专利名称：一种肿瘤靶向治疗药物载体、其制备方法及其应用的制作方法目前，在肿瘤治疗中，由于绝大多数生物活性物质即肿瘤治疗药物都缺乏将自己 送入细胞内的能力。所以直接给药存在生物利用度低、细胞毒性大等缺点，为了克服这些缺 点，人们研究了大量载体。随着对许多疾病在基因水平分子机理的了解，基因治疗成为治 疗许多疾病尤其是恶性肿瘤最有前途的途径，即用各种载体包裹核酸等生物活性物质并携 带到达用药靶点进行转导和表达，从而进行肿瘤的靶向治疗。载体目前一般分为病毒载体 (如逆转录病毒和腺病毒)和非病毒载体(如阳离子聚合物和囊泡)。早期遗传修饰的病 毒成为基因载体的焦点，但是在本世纪初基于病毒的基因转送方法出现安全性和有效性的 障碍后，科学界对纳米粒子载体系统的兴趣迅速增长。现行非病毒载体系统可分为阳离子 脂质体，DNA-多聚体结合物和裸DNA几类。这几类中，利用阳离子脂质体作为载体转送DNA 等核酸类活性物质的基因治疗是研究的热点。真核细胞最外层是细胞膜，它是一种由双极性脂质分子形成的双层结构，它通过 抑制周围环境中化合物的被动渗透保护细胞。它的组成成分主要有三大类磷脂、糖脂和 胆固醇。由于独特双极性的结构，在水溶液中它们都可自发产生脂肪滴。这些脂肪滴被称 为脂质体，1961年由Bangham和R. W. Home博士发现其与天然的细胞膜结构非常相像。后 来，人们进一步发现脂质体可以和细胞膜融合并将其内含物注入到细胞内。从此，脂质体作 为药物的载体广泛应用，如，呼吸道疾病的气溶胶治疗；抗癌药物如Doxorubicin(Doxil)， Camptothecin和Daunorubicin(Daunoxome)目前市场上都有脂质体剂型的出售。人们不断研究发现，D0TAP，即1，2_二(油酰氧基)_3_ (三甲基铵)丙烧，以及它的 类似物，由于通过修饰增加的净正电荷以及脂质结构的类似，可以通过与细胞膜融合将DNA 转送进入培养的细胞。电荷变化的修饰使得阳离子脂质与带负电荷的细胞膜接近，保证脂 质体和细胞膜之间发生主动融合，将物质注入细胞，从而被广泛用于肿瘤药物尤其是基因 药物载体。但是，这种电荷的改变也激活动物免疫系统的防卫机制。DOTAP脂质体在50% 以上血清浓度情况下，被细胞摄入的作用完全失效。为了解决DOTAP及其类似物在血清尤其是高血清浓度的条件下作用失效的问题， 首次由Gao和Huang于1991年采用胆固醇作为辅助脂用来克服血清的抑制作用。他们建议 使用胆固醇与DOPE (二油酰基磷脂酰乙醇胺)混合在体内尤其有效。胆固醇使得脂质体的 脂质双层结构稳定，已经广泛应用于纤维化囊肿的临床试验。1995年Liu等用阳离子脂质 DDAB(dimethyldioctadecyl ammonium bromide)与胆固醇以 1 1 摩尔比制成的脂质体， 通过静脉注射介导了 CAT (氯霉素乙酰转移酶)报告基因的高水平表达。1997年Templeton 等通过静脉注射用Dotap 胆固醇(摩尔比1 1)将CAT报告基因运送到小鼠组织中，他 们发现转基因在不同组织中有差异性的表达，而绝大多数基因表达积累在小鼠的肺和肝组织，(Templeton 等，1997)。血清对阳离子脂质体介导基因转染的抑制作用非常复杂，目前还没有完全搞明 白。对于任何在人血液中工作的运送系统，80% -100%的正常生理血清浓度是首先需要克 服的障碍。胆固醇已经被证明在体内转移中可能是有效的的辅助脂质。体外在80% -100% 血清浓度的条件下(人类血液的生理条件)转染培养细胞，可以代替动物评价脂质体在血 清中的稳定性和转染效率。在高血清浓度的条件下阳离子脂质DNA复合物转染效率的优 化，可用DC复合物在小鼠体内高效转导率来判断鉴定。L-α-卵磷脂是细胞膜的主要结构分子，无免疫原性。在脂质体的形成中作为活性 成分，可以单独或作为辅助脂质形成脂质体。辅助脂质对实现脂质体的特殊应用目的具有 重要的意义。如，，胆固醇可以保护脂质体包裹的物质免遭血清降解，协助靶向选择等。但通 常辅助脂质对脂质体的包装能力有不利的影响。除了一个为正电荷头部，另一个为中性头 部基团外，DOTAP与L- α -卵磷脂之间有非常相似的疏水链，确保了两种物质以任何摩尔比 都能均勻混合。传统的研究中，是用DOTAP加入到卵磷脂中以增加转染效率，但总的说来， 正如Templeton证明的那样，体内的转染率并不高。加入少量(5% )DOPS到DOTAP 胆固 醇(50 45)中，形成DOTAP 胆固醇D0PS(50 45 5)脂质体，体内基因的表达剧烈 下降，用DOPC代替胆固醇后，体内基因的表达几乎完全消失。许多研究工作测试卵磷脂及 其衍生物如 DOPS(Dioleoyl Phosphatidylserine)、D0PC(Oleoyl Phosphatidylcholine)、 DOPE(Dioleoylphosphatidyl-ethanolamine)与 DOTAP 以 1 1 摩尔比形成的脂质体，认 为它们并不适合体内的基因转染。就在最近的2009年仍有报道采用L-α -卵磷脂及其衍 生物与DOTAP及其类似物组成的混合物作为载体，其中，DOTAP与L-α -卵磷脂的摩尔比 采用1 1传统的阳离子脂质和中性辅助脂质配比的模型。DOTAP卵磷脂在上述的研究 中更多地是作为阴性对照在应用，而没有作为一个基因载体的候选。虽然L-α-卵磷脂及 其衍生物与DOTAP及其类似物的组合具有比DOTAP与胆固醇的组合更好的包装能力，但正 如Templeton等所提到的，这样的组合，由于较大的卵磷脂头部基团阻碍了 DOTAP较小头部 的阳离子的暴露，反而对脂质体复合物的转染有相反的影响，体内基因转移几乎完全被排 除。而且，由于卵磷脂的加入使得脂质体复合物膨胀很多，粒径超过300nm(Templeton等， 2009)。卵磷脂及其衍生物作为辅助脂质提高脂质体体内转染率在相关的美国专利申请中 被否定(如美国专利号为US6413544和US677(^91的美国专利)。而我们从脂质体形成的 原理分析L- α -卵磷脂及其衍生物与DOTAP及其类似物的组合之所以被否定，可能是由于 卵磷脂加入的量和比例不合适造成的，如果要进一步提高载体的靶向性、载体包覆药物后 的血清稳定性以及生物利用度等，需要对载体比例作进一步探索。另外，载体装载生物活性物质后形成的复合物的大小对于全身性转送是非常重要 的(Uchiyama等，1995 ；Ishida等1999)。例如，由于血管-增强性渗透和滞留效应(EPR)， 粒径IOOnm到150nm的脂质体表现出特异聚集在肿瘤组织的特性。所有健康人类血管的内 皮壁被紧密连接在一起的内皮细胞密封。这种紧密的连接阻止血液中任何大颗粒渗漏出血 管。肿瘤血管细胞之间不具备这种密封水平的连接，具有特征性的漏洞。这种特性被称为 增强性渗透和滞留效应。特定大小的脂质体，尤其是粒径在90-250nm范围的，可以迅速从 血管进入肿瘤部位，但遇到健康组织血管的内皮壁它们被保留在血液中(aiang等，2008)。 而采用目前的声波和/或挤压法制备的复合物一般粒径在300nm以上，所以控制载体的大5小以及载体装载生物活性物质后的大小非常重要。当阳离子脂质体与DNA混合，正离子电荷的脂质体和负离子电荷的DNA等核酸类 活性物质互相电力的吸引，看得见的封装转换马上开始，整个过程在几秒钟内完成。包裹装 载的脂质体体积在这个转化过程中膨胀。质粒DNA比起大多数的小分子药物为大分子。由 于复合物大小，部分依赖于被包装的DNA等核酸类活性物质分子的大小和数量，所以复合 物大小的控制并不能通过只单独控制脂质体来实现。总的说来，随着DNA等核酸类活性物 质浓度的增加，最终复合物颗粒长的越大。当DNA等核酸类活性物质浓度超过脂质体的包 装能力，就会发生沉淀。从DNA等核酸类活性物质工作起效剂量的角度来说，单颗粒中需要 更多的基因携带，尤其是在肿瘤治疗或疾病根治的情况。治疗起效必需的DNA等核酸类活 性物质量阈值在大多数情况下限制了用较少DNA量取得较小复合物颗粒的选择。而大于 400nm粒径的纳米颗粒对于静脉注射并不理想，因为引起栓塞导致动物死亡的可能性很大。 具有大装载量同时颗粒粒径较小的载体组成配方就是成功的基础。复合物组成中过量的DNA等核酸类活性物质引起复合物颗粒粒径的增大和沉淀 发生。不足量的DNA等核酸类活性物质引起复合物毒性的增加。而正确制备的脂质体DNA 复合物并不表现出裸脂质体般的毒性。有效地包装DNA等核酸类活性物质达到载体的最大 装载量实际上是非常重要的，不仅仅因为对最大转染效率的考虑，也是减小脂质体-DNA复 合体毒性的考虑。而目前并没有控制载体达到最大装载量的方法，从而使得载体的装载量 较为随机，不易控制，进而导致治疗效果不佳。
本发明所要解决的技术问题之一是提供一种药物(生物活性物质)载体，这种 载体能装载用于肿瘤预防和治疗的生物活性物质，并能靶向转染基因和具有更好血清稳定 性。解决该技术问题的方案是一种肿瘤靶向治疗药物载体，由DOTAP或其类似物 和卵磷脂或其衍生物两种组分组成，所述DOTAP或其类似物、卵磷脂或其衍生物的摩尔比 20 (7-13)，其中，所述的 DOTAP 类似物包括但不限于 DOTMA (1，2-di-0-octadecenyl-3_t rimethylammonium propane chloride) > DDAB (Dimethyldioctadecylammonium Bromide) > 甲基硫酸化DOTAP中的一种，所述的DOTAP具有如附图1中A的结构；所述的卵磷脂衍生物包括但不限于DOPC ( 二油酰基卵磷脂)、D0PS ( 二油酰基磷脂 酰丝氨酸)或DOPE，所述的卵磷脂具有如附图1中B的结构。作为优选DOTAP或其类似物和卵磷脂或其衍生物的摩尔比为20 (8_11)。进一步的DOTAP或其类似物和卵磷脂或其衍生物的摩尔比为20 9。本发明所要解决的第二个问题是提供一种肿瘤靶向治疗药物载体的制备方法， 从而制备合适的粒径大小的载体，满足药物装载的需要和靶向治疗的需要。解决该技术问题的技术方案是依次按照下述步骤进行制备a在容器中将上述摩尔比的DOTAP或其类似物、卵磷脂或其衍生物在脂溶性有机 溶剂中混合，然后用氮气吹洗容器；所述的脂溶性有机溶剂包括但不限于氯仿，乙醇或乙 腈；b加热至30°C将氯仿蒸发去除，形成脂质体薄膜；c在50°C下用D5W液溶解b步骤中得到的脂质体薄膜；d用孔径0. 45 μ m的过滤器过滤一次，再用孔径0. 1 μ m的过滤器过滤4次，即得。本发明所要解决的第三个问题是提供一种这种载体的应用。解决该技术问题的技术方案是将该载体应用于肿瘤治疗。作为优先所述载体装载负电荷的生物活性物质形成复合物。作为优选将负电荷的生物活性物质运送到体外培养、离体和体内的活细胞中。进一步的所述负电荷的生物活性物质为DNA或RNA或寡聚核酸。进一步的所述复合物中还混合有蛋白质配体、抗体或类固醇。更进一步的所述复合物的粒径为90nm-250nm。进一步的所形成的复合物用于联合肿瘤治疗的化疗和放疗。更进一步的所形成的组合物制备成注射剂或气溶胶喷雾剂。更进一步的控制载体装载负电荷的生物活性物质达到载体的最大装载量，其方 法为复合物在波长260nm的光吸收值与负电荷的生物活性物质浓度之间的校正符合载 体和负电荷的生物活性物质浓度之间的正弦曲线拟合模型，当达到正弦曲线的第一个波峰 时，即达到载体的最大装载量。更进一步的控制复合物达到最小的细胞毒性，其方法为复合物在波长^Onm的 光吸收值净增与复合物的细胞毒性呈正相关，复合物0D260正弦曲线第一个波峰时的DNA 浓度，是复合物体内外细胞毒性最小的浓度。更进一步的控制复合物达到最大的转染能力，其方法为波长^Onm的光吸收净 增与复合物的转染能力呈正相关，在复合物0D260正弦曲线第一个波峰时的DNA浓度，是复 合物体内外转基因表达最高的浓度。发明人经过大量实验发现，与现有的脂质体载体相比，采用适当比例的DOTAP及 其类似物与卵磷脂及其衍生物作为载体，运载DNA、RNA或者寡聚核酸等生物活性物质时， 在体外或者体内环境下，都具有较好的血清稳定性，同时具有更好的靶向转导性。另外，采 用适当的制备方法，本发明的载体与生物活性物质制成的复合物的粒径大小合适，更有利 于药物装载和靶向治疗。本发明通过理论分析和大量实验证明，DOTAP及其类似物与卵磷脂及其衍生物采 用适当比例以及适当方法制备的药物载体，可以具有较好的肿瘤治疗靶向性和最较小的细 胞毒性，克服了 DOTAP及其类似物与卵磷脂及其衍生物的组合物不适合用于药物载体尤其 是基因药物治疗肿瘤的载体的技术偏见，同时取得了意想不到的技术效果该脂质体作为 载体运载DNA等药物治疗肿瘤具有更好的靶向性，同时具体更好的血液稳定性。研究发现，以DOTAP和卵磷脂形成载体，装载DNA为例，如图1所示，DOTAP脂质和 合作(辅助)脂质卵磷脂共用同长的双链疏水尾巴，阳离子DOTAP具有一个修饰过的正电 荷头部基团，卵磷脂具有天然磷酸基头部基团，图中的载体是由DOTAP 卵磷脂摩尔比为 20 9的混合物，通过0.1 μ m过滤产生的主要为单层小泡的脂质体。卵磷脂的大头部基团 遮蔽较小带正电荷的D0TAP，规避血清的降解作用和增加脂质体复合物在血液中的稳定性。在探索出较佳的载体组分及比例的同时，本发明还提供了这种载体的制备方法。 本发明是在氯仿等有机溶剂中溶解和混合DOTAP或其类似物和卵磷脂或其衍生物，蒸馏去 除有机溶剂形成薄膜，水化合DOTAP或其类似物和卵磷脂或其衍生物，通过用0. 1 μ m孔径7滤器挤压过滤4次制成均勻的单层小泡结构，粒径为80-100nm。本方法可以放大达到载体 的大规模生产或为靶向转移的运送修饰加入配体，该方法制备的载体的结构重现性好，并 且在适合的贮存条件下非常稳定，可存放至少2年。上述载体可与生物活性试剂结合形成 活性复合物，本发明的载体为生物活性试剂提供保护，防止血清降解作用并具有主动转染 能力。这种载体能应用于肿瘤治疗。其中应用之一是这种载体可以与DNA、RNA或寡聚核 苷酸等混合制成复合物，该复合物具有在高浓度血清培养细胞和人类肿瘤移植动物模型经 静脉注射后，体内外高效基因转移的能力。这种复合物的主要靶组织是体内、体外快速生长 的肿瘤细胞。这赋予了它用于人类癌症基因治疗的重要应用潜能。本发明进一步优化这种复合物粒径到90nm到250nm并包裹携带具治疗效能的 DNA, RNA或寡聚核苷酸等。实验证明，1 ug/μ 1具有细胞凋亡原基因的DNA、RNA或寡聚核 苷酸等可与本发明的载体混合形成粒径大约200nm的复合物。本发明还提供了这种复合物形成的最佳方法的鉴定和控制。经过大量实验发现， 测量这种复合物在260nm波长测量的光吸收值，可以用来测定本发明及别的脂质体，如 DOTAP与胆固醇混合的脂质体等，对DNA，RNA或寡聚核苷酸等的装载能力，这种复合物在 ^Onm波长测量的光吸收值与DNA、RNA或寡聚核苷酸等生物活性物质的浓度以正弦模型方 式相关，正弦曲线的第一个波峰即显示出本发明的载体对DNA、RNA或寡聚核苷酸等生物活 性物质最大包装能力。本发明进一步应用是用本载体制备任何试剂盒套装。本发明的载体可以单独进行 商业化利用，也可以作为特定应用试剂盒的组成部分。本发明也包括在任何试剂盒，指导和 手册中0D260正弦曲线模型作为优化脂质体核酸的方法。本发明进一步应用是关于使用抑瘤基因，如本发明实施例中的抑瘤基因p53，与本 发明的载体形成抑瘤基因DNA癌症基因治疗复合物。本发明的另一个应用是包含生物活性物质如核酸的复合物可以通过多种途径注 射，如静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下、病灶内注射给药，或输液，口服或喷雾方式给药。综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是本发明的载体通过 适当的制备方法并装载核酸等生物活性物质，从而可以应用于全身性给药进行肿瘤靶向治 疗，可靶向运送到体外培养、离体和体内的肿瘤细胞内，具有达到最大包装量、靶向转染基 因和血清稳定性的理想效果。
图1 :A为DOTAP的结构，B为L- α -卵磷脂的结构，C为DOTAP 卵磷脂DNA复合 物形成的模式，图中C中“-”代表核酸的负电荷，A中“ + ”代表正电荷；图2 天然卵磷脂的大头基团帮助DOTAP免遭血清的降解并增加脂质体复合物在 血液中稳定性的原理示意图；图3 不同比例的DOTAP与卵磷脂组成的载体在无血清培养液中对H1299细胞的 转染力对比图；图4 :D0TAP与卵磷脂组成的载体与DNA形成的复合物在高或低血清浓度条件下不 同的转染效率；
图5 摩尔比为20 9的DOTAP与卵磷脂形成的载体与DNA形成的复合物的转染 效率与复合物粒径大小的关系；图6A-F =DLiDNA复合物的0D260值与DNA浓度的关系图；图7:摩尔比为20 9的DOTAP与卵磷脂形成的载体与pFCB-eGFP形成的复合物 对不同细胞株不同的转染效率；图8 体内有肿瘤或无肿瘤情况下LacZ基因在肺脏和肝脏的表达，A 是对照小鼠 的肝脏，B 是A549肿瘤转移的肝脏，C 是对照小鼠的肺脏和脾脏，D 是A549肿瘤转移的肺 脏；图9:静脉注射摩尔比为20 9的DOTAP与卵磷脂形成的载体与pFCB_p53形成 的复合物对A549皮下移植瘤模型肿瘤生长的抑制。表1 =DOTAP, Lecithin (卵磷脂)浓度比的缩写；表2 转染率和细胞毒性比较，其中XTT读数代表处理组活细胞比未处理组细胞的 比率，表中“Luc”表示通过测定Iuciferase酶的活性来确定基因的转移效率。

DL[20:8]DL[20:9]DL[20:10]DL[20:11]DOTAP浓度4 mM4 mM4 mM4 mM卵磷脂浓度1.6 mM1.8 mM2mM2.25 mMDOTAP与卵磷脂的摩 尔比20:820:920:1020:11表2为转染率和细胞毒性比较表

本发明公开了一种可通过静脉注射全身性给药的药物载体和制备方法及其应用于肿瘤基因治疗的技术，属于肿瘤靶向治疗领域，本发明的载体是由DOTAP或其类似物与卵磷脂或其衍生物按摩尔比20∶(7-13)组成的一种新型脂质体，它能与生物活性物质形成稳定的复合物，并能将这些活性物质定向高效携带到体外培养和人体内部的靶细胞内；本发明的复合物具有较大的包载量，并且颗粒粒径大大减小，即优化到200nm及以下，在高血清浓度的环境下保持了很高的转染效率，当本发明的载体包裹携带抑癌基因或细胞自杀基因DNA等，形成的复合物就可靶向运送到体外培养、离体和体内的肿瘤细胞内，达到对肿瘤进行基因治疗的目的。