专利名称：靶向于组织因子基因的小核酸及其用途的制作方法小干扰核酸(small interfering RNA, siRNA)是带有特定基因密码的短小核酸碱基片断，一般功能长度为21 23bp。其作用原理是与特定靶基因mRNA结合，使之降解而失去功能。这种双链RNA分子介导的高效转录的基因沉默现象称之为核酸干扰(RNAinterference, RNAi),双链RNA进入细胞内先与细胞内的其他成分结合成一个核酸复合体，从而形成RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex, RISC);激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA上并切割而导致mRNA降解，从而清除细胞内特定的基因表达。siRNA不仅广泛应用于生物医学研究，而且可利用其对致病基因的高效特异性抑制的特性设计药物。微小RNA (microRNA，miRNA)是调节基因表达的21 23个核苷酸长度的单链RNA分子。miRNA是由DNA转录的基因编码，但不翻译成蛋白质的非编码RNA ；miRNA形成过程是由称做pri-miRNA原始转录本加工成pre-miRNA的短莖环结构,其作用途径与siRNA相同，pre-miRNA经Dicer酶切割后形成miRNA,进入RISC,通过碱基互补配对的方式识别革巴mRNA,并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。成熟的miRNA分子部分互补到一个或多个mRNA分子，它们的主要功能是下调基因的表达。年龄相关性黄斑变性(age-relatedmacular degeneration, AMD)是 50 岁以上的人视力损害的主要原因之一。发达国家的60岁以上人群发病率在10%以上。随着中国人口老年化，该病的发病率有上升趋势。AMD病变发生在视网膜的黄斑区。在临床上分为干性和湿性两型，干性主要由视网膜细胞凋亡引起，表现为视网膜地图样萎缩。病程发展慢但不可逆。湿性的病理特征为脉络膜新生血管(choroid neovascularization, CNV)伴有大量渗出，病程发展快，但有效抑制脉络膜新生血管可在一定程度上改善视力。该病早期的病理变化为视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial cells,RPE)功能受损，细胞外基质积聚导致Bruch膜增厚和玻璃膜疣形成。目前认为AMD的发病机制为氧化应激、炎症反应和免疫反应。在特定的致病因子方面，血管内皮细胞生长因子(vascular endothelialgrowth factor, VEGF)在促进湿性AMD的CNV形成上起关键作用。干性AMD目前基本无特异治疗方法。湿性AMD治疗主要针对脉络膜新生血管。传统的疗法有激光光凝，光动力疗法，手术和放射。但疗效不佳。基因泰克公司2005年成功开发出二种抗VEGF抗体,Avastin和Lucentis后,湿性AMD治疗发生了很大的改观。Lucentis以AMD为适应症。Avastin是美国FDA批准用于直肠癌的药物，适应症并不包括AMD。但由于其结构与Lucentis相似并且价格便宜也在临床上广泛使用。这两种抗VEGF抗体球内注射可减缓相当部分患者的疾病进展及部分改善视力。抗VEGF —直是AMD眼药的开发的主要思路。在siRNA方面，可表达VEGF短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)腺病毒载体可有效抑制VEGF诱导小鼠CNV。小鼠玻璃体腔注射后可有效地沉默高水平的VEGF，从而阻止CNV的形成(Cashman SM等人.I0VS，2006;47:3496-3504)。然而近年来发现VEGF除了病理性地促进CNV的形成外，还有很强的针对非血管细胞的生理性功能。VEGF通过激活VEGF受体2对视网膜节细胞有直接保护作用(Nishijima K等人Am J Pathol.2007;171:53-67)。离体试验也发现VEGF可减少视网膜节细胞在氧化应激时的损伤。如加入Avastin, VEGF的这种保护作用消失(Brar等人Mol Vis. 2010; 16:1848-53)。这些研究结果提示在临床上过度直接抑制VEGF可能造成的风险。组织因子(Tissue factor, TF，又称促凝血酶原激酶、凝血因子III和CD142)属于二型细胞因子受体超家族，是凝结因子7 (clotting factor VII，FVII)和其活化成分 (FVIIa)的受体。组织因子是一种跨膜单链糖蛋白，其由263个氨基酸残基的位于胞内的羧基端和23个氨基酸残基的跨膜区，以及胞内219个氨基酸残基的氨基端组成，其中胞内氨基端含有与 FVII/FVIIa 结合的区域(Chu AJ. Front. Biosci. 11，256-271 (2006))。组织因子在多个器官组织上表达，其中包括眼组织。炎症和氧化应激可刺激组织因子高表达(Cho等人Lab Invest. 2010 Nov I)。已知组织因子与多个AMD的病变的发生机制有关。其中包括细胞凋亡、炎症反应、新生血管和补体激活。Bora等用组织因子抗体有效地抑制7 小鼠模型 CNV 的形成(Bora PS 等人:PNAS. 2003; 100:2679-84)。
本发明的目的在于提供一种治疗眼底新生血管相关性疾病的新途径，利用靶向TF基因的小核酸分子来抑制病理状态下TF基因的异常高表达，以达到抑制新生血管的形成，从而达到治疗眼底新生血管相关性疾病的目的。为了达到上述目的，本发明提供了靶向于组织因子基因的小核酸在制备治疗眼底新生血管相关疾病的药物中的应用。所述的小核酸用作药物的活性成分，小核酸可以是调节TF基因表达的siRNA或微小RNA (microRNA, miRNA)。在一个优选的实施方式中，所述的siRNA分子，其具有如下序列结构 正义链5’ -GAGCCUCUGUAUGAGAACUNN-3’ (SEQ ID NO: I) 反义链5’ -AGUUCUCAUACAGAGGCUCNN-3’ (SEQ ID NO: 2) 其中，N为胞嘧啶核苷C、鸟嘌呤核苷G、腺嘌呤核苷A、尿嘧啶核苷U ;脱氧胞嘧啶核苷dC、脱氧鸟嘌呤核苷dG、脱氧腺嘌呤核苷dA或脱氧胸腺嘧啶核苷dT。换句话说，该双链siRNA分子的主干序列为 正义链5’ -GAGCCUCUGUAUGAGAACU-3’ (SEQ ID NO: 3) 反义链5’ -AGUUCUCAUACAGAGGCUC-3’ (SEQ ID NO: 4)。在一个优选的实施方式中，上述序列中3’端的“NN”是两个脱氧胸腺嘧啶核苷dT。所述的眼底新生血管相关疾病为新生血管异常增生相关疾病。所述的新生血管异常增生相关疾病为年龄相关性黄斑变性和糖尿病视网膜病变中的至少一种。本发明经筛选的靶向TF基因的小核酸分子可抑制病理状态下TF基因异常高表达，玻璃体腔注射后不仅可减少TF基因引起的细胞凋亡，从而防止AMD向干性方面发展；还可以阻断TF基因引起的CNV形成，从而防止湿性AMD的形成。靶向TF基因的小核酸的使用可避免对VEGF的过度直接抑制可能引起的副作用。因此靶向TF基因的小核酸可望治疗眼底新生血管相关性疾病。


图I是提纯的不同实验组的细胞总RNA电泳检测图，实验组分别为TF_sl转染组、TF_s2转染组、TF_s3转染组和正常组。图2为实施例I中不同实验组TF基因的mRNA相对表达量柱形图，横坐标表示各处理实验组，纵坐标表示TF基因相对看家基因GAPDH的mRNA相对表达量。 图3为实施例2中不同实验组TF基因的mRNA相对表达量柱形图，横坐标表示各处理实验组，纵坐标表示TF基因相对看家基因GAPDH的mRNA相对表达量。

IARPE-19细胞培养
ARPE-19 细胞在含 10%FBS 的 DMEM/F12 培养基(美国 Invitrogen 公司)，37°C、5% CO2培养箱(美国Thermo公司)中培养。2 siRNA设计与合成
设计靶向TF基因的siRNA序列。根据美国NCBI数据库中的TF基因序列(NCBI库号NM_001993)，用siRNA设计软件设计3对siRNA，并由百奥迈科生物技术有限公司合成，将正义链和对应的反义链退火成siRNA双链，转染前配置成浓度为20 u M0序列如下


本发明涉及靶向于组织因子(TissueFactor,TF)基因的小核酸及其用途，具体涉及其在制备治疗眼底新生血管相关疾病的药物中的应用。所述的眼底新生血管相关疾病尤其是指治疗年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变等由新生血管异常增生引起的眼病。本发明经筛选的靶向TF基因的小核酸分子可抑制病理状态下TF基因异常高表达，玻璃体腔注射后不仅可减少TF基因引起的细胞凋亡，从而防止AMD向干性方面发展；还可以阻断TF基因引起的CNV形成，从而防止湿性AMD的形成。靶向TF基因的小核酸的使用可避免对VEGF的过度直接抑制可能引起的副作用。因此靶向TF基因的小核酸可望治疗眼底新生血管相关性疾病。