％-80％，优选的是40％-60％4.一种生产权利要求1所述脂肪酸合成酶抑制剂的方法，包括以下步骤(1)将粉碎后的首乌藤置于容器中，加入有机溶剂或/和水；(2)在20℃-40℃条件下萃取1-5小时；(3)离心或过滤，收集上清液5.根据权利要求4所述的生产脂肪酸合成酶抑制剂的方法，其特征在于所述加入的有机溶剂或/和水的重量为所述首乌藤重量的5-50倍；其中优选的为10-20倍；所述有机溶剂为极性有机溶剂，其中，优选乙醇，最优选的是浓度为20％-70％的乙醇，更优选的是浓度为40％-60％的乙醇6.以权利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制剂为活性成分的减肥药7.以权利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制剂为活性成分的治疗癌症的药物8.权利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制剂作为食品添加剂的应用9.权利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制剂作为日用化学品添加剂的应用10.权利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制剂作为保健品添加剂的应用

本发明涉及酶的抑制剂及其制造方法与应用，特别是涉及一种脂肪酸合成酶抑制剂及其制造方法与应用此外，还有研究表明脂肪酸合成酶和癌症的发生有着密切的关系，许多癌细胞中都有异乎寻常的高表达脂肪酸合成酶，如人类乳腺癌中便呈现出脂肪酸合成酶的高水平表达和高活性(Kuhajda FP，Jenner K，Wood FD，et al.Fatty acid synthesisa potential selective target for antineoplastic therapy.Proc Natl Acad SciUSA，1994，916379-6383)对乳腺癌、前列腺癌、子宫癌和甲状腺癌等的研究表明这些癌的恶性种类中均存在脂肪酸合成酶的优先表达脂肪酸合成酶的表达和恶性肿瘤之间存在的关系还显示脂肪酸合成的活性在肿瘤维持它的恶性表型的过程中起着重要作用事实上，除了乳房和子宫内膜外，脂肪酸合成酶在绝大多数正常组织中均受到饮食中脂肪的负调节，而相反，脂肪酸合成酶在癌细胞中却通常是高表达，这种组织分布特异性使得脂肪酸合成酶成为治疗癌症的一个引人注目的新靶点而且已有实验证明在体内抑制脂肪酸合成酶的活性对人类癌细胞确实表现出了选择性的杀伤毒力(Francis P.Kuhajda，MD，2000.Fatty-Acid Synthase and humancancernew perspectives on its role in tumor bology.Nutrion 16202-208)FAS抑制剂是人类癌细胞的选择性细胞毒素，恶性肿瘤和FAS表达之间的关系显示，FAS的表达和其自身的活性可能对人类癌细胞的生存和生长均至关重要体外实验证明FAS抑制剂浅蓝菌素(Cerulenin)是人类癌细胞的选择性细胞毒素，5g/ml的浅蓝菌素对人类NIHOVCAR-3卵巢癌的生长抑制在72小时内达到ID50，但对正常皮肤纤维母细胞没有生长抑制(Pizer ES，Wood FD，Heine HS，et al.Inhibition offatty acid synthesis delays disease progression in a xenograft model of ovariancancer.Cancer Res 1996；561189)它对许多人类癌细胞系有广谱抗性，包括乳腺(MCF-7，ZR-75-1，SKBR3，MDA435)(Kuhajda FP，Jenner K，wood FD，etal.Fatty acid synthesisa potential selective target for antineoplastictherapy.Proc Natl Acad Sci USA，1994；916379)，卵巢(OVCAR-3)(Pizer ES，Wood FD，Heine HS，et al.Inhibition of fatty acid synthesis delays diseaseprogression in a xenograft model of ovarian cancer.Cancer Res 1996；561189)，结肠(HCT116，RKO)，白血球(HL60)(Pizer ES，Wood FD，Pasternack GR，etal.Fatty acid synthase(FAS)a target for cytotoxic antimetabolities in HL60promyelocytic leukemia cells.Cancer Res 1996，56(4)745-751)，前列腺(TSU-prl)E.Pizer等发现浅蓝菌素对癌细胞的毒性和脂肪酸合成有关(Rashid A，Pizer ES，Moga M，et al.Elevated expression of fatty acid synthase and fattyacid synthetic activity in colorectal neoplasia.Am J Pathol，1997，150(1)201-208)对FAS的抑制导致细胞凋亡，显示癌细胞的存活依赖于脂肪酸合成途径体内试验也得到类似结果，将人类OVCAR-3移植到裸鼠体内，24小时后用浅蓝菌素处理，会提高存活率并阻止其向恶性发展(Pizer ES，Wood FD，Heine HS，et al.Inhibition of fatty acid synthesis delays disease progression in a xenograftmodel of ovarian cancer.Cancer Res 1996，56(6)1189-1193)这种处理对腹水瘤影响最大，恶性发展从对照的65％降低到2l％，对实体瘤的生长代谢影响相对小一些Pizer等的研究表明，人体内成长最快的组织子宫内膜在增生期可在其上皮细胞表达大量FAS(Pizer ES，Kurman RJ，Pasternack GR，et al.Expression of fattyacid synthase is closely linked to proliferation and stromal decidualizationin cycling endometrium.Int J Gynecol Pathol 1996，1645-50)用流式细胞仪对HL-60细胞进行分析显示，当抑制了脂肪酸合成时细胞聚集在G1期而不能通过细胞周期在人类结肠癌细胞系中还发现，抑制FAS后90分钟内DNA合成受到抑制，6小时后凋亡开始这些发现都表明脂肪酸合成与人体组织的增生存在某种联系因此，研制和开发脂肪酸合成酶的抑制剂将具有重大的现实意义及开发潜力本发明的另一目的是提供一种制造上述脂肪酸合成酶抑制剂的方法本发明的又一目的是提供上述脂肪酸合成酶抑制剂的用途本发明的脂肪酸合成酶抑制剂，是用有机溶剂或/和水从中药首乌藤中萃取出的物质所述的有机溶剂为极性有机溶剂，其中，优选的是乙醇，最优选的是20％-80％的乙醇，更优选的是40％-60％的乙醇生产上述脂肪酸合成酶抑制剂的方法，包括以下步骤(1)将粉碎后的首乌藤置于容器中，加入有机溶剂或/和水；(2)在20℃-40℃条件下萃取1-5小时；(3)离心或过滤，收集上清液在上述生产方法中，所述加入的有机溶剂或/和水的重量可以为所述首乌藤重量的5-50倍，其中优选的为10-20倍；所述有机溶剂为极性有机溶剂，其中，优选乙醇，最优选的是浓度为20％-80％的乙醇，更优选的是浓度为40％-60％的乙醇如果萃取在搅拌、常温条件下进行，则萃取2小时即可；如果离心是在8000转/分钟的条件下进行，则进行15分钟以本发明的脂肪酸合成酶抑制剂为活性成分生产的药物，特别是用于减肥和用于治疗癌症的药物，是本发明脂肪酸合成酶抑制剂的主要应用领域本发明的脂肪酸合成酶抑制剂还可以作为食品添加剂、日用化学品(特别是化妆品)添加剂及保健品添加剂等而得到广泛应用中药首乌藤为蓼科植物何首乌(Polygonum multiflorum Thunb.)的干燥茎原植物为多年生缠绕草本干燥的藤茎呈细长圆柱状，通常扭曲，有时分枝，直径3-7毫米表面紫褐色，粗糙，有扭曲的纵皱纹和节，并散生红色小斑点，栓皮菲薄，呈鳞片状剥落质硬而脆，易折断，断面皮部棕红色，木部淡黄色，木质部呈放射状，中央为白色疏松的髓部气无，味微苦涩主产河南，湖北，湖南，江苏，浙江等地中药首乌藤“味苦，性温，无毒”(《本草再新》)，“入心，脾二经”(《本草再新》)，同时“入肝，肾二经”(《四川中药志》)中医认为，首乌藤能养心，安神，通络，祛风治失眠，劳伤，多汗，血虚身痛，痈疽，风疮疥癣取首乌藤茎清水洗净，稍浸泡，捞出，润透后，切段，晒干即可备用本发明巧妙地将传统的中药首乌藤用有机溶剂或/和水，特别是乙醇和水的混合物进行萃取，创造性地揭示出，所萃取出的物质是有效的脂肪酸合成酶抑制剂由于中药首乌藤本身无毒，因而为该脂肪酸合成酶抑制剂的进一步开发利用提供了广阔的前景实验表明脂肪酸合成酶抑制剂可以有效抑制脂肪酸合成酶的活性，而脂肪酸合成酶活性的强弱直接影响到生物细胞内合成脂肪的多少也就是说，抑制了脂肪酸合成酶的活性，生物细胞内合成脂肪的过程会弱化，脂肪含量即会得到控制，甚至减少，而且，脂肪酸合成酶抑制剂还可以控制动物的食欲，因此本发明的脂肪酸合成酶抑制剂可以作为减肥药物的活性成分，生产口服液、冲剂、胶囊、片剂、针剂等各种剂型的减肥药物脂肪酸合成酶抑制剂具有对癌细胞的选择性杀伤作用，因此以本发明的脂肪酸合成酶抑制剂为活性成分的各种剂型的治疗癌症的药物，由于没有副作用，将会得到非常广泛的应用本发明的脂肪酸合成酶抑制剂还可以作为保健品、食品的添加剂，比如，可作为高热量食品的添加剂，使喜食高热量食品的人既满足了口福，又不用担心会增胖本发明的脂肪酸合成酶抑制剂还可以作为美容日用化学品的添加剂，如可以制成减肥霜，对需要减肥的部位进行定点涂抹同时，由于中药首乌藤的源植物分布甚广，为脂肪酸合成酶抑制剂的工业化生产提供了保证下面结合具体实施例对本发明作进一步说明脂肪酸合成酶活性采用乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、NADPH为底物的标准测活方法测定(W.X.Tian et al.，1985.J.Biol.Chem.，260(20)11375-11387；田维熙等，1996.不同生长期蛋鸡的体脂水平和肝脏脂肪酸合成酶活性的关系.生物化学杂志，12(2)234-236)脂肪酸合成酶(FAS)活性被抑制的程度用I％(抑制程度)来表示，其计算方法为以底物中只加入相应提取溶剂的为对照，测定其脂肪酸合成酶活性值，该值用A0表示，并设定其为100％底物中加入脂肪酸合成酶抑制剂提取液的为实验组，测得其脂肪酸合成酶活性的数值为A；R.A.％(剩余活性)＝A/A0×100％I％(抑制程度)＝100％-RA％实施例1用乙醇从中药首乌藤中萃取脂肪酸合成酶抑制剂(1)取中药首乌藤，粉碎后置于容器中，加入20倍重量的40％乙醇，充分搅拌后密封；(2)在30℃、搅拌的条件下萃取2小时；(3)将上述萃取液在8000转/分钟的条件下离心15分钟，取上清液，即为含脂肪酸合成酶抑制剂的提取液，以备下面的实验使用可以用与该实施例相同的方法，用不同浓度的乙醇(如20％，40％，50％，60％，80％，100％)、水、与乙醇极性相近或较弱的有机溶剂(如丙酮)来萃取脂肪酸合成酶抑制剂如果是在非搅拌条件下进行萃取，则至少应半小时搅拌一次，萃取3-4小时另外，还可以用弱极性的正丁醇等来萃取，但实验证明溶解性不高，在非极性溶剂中不溶用该实施例的方法自中药首乌藤中萃取脂肪酸合成酶抑制剂，搅拌条件下，萃取时间只要不低于1小时，温度在20-100℃之间均能萃取出有效成分在实际生产中，萃取后一般采用压滤机来收取上清液实施例2相同的实验系统溶液中加入不同数量的脂肪酸合成酶抑制剂对FAS活性的影响(测活的酶加入量为每毫升实验系统溶液10微克) 由以上实验结果可以看出，随着加入提取液量的增加，FAS酶活性被抑制程度I％升高，当每毫升实验系统溶液中加入0.25微升的提取液时，I％已高达100％实施例3萃取溶剂对脂肪酸合成酶活性的影响取与实施例2相同的实验系统溶液，分别向每毫升溶液中加0.05、0.075、0.15、0.20、0.25微升40％的乙醇，加入的酶量也与实施例2相同，检测计算FAS酶活性被抑制的程度I％，结果是I％均为0，表明所加量的萃取溶剂乙醇不会抑制脂肪酸合成酶的活性，抑制脂肪酸合成酶活性的是从中药首乌藤中萃取出的物质实施例4脂肪酸合成酶抑制剂的半抑制浓度用实施例1所得的提取液进行实验，结果表明，要达到I％＝50％，每毫升溶液中需加入0.153微升的提取液，折算成加入中药首乌藤的微克数为0.075，折算成每毫克酶加入中药首乌藤的微克数为7.5，半抑制浓度很低，说明本发明的脂肪酸合成酶抑制剂对脂肪酸合成酶的活性有强烈的抑制作用，并且所需有效剂量很低实施例5不同萃取剂对萃取出的脂肪酸合成酶抑制剂数量的影响分别用溶剂水，4％乙醇，乙醇，丙酮，正丁醇，乙醚，石油醚按照实例1的方法来萃取脂肪酸合成酶抑制剂，然后各取5微升在相同的实验系统溶液中对相同量的酶进行抑制活性检测，将结果比较如下 从以上实验结果可以看出，本发明的脂肪酸合成酶抑制剂可以溶于水，乙醇及乙醇和水的混合物等极性高的溶剂中，而在极性低的溶剂中溶解性不高，在非极性溶剂中则不溶实施例6不同比例的水和乙醇的混合物对脂肪酸合成酶抑制剂萃取数量的影响分别用水，20％，40％，50％，60％，80％，100％的乙醇为溶剂按照实施例1的方法来萃取脂肪酸合成酶抑制剂，然后检测它们对FAS活性的影响(每毫升实验系统溶液中含酶10微克) 从以上的实验结果中可以看出，乙醇的浓度为20％-80％时，提取物对FAS酶活性的抑制程度较高，乙醇的浓度为40％-60％时，FAS酶活性全部被抑制，说明不同浓度的乙醇对脂肪酸合成酶抑制剂的萃取是有影响的实施例7萃取液对脂肪酸合成酶的不可逆抑制性的判断把一定量实施例1所得的萃取液与酶混合，使酶的剩余活性接近0％，放置80分钟，然后过Sephadex G25离心柱如果其中的抑制剂和酶是可逆结合的话，过柱后，小分子会留在柱上，酶的活性就会恢复，若是不可逆结合，就会和酶一起通过凝胶柱，酶的活性不能恢复为防止过柱本身对酶造成失活而产生不可逆的假像，同时用不加萃取液的酶做一对照实验结果发现，对照组的酶过柱后活性尚剩约80％，而与萃取液混合的酶的活性没有恢复，说明排除过柱对酶造成的失活，实施例1中的萃取液还含有与脂肪酸合成酶不可逆结合的成分实施例8、萃取液对癌细胞的作用 (1)处理萃取液，去除有机溶剂的影响将实施例1中的提取液在常温下干燥，再用同剂量的水溶解，去除沉淀；(2)在标准培养条件下，把人体乳腺癌细胞SKBR-3和成纤维细胞培养在RPMI培养基1640(含10％FBS)中，细胞分装在96孔板中，每孔5000个细胞，培养过夜，然后分别加入不同量的处理后的提取液(从5μl-50μl)，同时用同剂量的溶剂(水)做对照实验加完样后，将细胞在37℃度下保温72小时，然后用结晶紫(0.2％，用12％的乙醇溶解)染色，在490nm下测定吸收值，通过线性回归求出其半抑制浓度(IC50)结果表明，加入抑制剂的SKBR-3细胞的生长受明显抑制；加入抑制剂的成纤维细胞的生长受抑制不明显；加入溶剂(水)的对照组无生长抑制现象；SKBR-3细胞的IC50与成纤维细胞的IC50差别显著上述结果表明，本发明的脂肪酸合成酶抑制剂对癌细胞确实有选择性杀伤作用