专利名称：靶向载药超声微泡及其制备方法靶向载药超声微泡及其制备方法1968年Gramiak首次报道了可增强显影的小气泡，即超声微泡造影剂(UCA)。UCA 的出现开创了无创超声诊断和治疗的新领域。随着对其研究的不断深入，人们发现超声微 泡造影剂不仅是一种良好的超声显像对比剂，而且是一种重要的药物递送载体。对超声微 泡造影剂携带基因或药物靶向治疗在医学领域的研究日益广泛。超声微泡造影剂靶向治疗 包括超声介导载药微泡的治疗及超声介导靶向载药微泡的治疗。微泡与药物的结合方法有(1)直接黏附在微泡外壳，如带负电基团的药物容易 黏附在带正电的脂质微泡表面；( 包裹入微泡外壳中，构成超声微泡造影剂外壳的成分 白蛋白、磷脂多糖等均是药物的良好载体，可将药物吸附、整合或包裹其中；C3)包裹入微 泡内部，这是一种比较稳定的结合方式，药物包载率高且在超声作用下能完整释放，可增加 靶组织的药物浓度，通过将具有较大副作用的药物置于微泡内，在靶器官局部释放可达到 保护药物、延缓药物的释放、减少给药次数、减小剂量和增加疗效的目的。尽管超声介导靶向载药微泡兼具安全、高效、可控性强等优点，初步显示了广阔的 应用前景，但传统的超声介导靶向载药微泡靶向性不强，为增强其靶向性，需要对其进行进 一步的改造。
謝_立为徽猜，且1，}二_謝煺首甘_-奸鄰謝划旦碱与徽猜的麗比为^ 料。优选的，还包括亲和素，所述靶向多肽连有生物素，靶向多肽通过生物素-亲和 素-生物素桥与1，2- 二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000-生物素 连接。优选的，还包括链霉亲和素，所述靶向多肽连有生物素，靶向多肽通过生物素-链 霉亲和素-生物素桥与1，2" 二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000-生 物素连接。优选的，靶向载药超声微泡的粒径为0. 5 8 μ m。优选的，生物惰性气体为全氟丙烷、全氟丁烷和六氟化硫中的至少一种。优选的，脂质双分子层外壳为磷脂或磷脂类衍生物。优选的，磷脂或磷脂类衍生物为1，2- 二棕榈酰基-sn-甘油基_3_磷脂酸甘油 基-钠盐、1，2- 二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸-钠盐和1，2- 二棕榈酰基-sn-甘油 基-3-磷脂酰胆碱中的至少一种。优选的，药物颗粒为多烯紫杉醇、阿霉素、喜树碱、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、氨甲蝶 呤、消炎痛、普洛比普洛芬、酮基布洛芬、炎痛喜康及双氯酚酸中的至少一种，或者药物颗粒 为用于治疗乳腺癌的活性蛋白、多肽、疫苗或基因。为了增加载药超声微泡的靶向性，在脂质双分子层外壳外连接含有肿瘤靶向肽序 列的多肽或蛋白衍生物，得到的靶向载药超声微泡可以靶向肿瘤的淋巴管及其肿瘤细胞， 再通过高频超声成像可以对肿瘤的发生、发展及疗效进行实时检测和诊断，也可通过低频 超声击碎微泡释放药物颗粒，达到可控地靶向释放药物的目的，从而对肿瘤的预防、诊断及 治疗均有着极其重要的意义。此外，还有必要提供一种靶向性较好的靶向载药超声微泡的制备方法。一种靶向载药超声微泡的制备方法，包括如下步骤步骤一按质量份数配比紫杉醇7/4 3份、1，2- 二硬脂酰基-sn-甘油基_3_磷 脂酰胆碱7份，1，2- 二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000 0. 5份，1， 2- 二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000-生物素0. 5份，溶于溶剂中 制备药物磷脂混悬液；步骤二 将药物磷脂混悬液混勻，在干燥的队流作用下除去溶剂使磷脂在容器壁 上形成一层均勻的薄膜，真空干燥1 3小时；步骤三在含有干燥磷脂薄膜的容器中加入经脱气处理的pH = 7. 4的Tris缓冲 溶液，得制备载药磷脂溶液，Tris缓冲溶液中包括10%体积的甘油和10%体积的丙二醇；步骤四加热载药磷脂溶液到相转变温度以上，水浴超声震荡使磷脂溶液分散彻 底直至透明；步骤五将透明的载药磷脂溶液分装置西林瓶中，并将西林瓶中的空气置换成生 物惰性气体，震荡30 60秒制备载药超声微泡；步骤六离心漂浮法清洗载药超声微泡3 4次，以除去未形成微泡的磷脂；步骤七在清洗过的载药超声微泡中加入亲和素，轻轻摇动室温下孵育15分钟后 用离心漂浮法清洗3-4次，除去未耦合的亲和素；步骤八向步骤七得到的载药超声微泡中加入生物素化的靶向多肽，轻轻摇动并 室温下孵育10分钟以上，用离心漂浮法清洗3 4次除去未结合的生物素化的靶向多肽， 得到靶向载药超声微泡。优选的，步骤四中，震荡频率为4000 5000次/分钟，震荡幅度为10 40毫米， 震荡时间为30 90秒。 该制备方法原理简单，操作简便，对设备要求低，可以广泛推广应用。图1为一实施例的靶向载药超声微泡模式图；图2为结合了靶向多肽的靶向载药超声微泡荧光图；图3A为非靶向载药超声微泡与乳腺癌MDA-MB-231细胞结合示意图；图;3B为靶向载药超声微泡与乳腺MDA-MB-231细胞特异性结合的电镜图；图4为加有靶向载药超声微泡和非靶向载药超声微泡的乳腺癌MDA-MB-231细胞 显像对比图；图5为靶向载药超声微泡在超声条件下对乳腺癌MDA-MB-231细胞的杀伤活性示 意图。
1，2- 二硬脂酰基-sn-甘油基_3_磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000 (DSPC-PEG) :0. 5份1，2- 二硬脂酰基-sn-甘油基_3_磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000-生物素 (DSPC-PEG-Biotin) :0.5 份紫杉醇7/4 3份。靶向多肽LyP-I通过生物素-亲和素-生物素桥与1，2_ 二硬脂酰基-sn-甘油 基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000-生物素连接。本实施例的靶向载药超声微泡的粒径可以控制在0. 5 8 μ m之间。该靶向载药超声微泡的制备过程，可按如下步骤进行步骤Sl 按质量份数配比紫杉醇7/4 3份、1，2- 二硬脂酰基-sn-甘油基_3_磷 脂酰胆碱7份，1,2- 二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000 0. 5份， 1,2- 二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱-聚乙烯二醇2000-生物素0. 5份，溶于5mL 三氯甲烷中，制备药物磷脂混悬液；步骤S2 在涡旋混合器上将药物磷脂混悬液混勻，在干燥的队流作用下除去三氯 甲烷使磷脂在容器壁上形成一层均勻的薄膜，真空干燥1 3小时；步骤S3 在含有干燥磷脂薄膜的容器中加入经脱气处理的pH = 7. 4的Tris缓冲 溶液，得制备载药磷脂溶液，Tris缓冲溶液中包括10%体积的甘油和10%体积的丙二醇；步骤S4 加热载药磷脂溶液到相转变温度(55 60°C )以上，水浴超声震荡使牛 奶状的磷脂溶液分散彻底直至透明，其中震荡频率为4000 5000次/分钟，震荡幅度为 10 40毫米，震荡时间为30 90秒；步骤S5 将透明的载药磷脂溶液每毫升一装入2mL西林瓶中，并将西林瓶中的空 气置换成全氟丙烷，机械震荡30 60秒制备载药超声微泡；步骤S6 用PBS缓冲液离心漂浮法清洗载药超声微泡3 4次，以除去未形成微 泡的磷脂；步骤S7 在清洗过的载药超声微泡中加入亲和素，轻轻摇动室温下孵育15分钟后 用离心漂浮法清洗3-4次，除去未耦合的亲和素；步骤S8 向步骤S7得到的载药超声微泡中加入生物素化的靶向多肽(生物 素-LyP-I)，轻轻摇动并室温下孵育10分钟以上，用离心漂浮法清洗3 4次除去未结合的 生物素化的靶向多肽，得到靶向载药超声微泡。以下为对制得的靶向载药超声微泡性能的检测、研究部分(1)验证LyP-I多肽与载药超声微泡的成功藕连用异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC)对生物素 _LyP_l 多 肽进行荧光标记，并将标记后的生物素-LyP-I多肽与连接有亲和素的载药超声微泡孵育， PBS离心漂浮法洗涤3次后，置于荧光显微镜下观察，结果如图2所示，图中能够成功检测到 绿色荧光，证明LyP-I多肽与载药超声微泡成功藕连，制得LyP-I靶向载药超声微泡。(2)优化靶向载药超声微泡的药物包封率分别加入0. 75，1. 5,3,4. 5mg的紫杉醇药物，制备获得携载不同浓度紫杉醇的 LyP-I靶向超声微泡，通过粒径/浓度分析仪测定各组微泡的粒径分布和形成微泡的浓度， 再通过三氯甲烷裂解等量的载药超声微泡，用紫外分光光度计分析测定各组所含紫杉醇的 药物含量，得出最佳的载药超声微泡参数。结果如表1所示
表

本发明涉及一种靶向载药超声微泡，包括脂质双分子层外壳、固定在脂质双分子层外壳外侧的靶向多肽、包裹在脂质双分子层外壳内部的生物惰性气体、以及分散于脂质双分子层外壳中的药物颗粒，靶向多肽为包含氨基酸序列CGNKRTRGC的多肽或蛋白衍生物。通过在脂质双分子层外壳外连接含有肿瘤靶向肽序列的多肽或蛋白衍生物，得到的靶向载药超声微泡可以靶向肿瘤的淋巴管及其肿瘤细胞，再通过高频超声成像可以对肿瘤的发生、发展及疗效进行实时检测和诊断，也可通过低频超声击碎微泡释放药物颗粒，达到可控地靶向释放药物的目的，从而对肿瘤的预防、诊断及治疗均有着极其重要的意义。此外，本发明还涉及一种靶向载药超声微泡的制备方法。