专利名称：靶向vegf和/或hif途径、用于治疗中耳炎的化合物如索拉非尼或瓦他拉尼的制作方法中耳炎(0M)，一种中耳(ME)的炎症，是儿童中听力损伤的最常见的原因，潜在地引起语言延缓、学习和行为破坏。婴儿和儿童中的急性OM (AOM)最经常地与涉及肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)和粘膜炎莫拉菌(Moraxellacatarrhal is)的细菌感染相关。约40%的儿童在AOM后I个月具有ME积液，到AOM后3 个月，仅约10%的仍有ME积液。这种没有感染症状的持续渗出性OM被称为渗出性中耳炎(OME)0 OME在1-3岁儿童中是非常常见的，发病率为10-30%，到四岁的累积发生率为80%。患有OME的某些儿童接着发生慢性0M，伴有并发症例如鼓膜内陷囊袋、听骨链的侵蚀、胆脂瘤、慢性化脓性OM或耳漏(鼓膜穿孔和排脓)。这种疾病的高流行性以及其复发性和慢性特征是在受影响儿童中进行大量鼓膜造孔术(在鼓膜中插入通气管道或‘孔眼’)的原因。OM仍然是发展中国家的儿童中手术的最常见原因。鼓膜置管术是英国最常见的手术(每年30，000例)。在临床试验中，减充血剂、粘液溶解剂、类固醇、抗组胺剂以及抗生素被认为很大程度上是无效的(Lous et al (2005) Cochrane Database Syst. Rev. CD001801 )。因而对OM和OME存在着新的医学治疗的临床需求。附图I. Junbo 小鼠中耳的缺氧。比例尺A, B, C=50 μ m ；D=100 μ m, G=20 μ m ；F=IOO μ m。(A)Jbo/+小鼠用60mg/kg哌莫硝唑(PIMO)体内标记3h,箭头指示[ep]上皮、[f]结缔组织纤维细胞、[ τιφ]巨噬细胞；[tm]颞下颌骨、[m]增厚的发炎的粘膜中的缺氧、[ex]渗出液含有泡沫状巨噬细胞(πιΦ)和多形核细胞(PMN)的混合物。利用抗-PIMO抗体的免疫组织化学。注意*裂隙是通过组织处理人工产生的。(B) PIMO标记的WT小鼠，正常的薄粘膜[m]没有被染色。(C)未标记的患有OM的Jbo/+小鼠是抗-PMO抗体的阴性对照。(D)泡沫状ι Φ中的缺氧。(E)Jbo/+小鼠中标记PMO的时间过程。该指数对以下类别的每一个中的阳性标记细胞进行评分管腔、粘膜上皮以及粘膜结缔组织内的炎性细胞。柱形图的柱条是平均值土 SEM。4 周组大小 η = 8，7-8 周组 η = 10，13-15 周组 η = 5，31-37 周组 η = 7。(F)WT小鼠中的咽鼓管上皮[et]中的缺氧清晰地区分于邻近的鼻咽[np]上皮。(G)Jbo/+小鼠的耳渗出液细胞学用大鼠抗小鼠F4/80 mAb和PMN染色的泡沫状ηιφ。附图2. Jbo/+耳液体的FACS分析。对于PMO (缺氧)，来自哌莫硝唑标记的Jbo/+小鼠的中耳WBC用Ly6G和Ly6C(PMN标志物)染色、以及用膜联蛋白V (Annexin V)(细胞凋亡标志物)染色。PMN群体用Ly6G和Ly6C信号来门选。群体(I)含氧量正常的活的PMN，(2)缺氧的活的PMN，(3)缺氧的凋亡的PMN。以IoglO荧光轴校准。附图3. Jbo/+小鼠中Hif-I α白勺Western印迹。泳道I Jbo/+ 骨髓 PMN。泳道2 Jbo/+中耳WBC显示Hif-I α阳性条带。实验独立地进行三次，得到相同的结果。附图4. Jbo/+小鼠的中耳的基因表达。Jbo/+中耳WBC的4周和10周合并样品的 实时定量PCR，相对于4周Jbo/+血液WBC的来显示。柱形图的柱条是三次重复测试的平均的倍数增加(或Vegfa和Eviln= 10)。误差线是相对定量(RO)最小和最大值，代表了 Λ循环阈值的SEM。附图5.用ΡΤΚ787/ΖΚ 222584治疗Jbo/+小鼠降低了中耳内的炎性改变。用50mg/kg或75 mg/kg的药物治疗WT和Jbo/+小鼠4周，假治疗的对照Jbo/+组接受单独的载体。在50 mg/kg试验(a)中发炎的粘膜是更薄的。与相应的假治疗对照相比，在两种试验中，药物治疗的组具有更少的血液(b)和淋巴管(c);与对照相比，在75mg/kg治疗的Jbo/+小鼠中粘膜淋巴管是较少膨胀的。在50mg/kg试验中，WT组大小是n=8 Jbo/+药物组n=15 ；Jbo/+假治疗组n=13。在75mg/kg试验中，WT组n=8 ；Jbo/+药物组n=15 ; Jbo/+假治疗组n=15。柱形图柱条是平均值土s. e. m。双尾Studentt-检验。附图6.用VEGF受体抑制剂和HSP90抑制剂17-DMAG治疗Junbo小鼠减缓听力损失。(A)在用BAY 43-9006的15天治疗中，按照分贝(dB)的听觉脑干反应(Λ ABR)的改变(WT组、假治疗组、药物组分别为η=5、11、11);(Β)用SU-11248治疗28天的AABR (WT组、假治疗组、药物组n=10、15、15) ;(C)用ΡΤΚ787治疗21天的AABR (WT组、假治疗组、药物组 n=9、13、15) ;(D)用 PTK787 治疗 28 天的 AABR (WT 组 n=40，假治疗组 n=60，PTK787 组n=30) ； (E)用 17-DMAG 治疗 28 天的 AABR (WT 组 n=9,假治疗组 n=15,17-DMAG 组 n=15)。在每个试验中，对药物治疗的反应与假治疗对照相比较。直方图柱条是平均值土SEM。单尾Mann Whitney U 检验。
利用慢性OM的小鼠模型，本发明人展现了处于OM中的发炎的中耳是低氧的环境，且存在着缺氧诱发因子(HIF)的诱导。他们还显示了血管内皮生长因子(VEGF)受体以及HIF的抑制剂能够降低这样的小鼠模型中的听力损失和中耳粘膜的炎性改变。靶向HIF-VEGF信号途径提供了预防和/或治疗OM的吸引人的治疗选择。因而，在第一个方面中，本发明提供了靶向VEGF和/或HIF途径、用于治疗和/或预防受试者的中耳炎的化合物。在本发明的这个方面的第一个实施方式中，所述化合物靶向VEGF和VEGFR (血管内皮生长因子受体)之间的相互作用。在这个实施方式中，所述化合物可以是VEGF受体抑制剂，例如，瓦他拉尼(vatalanib)、舒尼替尼(sunitinib)或索拉非尼(sorafenib)。
或者，所述化合物可以是抗VEGF抗体或抗VEGF肽。在本发明的这个方面的第二个实施方式中，所述化合物抑制HIF途径。在这个实施方式中，所述化合物可以通过使HIF不稳定来起作用。例如，所述化合物可以抑制HIF蛋白侣伴HSP90。这样的化合物的一个实例是17-DMAG。在第二个方面中，本发明提供了用于治疗和/或预防受试者的中耳炎的药物组合物，其包含根据本发明的第一个方面的化合物。本发明的进一步的方面涉及(i)根据本发明的第一个方面的化合物在制备用于治疗和/或预防中耳炎的药物组合物中的用途；以及(ii) 一种治疗和/或预防受试者的中耳炎(OM)的方法，其包括向所述受试者给药 根据本发明的第一个方面的化合物、根据本发明的第二个方面的药物组合物、或根据本发明的第三个方面的试剂盒的步骤。发明详述中耳炎(OM)中耳炎是中耳的炎症，或中耳感染。中耳炎存在于耳鼓和内耳之间的区域中，包括称为咽鼓管的管道。急性中耳炎(AOM)大部分纯粹是病毒引起的或自限性的，它通常伴随着病毒性URI (上呼吸道感染)。存在着耳的充血以及可能的轻微不适和爆音(poping)，但是该症状与潜在的URI—起解决。如果通常为无菌的中耳被细菌污染，可能引起中耳内的脓和压力，这被称为急性细菌性中耳炎。病毒性急性中耳炎有时可能在非常短时间内引起细菌性中耳炎，特别是在儿童中。细菌性病例可能引起耳鼓的穿孔、乳头状间隙的感染(乳突炎)，在非常罕见的情况下进一步扩散导致脑膜炎。作为改变的咽鼓管功能产生的负压的结果，渗出性中耳炎(OME)仅是中耳间隙内产生的液体的集合。这可以仅来自病毒性URI，而没有疼痛或细菌感染，或它可能先于或继发于急性细菌性中耳炎。中耳内的液体有时引起传导性听力损伤，但是仅在它影响声波引起的鼓膜正常振动时。在数周到数月间，中耳液体可能变得非常浓稠和胶液样(因而称为胶耳)，这提高了引起传导性听力损伤的可能性。在此使用的术语“中耳炎”涉及所有形式的慢性0M，包括0ΜΕ，以及由微生物感染引起的复发的急性0M，与作为病毒感染的结果引起的急性OM相对应。慢性化脓性中耳炎涉及鼓膜中的穿孔(孔洞)和中耳间隙内的活性细菌感染持续几周或更久。可能有足够的脓液，其被导向耳的外侧(耳漏)，或者脓液可能小到仅在使用双目显微镜检查时可见。这种疾病在咽鼓管功能不良的人中更为常见得多。听力损伤经常伴随着这种疾病。当中耳被细菌急性感染时，耳鼓后的压力增大。在严重的或未治疗的病例中，鼓膜可能破裂，容许中耳间隙内的脓液流入耳道。在另一健康人的急性中耳炎的简单病例中，身体的防御很可能解决感染，耳鼓几乎总是痊愈。然而，在某些情况下，来自中耳的排脓可能变为慢性状况。只要有活动的中耳感染，鼓膜将不会痊愈。肺炎链球菌和不可分型的(nontypable)流感嗜血杆菌是中耳炎的最常见的细菌性病因。导管功能障碍引起失效的中耳细菌清除。中耳炎通常与适当的病史一同通过鼓膜的目测来诊断。
本发明使用的术语“中耳炎”主要涉及慢性0M，与作为病毒感染的结果的急性OM相对应。该术语可以排除作为呼吸道合胞体病毒(RSV)感染的结果产生的0M。VEGF/HIF 途径哺乳动物VEGF配体是40kDa的糖蛋白，其作为几种不同的剪接变体和加工形式存在，包括 VEGF-A、-B、-C、-D 和-E。VEGF配体以重叠的方式与三种受体酪氨酸激酶(RTKs) VEGFR-I、VEGFR-2和VEGFR-3 结合。VEGF与它们的受体的结合引起VEGFR同二聚体和异二聚体的形成。二聚作用活化VEGFR,引起细胞内酪氨酸残基的自磷酸化。术语“VEGF途径”包括靶向VEGF基因或蛋白质表达的上游调节物；或VEGF蛋白 表达的下游效应，例如，促进血管生成、白细胞募集的血管渗透性的信号转导途径。术语“HIF途径”包括靶向HIF-I α表达或活性。HIF信号转导途径是VEGFR的上游。Duval 等人((2007) Mol. Biol, of the Cell 18 :4659-4668)报道了 VEGFR2 的另一种相关的HSP90联系通过客户蛋白质(client protein)VEGFR2的HSP90酪氨酸磷酸化是VEGFR2向内皮一氧化氮合成酶信号转导所需的。VEGF/VEGFR 抑制剂靶向VEGF/VEGFR的抑制剂可以是生物大分子，例如，肽、抗体，或DNA或RNA寡核苷酸，或它可以是小分子抑制剂。存在着几种VEGF家族成员，它们的表位保守性差，可能优选的是靶向VEGF受体而不是靶向配体本身。抗VEGF抗体是已知的，例如，VEGF特异性人源化单克隆抗体贝伐单抗 (bevacizumab )。贝伐单抗 直接通过阻止VEGF与VEGFR-I和-2的相互作用来抑制VEGF的生物学活性。雷珠单抗 (Ranibizumab )是另一种抗VEGF人源化单克隆抗体片段，其结合并抑制VEGF-A。HuMV833 是另一种抗VEGF-A抗体，当前处于临床试验中。抗VEGFR-2抗体包括DC-101和小鼠/人嵌合单克隆抗体MC-IC11，以及完全人抗-VEGFR 抗体 MC-2C6 和 MC-1121。适体是为它们以高亲和性和高特异性结合蛋白质的能力而选择的RNA或DNA寡核苷酸。哌加他尼 (Pegaptanib )是一种抗VEGF RNA适体。或者，该抑制剂可以是靶向VEGF/VEGFR途径的核酶。Angiozyme特异性地裂解VEGFR-1RNA，它是作为用于人类疾病的治疗剂被测试的第一个合成的核酶。靶向VEGF/VEGFR相互作用的另一种方法涉及使用包含VEGF结合位点的可溶性受体来隔离(sequestrate) VEGF和阻断VEGF信号传递，例如VEGF-Trap 。还可能的是使用VEGF剪接变体来调节VEGFR的活性。用于本发明的VEGFR抑制剂可以选自索拉非尼、舒尼替尼、瓦他拉尼、凡德他尼(vandetanib)、AZD-2171、SU-6668、CP-547632、帕唑帕尼(pazopanib)、BIBF-1120、阿西替尼、AMG-706、AEE-788、EXEL-0999、EXEL-7647、XL-880、EXEL-2880、SU-14813、ZK-304709、E-7080、CHIR-265、CHIR-258、0SI-930、BAY-579352, ABT-869、BMS-582664、KRN-951 和CEP-7055。
这样的小分子抑制剂的进一步的细节可以在Kiselyov et al ((2007) ExpertOpin. Invest. Drugs (2007) 16 (I) :83-107)中找到。VEGF抑制剂可以是苯胺酞嗪(anilinophthalazine)型的，例如，瓦他拉尼；或是脲型的，例如索拉非尼。VEGF抑制剂可以是索拉非尼、舒尼替尼或瓦他拉尼。HIF途径抑制剂许多小分子HIF-I抑制剂是已知的，包括以下四种化合物，其共有相同的噻吩嚅二唑核心(在方框中标出)


本发明提供了靶向VEGF和/或HIF途径、用于治疗和/或预防受试者的中耳炎的化合物。本发明还提供了包含这样的化合物的药物组合物，以及治疗和/或预防受试者的中耳炎的方法，其包括向所述受试者给药这样的化合物或药物组合物的步骤。