乳糜微粒作为肝脏靶向基因治疗载体的应用制作方法_于保锋专利（基因治疗,靶向,乳糜）-早鸽网

乳糜微粒作为肝脏靶向基因治疗载体的应用制作方法

专利名称

乳糜微粒作为肝脏靶向基因治疗载体的应用制作方法
发明者

于保锋, 刘志贞, 司海东, 向前, 弓韬, 张俊涛, 张小曼, 张悦红, 徐钧, 王惠珍, 程凯, 胡晓年, 解军, 赵虹
公开日

2011年9月28日
申请日期

2011年4月1日
优先权日

2011年4月1日
申请人

山西医科大学
文档编号

A61K47/42GK102198276SQ201110082169
关键字

基因治疗靶向乳糜微粒载体肝脏作为
权利要求

1.乳糜微粒作为基因治疗药物的载体的应用2.乳糜微粒作为肝脏靶向基因治疗药物的载体的应用3.乳糜微粒作为治疗肝癌的基因治疗药物的载体的应用
技术领域

本发明涉及乳糜微粒的应用，特别是涉及将乳糜微粒作为基因治疗载体的一种全新的应用
背景技术
具体实施例方式

实施例1 制备乳糜微粒包裹pAFP-TK-IRES2-EGFP质粒载体的双靶向性基因载体配置浓度为50 μ g/mL的pAFP_TK-IRES2_EGFP质粒载体，将乳糜微粒置于超声破碎仪超声10次，每次15S，超声功率150W，按照质粒载体与乳糜微粒的质量体积比2 μ g/mL将质粒载体与乳糜微粒混合，涡旋震荡30s，静置30min，制成乳糜微粒包裹 pAFP-TK-IRES2-EGFP质粒载体的双靶向性基因载体所述的真核表达质粒载体PAFP-TK-IRES2-EGFP购自北京希尔诚兴业科技有限责任公司，该质粒载体的质粒图谱如图1，其上含有启动基因表达的甲胎蛋白(AFP)启动子， AFP启动子只能在特定的AFP启动环境下才能被启动，进而启动其下游的基因表达，该质粒载体上还携带有自杀基因TK (胸苷激酶基因)，该基因被启动后可以在肝癌细胞特异表达胸苷激酶，这种酶能使进入肝癌细胞的一种叫更昔洛韦的药物转变成为可以杀灭肝癌细胞的药物，同时还能产生“旁观者效应”，即杀死邻近的肝癌细胞该效应只在肝癌细胞中产生，构成了本实施例载体除乳糜微粒外的第二个靶向性实施例2 乳糜微粒对pAFP-TK-IRES2-EGFP质粒载体的包裹效果采用扫描电镜对实施例1所得的双靶向性载体进行观测，100000倍扫描电镜图显示乳糜微粒对PAFP-TK-IRES2-EGFP质粒载体包裹效果良好，并且粒径均在200 300nm 之间，如图2实施例3 乳糜微粒对pAFP-TK-IRES2-EGFP质粒载体的保护作用在实施例1所得的双靶向性载体中加入牛胰脱氧核糖核酸酶I，使其终浓度为 20 μ g/mL, 37°C消化30min，以单纯的pAFP_TK-IRES2_EGFP质粒载体做对照，琼脂糖凝胶电泳观察乳糜微粒对PAFP-TK-IRES2-EGFP质粒载体的保护作用观察结果见图3，泳道1 显示单纯的PAFP-TK-IRES2-EGFP质粒载体由于没有乳糜微粒的保护作用，被牛胰脱氧核糖核酸酶I降解；泳道2显示双靶向性载体中乳糜微粒对pAFP-TK-IRES2-EGFP质粒载体具有很强的保护作用，可以避免其被牛胰脱氧核糖核酸酶I降解结果显示双靶向性载体中乳糜微粒对PAFP-TK-IRES2-EGFP质粒载体具有很强的保护作用，可以避免其被降解，因此双靶向性载体具有较高的稳定性实施例4 双靶向性载体介导EGFP在肝癌细胞株中的特异性表达用实施例1所得的双靶向性载体分别转染体外培养的肝癌细胞株MHCC97、正常肝细胞株L-02、心肌细胞株HCMa、正常肾细胞株HK-2、大肠癌细胞株HT-29、骨骼肌细胞株 HSkMC,事先将体外培养的细胞株配制成10000个/mL的细胞悬液，然后每IOmL细胞悬液中加入实施例1所得双靶向性载体lmL，混勻，置37°C培养转染48小时后，用荧光倒置显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白的表达量结果显示实施例1所得的肝癌基因治疗双靶向性载体仅在肝癌细胞株MHCC97中表达绿色荧光蛋白(EGFP)(图4)，其它细胞中未观察到EGFP 的表达，证明实施例1所得的肝癌基因治疗双靶向性载体具有较高的靶向性实施例5 制备乳糜微粒包裹pGenesil-4质粒载体的靶向性基因载体配置浓度为50 μ g/mL的pGenesil-4质粒载体，将乳糜微粒置于超声破碎仪超声 10次，每次15s，超声功率150w，按照质粒载体与乳糜微粒的质量体积比2 μ g/mL将质粒载体与乳糜微粒混合，涡旋震荡30s，静置30min，制成乳糜微粒包裹pGenesil-4质粒载体的靶向性基因载体所述的真核表达质粒载体pGenesil-4购自北京希尔诚兴业科技有限责任公司，该质粒载体的质粒图谱如图5，其上含有CMV(巨细胞病毒)启动子，可以启动其下游的EGFP (增强型绿色荧光蛋白)基因表达，可以在肝细胞或肝癌细胞表达绿色荧光蛋白实施例6 乳糜微粒对pGenesil-4质粒载体的包裹效果采用扫描电镜对实施例5所得的靶向性载体进行观测，100000倍扫描电镜图显示乳糜微粒对pGenesil-4质粒载体包裹效果良好，并且粒径均在200 300nm之间，如图 6实施例7 乳糜微粒对pGenesil-4质粒载体的保护作用在实施例5所得的靶向性载体中加入牛胰脱氧核糖核酸酶I，使其终浓度达到20 μ g/mL, 37°C消化30min，以单纯的pGenesil-4质粒载体做对照，琼脂糖凝胶电泳观察乳糜微粒对pGenesil-4质粒载体的保护作用观察结果见图7，泳道1显示单纯的 pGenesil-4质粒载体由于没有乳糜微粒的保护作用，被牛胰脱氧核糖核酸酶I降解；泳道 2显示靶向性载体中乳糜微粒对pGenesil-4质粒载体具有很强的保护作用，可以避免其被牛胰脱氧核糖核酸酶I降解结果显示靶向性载体中乳糜微粒对pGenesil-4质粒载体具有很强的保护作用，可以避免其被降解，因此靶向性载体具有较高的稳定性实施例8 靶向性载体介导EGFP在肝细胞株中的特异性表达用实施例5所得的靶向性载体分别转染体外培养的正常肝细胞株HL-7702、心肌细胞株HCMa、正常肾细胞株HK-2、大肠癌细胞株HT-29、骨骼肌细胞株HSkMC，事先将体外培养的细胞株配制成10000个/mL的细胞悬液，然后每IOmL细胞悬液中加入实施例5所得靶向性载体lmL，混勻，置37°C培养转染48小时后，用荧光倒置显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白的表达量结果显示实施例5所得的肝脏基因治疗靶向性载体仅在肝细胞株HL-7702 中表达绿色荧光蛋白(EGFP)(图8)，其它细胞中未观察到EGFP的表达，证明实施例5所得的肝脏基因治疗靶向性载体具有较高的靶向性

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专利名称：乳糜微粒作为肝脏靶向基因治疗载体的应用的制作方法乳糜微粒(chylomicron，CM)，是一种由小肠黏膜上皮细胞合成、直径80 500nm 的再加工脂质小滴，含有甘油三酯、胆固醇酯和一些载脂蛋白如apoA I、apoA IKapoAIV, apoB48、apoC I、apoC II、apoC III、apoE 等，其分子量大于 50 X 106，密度小于 0. 95g/cm3，主要功能是运输外源性甘油三酯至骨骼肌、心肌、脂肪等组织，运输外源性胆固醇至肝脏。食物中的脂类在细胞滑面内质网上经再酯化后与粗面内质网上合成的载脂蛋白构成新生的乳糜微粒，经高尔基复合体分泌到细胞外，进入淋巴循环最终进入血液。新生乳糜微粒进入血液后，接受来自HDL的apoC和apoE，同时失去部分apoA，被修饰成为成熟的乳糜微粒。成熟分子上的apoC II可激活骨骼肌、心肌及脂肪等组织毛细血管内皮细胞外表面上的脂蛋白脂肪酶(LPL)，催化乳糜微粒中甘油三酯水解为甘油和脂肪，磷脂水解为溶血磷脂。释出的脂肪酸被上述组织摄取而利用，甘油可进入肝脏用于糖异生。通过LPL的作用，乳糜微粒中的甘油三酯大部分被水解利用，同时apoA、apoC、胆固醇和磷脂转移到HDL 上，乳糜微粒逐渐变小，成为以含胆固醇酯为主的乳糜微粒残余颗粒。肝细胞膜上的apoE 受体可识别乳糜微粒残余颗粒，将其吞噬入肝细胞，与细胞溶酶体融合，载脂蛋白被水解为氨基酸，胆固醇酯分解为胆固醇和脂肪酸，进而可被肝脏利用或分解，完成最终代谢。截至目前，未发现关于乳糜微粒应用的任何报道。肝癌是很常见的肿瘤之一，在全球发病率日益上升，严重危害人类的生命健康。目前治疗肝癌的方法主要是化疗、手术、介入等手段，但效果都不够理想。随着基因科学和技术的日益发展，基因治疗肝癌成为了可能。基因治疗的关键问题是携带基因的载体问题，目前该领域技术发展迅速，常用的肝癌基因治疗载体主要有病毒载体、脂质体、质粒、阳离子聚合物等。病毒载体效率高，但特异性差，且由于安全性问题，应用一直不理想。脂质体安全，但特异性差。在众多的阳离子聚合物中，聚乙烯亚胺(PEI)具有极高的正电荷密度，可以与 DNA形成紧密的络合体，是近年来体内外细胞转染中研究最广，转染率最高的高分子载体。但是高正电荷密度同时使PEI表现出很大的细胞毒性，而且载体的特异性也不强。如何实现基因治疗的特异性，即靶向性，是肝癌基因治疗的关键问题。从生物相容性和生物降解性考虑，设计低细胞毒性，高靶向性的载体成了亟待解决的问题。选择能够直接杀伤肝癌细胞而不损伤正常肝细胞，也就是特异定向于肝癌细胞的靶向性治疗基因载体体系，成为今后研究的方向。
本发明的目的是提供乳糜微粒的一种新用途，即乳糜微粒在基因治疗药物上的应用。事实上，本发明提供了乳糜微粒作为肝脏靶向基因治疗药物的载体的应用。乳糜微粒作为一种新的治疗肝癌的基因载体，具有良好的肝细胞靶向性，这是因为在乳糜微粒中含有载脂蛋白E (apoE)，而在肝细胞和肝癌细胞膜表面均存在apoE受体，可以特异的识别和结合apoE。因此，乳糜微粒可以特异性的携带质粒载体定向于肝细胞和肝癌细胞，而不被身体的其它细胞所摄取，这就构成了本发明基因载体的靶向性。更为重要的是，乳糜微粒是纯天然的生物提取物，最终会在肝细胞和肝癌细胞中被代谢，无残留物，无任何细胞毒性问题。制备本发明乳糜微粒的一种方法是取SD品系大鼠，雌雄不限，体重220 260g，采用下述高脂饲料喂养，喂食后15 30min采血，1000转/分低速离心15min，取血浆，然后35000转/分超速离心1 h，取最上层即为乳糜微粒。所述的高脂饲料是称取胆固醇10g、猪油100g、蛋黄100g、普通动物饲料2100g，先将猪油加热到40°C，加入胆固醇粉末待其溶解后，再加入蛋黄搅拌乳化，拌入普通动物饲料，加入适量水拌勻、攥团、蒸熟，按每天每IOOg体重4g饲料，以自然采食法喂给。需要说明的是，以上并非乳糜微粒的唯一性制备方法，还可以通过其他途径获取到乳糜微粒。最为简单的途径是，许多生化试剂销售企业都有乳糜微粒商品销售，例如，北京启维益成科技有限公司。图 1 是 pAFP-TK-IRES2-EGFP 质粒图谱。图2是乳糜微粒包裹pAFP-TK-IRES2-EGFP质粒的扫描电镜图(X 100000)。图3是乳糜微粒对PAFP-TK-IRES2-EGFP质粒保护作用的琼脂糖凝胶电泳。图4是实施例1双靶向性载体介导EGFP在肝癌细胞株MHCC97中的特异表达 (X300)。图5是pGenesil-4质粒图谱。图6是乳糜微粒包裹pGenesil-4质粒的扫描电镜图(X 100000)。图7是乳糜微粒对pGenesil-4质粒保护作用的琼脂糖凝胶电泳。图8是实施例5靶向性载体介导EGFP在肝细胞株HL-7702中的特异表达(X 300 )。

本发明涉及乳糜微粒的一种新用途，即乳糜微粒作为基因治疗药物的载体的应用，特别是乳糜微粒作为肝脏靶向基因治疗药物的载体的应用。在乳糜微粒中含有apoE，而在肝细胞和肝癌细胞膜表面均存在apoE受体，可以特异的识别和结合apoE，因此，乳糜微粒可以特异性的携带质粒载体定向于肝细胞和肝癌细胞，而不被身体的其它细胞所摄取，具有良好的肝细胞靶向性，同时，乳糜微粒最终会在肝细胞和肝癌细胞中被代谢，无残留物，无任何细胞毒性问题。

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