专利名称：用于纳米颗粒介导的癌细胞靶向递送的方法和组合物的制作方法 抗癌症治疗的效力取决于降低或消除癌细胞而不破坏健康组织的能力。因此，优先靶向癌细胞的策略对于癌症治疗的成功是基本的。现已研究了基于纳米颗粒的系统以增强治疗剂向癌细胞的递送。虽然新的进展改进了药物递送效率，但对于获得癌细胞特异性递送 仍是很大的挑战。有一种癌细胞现象称为Warburg效应，该现象确定癌细胞的一种被充分表征的趋势，即，癌细胞极其需要将葡萄糖输送入细胞以为恶性肿瘤特征性的逃避代谢活性(run-away metabolic activity)提供燃料。Warburg效应最熟悉的用途在于正电子发射断层照相术(PET)，借此，放射性核素连接于葡萄糖分子并给予患者。恶性细胞摄入大量葡萄糖-放射性核素中间体，后者被内在化进入细胞，或者至少附着于肿瘤细胞。放射性核素发出的辐射导致肿瘤位置处光子的释放，这进而由PET(光子)检测仪器检测到。因此，PET扫描是检测癌症的非常精确和特异性的方法。本发明利用Warburg效应以经由纳米颗粒将活性剂直接地和选择性地祀向癌细胞、递送治疗剂(例如，药物、核酸、蛋白质/多肽)和/或放置可检测标记物以供诊断，从而克服了本领域的已有缺陷。在其它方面，肿瘤抑制剂p53是一种转录因子，它作为四聚体主要结合宿主基因启动子内的P53反应元件，其产物参与控制对维持基因组稳定性和稳态至关重要的生长停滞、凋亡、衰老、分化和DNA修复等细胞事件[1、2]。p53被各种应激信号激活，包括原癌基因激活和DNA破坏，现已证明翻译后修饰是p53激活的主要机制，其导致p53蛋白丰度和转录活性增加[I、2]。由于其生长抑制活性，在正常生理条件下，野生型p53的水平通常保持较低，这主要通过调控P53蛋白稳定性来介导。虽然有报道说涉及许多调节剂，但MDM2对于控制p53更新起主要作用。MDM2是靶向p53以进行遍在蛋白化和随后降解的E3遍在蛋白连接酶，但同时也是P53的转录靶标，从而产生负调节环路。各种应激信号均影响该调控环路，从而影响P53活性[1、2]。与野生型p53相反，突变型p53蛋白通常在癌细胞中以高水平累积，这归因于突变体P53不能诱导MDM2表达。实际上，利用突变型p53敲入小鼠的遗传学研究证明突变型P53蛋白水平主要由MDM2调节[3]。p53通过直接影响基因座的突变或通过偏离其正常调控而经由在癌细胞中的普遍灭活来支持其作为肿瘤抑制剂的关键作用[1，2]。几乎在所有类型的人癌症中鉴定到各种频率的突变，从约10% (例如，造血恶性肿瘤[4])到50-70% (例如，卵巢癌[5]、结肠直肠癌[6]和头脖癌[7])。大量证据表明，虽然野生型p53使得癌细胞对化疗和放疗敏感，但癌细胞中的突变型P53导致治疗耐受性和预后不良。突变型p53的表达和癌症治疗耐受性之间的相关性已经广泛报道。例如，已在卵巢癌患者中观察到对顺钼的耐受性。有突变型p53存在下，结肠直肠癌也被证明化学敏感性较低[9]。类似地，p53灭活使得血液恶性肿瘤耐受抗肿瘤药物[10]。突变是独特的，因为大多数改变是导致合成全长蛋白质的错义突变[11]。虽然，大多数突变在核DNA-结合域(DBD)内发现，从而导致序列特异性DNA结合活性丧失，但仍有高度的结构、生物化学和生物学不统一性。按照对P53蛋白的热力学稳定性的影响，大多数PM突变可分成两个主要的类[12]，通常称为“DNA-接触”突变和“构象”突 变。DNA-接触类包括直接参与DNA结合的残基的突变，例如R248Q和R273H。构象单克隆抗体探测到该类具有野生型构象，且不结合分子伴侣hsp70 [13，14]。构象类包含导致局部(例如，R249S和G245S)或整体(例如，R175H和R282W)构象变形的突变，所述变形导致蛋白质集中结合到hsp70。与DNA接触突变相比，构象突变涉及更严重的体外表型[13]。P53突变的不统一性还体现在所得残基的性质上。突变型R273H具有野生型构象，而突变型R273P是变性的[13]。除丧失肿瘤抑制功能外，与野生型P53相比，突变型p53通过突变型和野生型p53之间的异源-寡聚获得负显性活性(dominant-negative activity),这是p53灭活的非常有效的机制，因为四聚体中只有I分子的突变型P53能显著损害DNA结合[1，2]。此外，研究显示突变型P53可获得独立于野生型p53的新致癌活性[15，17]。虽然p53的功能获得特性的统一机理尚未阐明，但人们提出了许多模型。突变型P53已显示通过它们的DNA结合域与P63和p73相互作用。该相互作用导致p73和p63功能的灭活[18-21]。表达普通P53突变体(R248W和R273H)的敲入小鼠的遗传学研究显示，这些突变体通过ATM (对于DNA损伤反应至关重要的蛋白激酶)的灭活获得致癌特性[22]。整体上，可获得的信息表明突变型P53通过功能丧失、负显性活性和功能获得活性的组合导致肿瘤发生和治疗耐受性。人们已做出许多努力来开发能再激活突变型P53的小分子。然而，由癌细胞中超过2000种不同类型的突变型p53蛋白反映出突变型p53的结构不统一性[23]，给开发通用的P53-再激活剂提出严峻的挑战。一种替代的方法是通过基因治疗将野生型p53重新导回肿瘤细胞。基于复制缺陷型病毒的载体已在头脖癌中显示一些治疗作用；然而，肿瘤细胞中高水平的突变型P53蛋白是恢复功能p53的主要障碍。本发明通过提供P53衍生物来克服本领域的已有缺陷，所述P53衍生物不结合到突变型p53，因此能在高水平p53突变体存在下有效恢复P53功能。发明概述 在一个方面，本发明提供选自下组的纳米颗粒 A)包含以下成分的纳米颗粒 a)聚阳离子/聚亚烷基二醇/葡萄糖偶联物；和 b)活性剂； B)包含以下成分的纳米颗粒 a)包含活性剂的核心；和 b)围绕(a)的核心的葡萄糖/聚亚烷基二醇偶联物；C)包含以下成分的纳米颗粒
a)包含聚阳离子和活性剂的核心；和
b)围绕(a)的核心的葡萄糖/聚亚烷基二醇偶联物；
D)包含以下成分的纳米颗粒
a)聚阳离子/藻酸盐/葡萄糖偶联物；和
b)活性剂；
E)包含以下成分的纳米颗粒
a)包含活性剂的核心；和 b)围绕(a)的核心的葡萄糖/藻酸盐偶联物；
F)包含以下成分的纳米颗粒
a)包含聚阳离子和活性剂的核心；和
b)围绕(a)的核心的葡萄糖/藻酸盐偶联物；和
G)以上(A)-(F)的纳米颗粒的任何组合。在本发明的纳米颗粒中，所述活性剂可以是多核苷酸、寡核苷酸、干扰RNA、蛋白质、多肽、化疗药物、细胞毒剂、放射性核素、可检测标记物、显像剂、和它们的任何组合。在本发明的一个
中，提供纳米颗粒，所述纳米颗粒包含a)包含聚乙烯亚胺(PEI)和编码p53的多核苷酸的核心；和幻围绕(a)的核心的葡萄糖/聚乙二醇(PEG)偶联物。在另一个实施方式中，本发明提供纳米颗粒，所述纳米颗粒包含a)包含聚乙烯亚胺(PEI)和多核苷酸的核心，所述多核苷酸编码包含P730D的p53嵌合体(例如，p53/P730D);和幻围绕(a)的核心的葡萄糖/聚乙二醇(PEG)偶联物。此外，本文提供在药学上可接受的载体中包含P53嵌合体的组合物，所述嵌合体包含p730D。而且，本发明提供将纳米颗粒递送至细胞的方法，包括在一定条件下使细胞与本发明的纳米颗粒接触，借此，纳米颗粒结合到细胞表面的葡萄糖转运蛋白(glucosetransporter)并由细胞内在化，所述细胞可以是在体内或在体外。此外，本文提供将活性剂递送至对象(例如，有需要的对象)中肿瘤细胞的方法，包括将本发明的纳米颗粒递送至所述对象，借此，所述纳米颗粒结合到肿瘤细胞表面的葡萄糖转运蛋白并由肿瘤细胞内在化，从而将活性剂递送至肿瘤细胞。在其它实施方式中，本发明提供减小对象(例如，有需要的对象)中肿瘤大小的方法，包括将有效量的本发明的纳米颗粒递送至对象，借此，纳米颗粒结合到肿瘤细胞表面的葡萄糖转运蛋白并由细胞内在化，从而减小对象中肿瘤的大小。本发明还提供治疗对象(例如，有需要的对象)中癌症的方法，包括将有效量的本发明的纳米颗粒递送至对象，从而治疗所述对象中的癌症。而且，本发明提供将包含p730D的p53嵌合体递送至细胞(例如，癌细胞或肿瘤细胞)的方法，包括在一定条件下使细胞与本发明的P53嵌合体接触，借此，p53嵌合体由细胞内在化，所述细胞可以是在体内或在体外。在其它实施方式中，本发明提供减小对象(例如，有需要的对象)中肿瘤大小的方法，包括将有效量的本发明的P53嵌合体递送至对象，借此，嵌合体由肿瘤的细胞内在化，从而减小所述对象中肿瘤的大小。
本发明还提供治疗对象(例如，有需要的对象)中癌症的方法，包括将有效量的本发明的P53嵌合体递送至所述对象，从而治疗所述对象中的癌症。本发明的其它实施方式包括在有需要的对象中诱导肿瘤消退的方法，包括将有效量的本发明的P53嵌合体递送至对象，从而诱导对象中的肿瘤消退。本文所述的方法还可包括以下步骤给予对象蛋白激酶抑制剂、组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂、甲基转移酶抑制剂和它们的任何组合。上述方法还可包括以下步骤给予对象化疗剂、抗-血管生成剂、放疗、外科治疗或它们的任何组合。该其它步骤可在将纳米颗粒和/或P53嵌合体递送至所述对象的之前、之后和/或同时进行。本发明的其它方面包括在药学上可接受的载体中包含本发明的纳米颗粒的组合物，以及包含本发明的纳米颗粒和/或本发明的组合物的试剂盒。
本文还提供诊断对象中癌症的体外方法，包括a)使本发明的纳米颗粒与对象的细胞接触，其中所述纳米颗粒包含可检测标记物；b)检测纳米颗粒内在化进入对象的细胞的速度和/或量和/或特异性；和c)比较纳米颗粒内在化进入对象的细胞的速度和/或量和/或特异性与纳米颗粒内在化进入对照对象的细胞和/或被诊断对象的对照细胞的速度和/或量和/或特异性，与对照对象的细胞和/或对照细胞相比，根据纳米颗粒内在化进入对象的细胞的量和/或速度和/或特异性的提高或改变来诊断所述对象中的癌症。而且，本发明提供诊断对象中癌症的体内方法，包括a)将权利要求1-6中任一项所述的纳米颗粒递送至对象，其中所述纳米颗粒包含显像剂；b)检测所述对象中来自显像剂的信号；和c)比较对象中来自显像剂的信号与对照对象中和/或来自被诊断对象的对照组织/细胞中来自同一显像剂的信号，与来自对照对象和/或对照组织/细胞的信号相比，根据来自所述对象的信号的改变来诊断所述对象中的癌症。附图简述
图I. GLU-PEG-PEI质粒复合物的合成。图2A-C. A.编码绿色荧光蛋白(GFP)的质粒在两种细胞系，乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)和非转化人乳腺上皮细胞系(MCF-10A)中的差异表达。B.与非转化前列腺上皮细胞系(RWPE)相比，纳米颗粒在前列腺癌细胞系(PC3)中的优先靶向。C.编码@半乳糖苷酶(P_gal)的质粒在两种癌细胞系和两种未转化细胞系中的差异表达。图3A-B. A.证明GLU-PEG-PEI-介导的核酸递送是葡萄糖转运蛋白依赖性的竞争分析。B.纳米颗粒-核酸复合物通过内吞作用介导的内在化进入细胞。图4A-B. A.携带肿瘤的小鼠(肿瘤体积约100 mm3)静脉内注射与纳米颗粒形成复合物的肿瘤抑制基因(PTEN, 20或40 ii g)质粒(50 U I总体积)。14天后处死小鼠，收集肿瘤。B.用Ki-67(—种增殖标记物)使肿瘤组织切片染色。显示了 Ki-67染色的代表性图像和肿瘤体积。PTEN磷酸酶和张力蛋白(tensin)同源物的序列提供于GenBank 数据库登录号NM_000314. 4. (Li等人.“PTEN-—种在人脑癌、乳腺癌和前列腺癌中突变的推定蛋白酪氨酸憐酸酶基因”(PTEN, a putative protein tyrosine phosphatase gene mutatedin human brain, breast, and prostate cancer) Science 275(5308):1943-1947(1997))。图5A-B. P53/730D而非野生型p53抑制突变型p53表达细胞的生长。用编码对照载体的 PCNDA3 载体(1.0 yg)、野生型 p53 (1.0 y g)、p53/p730D (0. 5 y g)或p53(R175H)/p730D (1.0 U g)转染MDA-MB-231细胞。用嘌呤霉素选择后，对细胞进行集落形成试验。数据是来自三次独立实验的平均值土 SE (A)0用选择后48小时时收集的细胞进行Western分析，利用所示抗体进行探测(B)。抗-Myc印迹显示外源性p53的水平，抗_p53印迹反映出内源性突变型p53和外源性p53的组合的水平。图6. MCF-10A细胞对中等水平的p53/p730D表达的敏感性较低。以MDA-MB-231细胞为对照，用所示载体(0.5 Ug)转染MCF-10A细胞，并如图5所示进行集落形式试验。平行进行蛋白质印迹来测定p53/p730D表达水平。图7A-C. p53/p730D表达导致在MDA-MB-231细胞中的差异应答。A.使用所示抗体对如图6中的细胞进行蛋白质印迹分析。表达P53/p730D的MDA-MB-231或MCF-10A细胞或者是模拟的或用4 Gy照射。照射后6小时收集细胞以供蛋白质印迹分析(B)或在24小时时收集以供FACS分析(C)。结果是来自三次独立实验的平均值土 SE。图8A-C. GIu-PEG-PEI纳米颗粒特异性靶向恶性细胞以便递送基因。将MCF-10A/ MDA-MB-231 (a)或 RWPE/PC3 (B)细胞与 Glu-PEG-PEI/lacZ DNA 复合物温育。细胞固定24小时，用X-gal 试剂染色。C.培养基中包含50 mM葡萄糖以便与GLU_PEG-PEI_P-gal摄取竞争。显示的是代表性图像。图9. GLU-ALG降低PEI的细胞毒性。使用图5所述方法，通过集落存活试验评估PEI 升高的浓度(0、0. 05,0. 1,0. 25,0. 5、I. 0,2. 5 或 5. 0 u g/ml)对 MDA-MB-231 细胞成活力的影响。通过混合 I U g/ml 的 PEI 与 0. 05、0. 1、0. 25、0. 5、1. 0、2. 5 或 5. 0 y g/ml 的GLU-ALG来检测GLU-ALG的作用。

图10. GLU-ALG-PEI介导的LacZ表达质粒的肿瘤特异性递送。将乳腺癌细胞系MDA-MB-231 (5百万个细胞)移植入裸鼠(4_6周龄)的肋部，让肿瘤发展两周。一旦肿瘤体积达到约200 mm,使小鼠饥饿过夜。第二天上午，将LacZ表达质粒与PEI混合、随后和葡萄糖-藻酸混合并通过静脉内注射。注射后48小时处死小鼠。收集不同组织样品，包括心脏、肺、脾脏、肝脏、肾脏和肿瘤样品。制备组织切片并用P-Gal染色。显示了各组织的代表性图像。图11.通过表达p53/p730D在MDA-MB-231细胞中诱导Pgl3-GFp。稳定表达Pgl3-GFp 的 MDA-MB-231 细胞与 GLU-PEG-PEI/WTp53 或 p53/p730D [利用低水平的质粒(0.2 Ug DNA/60-mm碟)以避免p53_介导的细胞死亡]温育。24小时后使用2%福尔马林固定细胞，用DAPI染料染色。上面的图显示GFP表达。下面的图显示由DAPI染色检测到的细胞核。图12. p53、p730和p53嵌合体的示意图。p53嵌合体包含p730的寡聚结构域(OD)，其中p53蛋白的393氨基酸序列在氨基酸318到364处被p73 P蛋白的氨基酸346-390取代。TAD :反式激活域；PRD :脯氨酸富集域；DBD :DNA结合域；01igo :寡聚结构域。
发明详述
本说明书并非意欲详细列举可实施本发明的所有不同方式，或者可加入本发明的所有特征。例如，关于一个实施方式所示的特征可并入其它实施方式，关于
所示的特征可从该实施方式中删除。此外，本领域技术人员鉴于本公开可明了本文提示的对各种实施方式的许多改变和增加，它们不脱离本发明。因此，以下描述想要说明本发明的某些
，而非穷尽性指出它们的所有排列、组合和改变。除非另有限定，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的意义。本发明说明书中所用的术语仅是出于描述
的目的，而非限制本发明。本文述及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用全文纳入本文。如本文中所用的，“一个”、“一种”或“该”可表示一个或更多个。例如，“一个”细胞可表示单个细胞或多个细胞。如本文中所用的，“和/或”指代和包括一个或更多个相关的所列项目的任何和全部可能的组合，以及用“或”解读时表示不存在组合。此外，如本文中所用的，术语“约”当指代可检测值，例如本发明的生物分子或试剂 的含量、剂量、时间、温度等时，表不包括所指量的土 20%、土 10%、土 5%、土 1%、土 0.5%
或者甚至土 0.1%的差异。在一个方面，本发明通过给予对象(例如，患癌症的对象)本发明的纳米颗粒来提供治疗癌症的新策略，所述纳米颗粒设计成选择性和直接地靶向对象中的肿瘤细胞。纳米颗粒将活性剂递送至肿瘤细胞来杀死细胞和/或将可检测标记物沉积以便鉴定细胞为肿瘤细胞。因此，在一个实施方式中，本发明提供包含以下成分、基本上由以下成分构成或由以下成分构成的纳米颗粒a)聚阳离子/聚亚烷基二醇/葡萄糖偶联物；和b)活性剂。在另一个实施方式中，本发明提供包含以下成分、基本上由以下成分构成或由以下成分构成的纳米颗粒a)包含活性剂的核心；和b)围绕a)的核心的葡萄糖/聚亚烷基二醇偶联物。在另一个实施方式中，本发明提供包含以下成分、基本上由以下成分构成或由以下成分构成的纳米颗粒a)包含活性剂的核心；b)围绕a)的核心的葡萄糖/聚亚烷基二醇偶联物；和(3)聚阳离子。在另一个实施方式中，本发明提供包含葡萄糖/活性剂复合物、基本上由葡萄糖/活性剂复合物构成或由葡萄糖/活性剂复合物构成的纳米颗粒。在另一个实施方式中，本发明提供包含以下成分、基本上由以下成分构成或由以下成分构成的纳米颗粒a)聚阳离子/藻酸盐/葡萄糖偶联物；和b)活性剂；以及包含以下成分、基本上由以下成分构成或由以下成分构成的纳米颗粒a)包含活性剂的核心；和b)围绕a)的核心的葡萄糖/藻酸盐偶联物。此外，本文提供包含以下成分、基本上由以下成分构成或由以下成分构成的纳米颗粒a)包含活性剂的核心；b)围绕a)的核心的葡萄糖/藻酸盐偶联物；和c)聚阳离子。本发明的纳米颗粒可作为纳米颗粒的群存在，因此，本发明提供在运载体中包含纳米颗粒的群的组合物。所述群的纳米颗粒可以均是同一类型或所述纳米颗粒的群可以由两种或更多种不同类型的本文中所述纳米颗粒以任何组合和任何比例构成。本发明的纳米颗粒的大小可以是约20 nm到约500 nm。因此，所述纳米颗粒可以是 20 nm、25 nm、30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70 nm、75 nm、80nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、110 nm、120 nm、130 nm、140 nm、150 nm、160 nm、170 nm、180 nm、190 nm、200 nm、225 nm、250 nm、275 nm、300 nm、325 nm、350 nm、400 nm、450 nm、500 nm等或它们的任何组合。本领域的技术人员应该知道，在包含本发明的纳米颗粒的组合物中，组合物中的纳米颗粒的大小可以不同，但通常落在本文所述的大小范围内。在本发明的纳米颗粒中，偶联物的葡萄糖部分可以作为葡萄糖、F-18-氟脱氧葡萄糖(FDG)、放射性标记葡萄糖(例如，[11C]葡萄糖、[14C]葡萄糖)、葡萄糖衍生物或它们的任何组合存在。术语“葡萄糖衍生物”包括具有修饰的葡萄糖化学结构的葡萄糖分子，该葡萄糖分子是生物相容性的并且可被身体进行生物化学处理(例如，被葡萄糖转运蛋白结合)。葡萄糖衍生物的例子包括但不限于右旋葡萄糖(D-葡萄糖)和2-脱氧葡萄糖(2-DG)。“聚亚烷基二醇”表示直链或支链聚亚烷基二醇聚合物，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)和聚丁二醇(PBG)以及PEG、PPG和PBG的任何组合的共聚物，“聚亚烷基二醇”包括聚亚烷基二醇的单烷基醚(monoalkylether)。因此，在本发明的各种实施方式中，本发明纳米颗粒中的聚亚烷基二醇可以是但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇和它们的任何组合。 在某些实施方式中，所述纳米颗粒的聚亚烷基二醇是聚乙二醇或“PEG”。术语“PEG亚单元”指单个聚乙二醇单元，S卩，一(CH2CH2O)—。在一些实施方式中，所述聚亚烷基二醇(例如，PEG)可以是非多分散的、单分散的、基本上单分散的、纯单分散的或基本上纯单分散的。“单分散的”用于描述化合物的混合物，其中所述混合物中约100%的化合物具有相同的分子量。“基本上单分散的”用于描述化合物的混合物，其中所述混合物中至少约95%的化合物具有相同的分子量。“纯单分散的”用于描述化合物的混合物,其中所述混合物中约100%的化合物具有相同的分子量且具有相同的分子结构。因此，纯单分散的混合物是单分散的混合物，但单分散的混合物不一定是纯单分散的混合物。“基本上纯单分散的”用于描述化合物的混合物，其中所述混合物中至少约95%的化合物具有相同的分子量且具有相同的分子结构。因此，基本上纯单分散的混合物是基本上单分散的混合物，但基本上单分散的混合物不一定是基本上纯单分散的混合物。在实施方式中，其中所述纳米颗粒包含以下成分、基本上由以下成分构成或由以下成分构成a)聚阳离子/藻酸盐/葡萄糖偶联物；和b)活性剂，所述聚阳离子、葡萄糖和藻酸盐可通过共价相互作用在偶联物中彼此相连。此外，聚阳离子/藻酸盐/葡萄糖偶联物可通过静电力与活性剂相连。在实施方式中，其中所述纳米颗粒包含以下成分、基本上由以下成分构成或由以下成分构成a)包含活性剂的核心；和b)围绕a)的核心的葡萄糖/藻酸盐偶联物，所述葡萄糖和藻酸盐可通过共价相互作用彼此相连。此外，所述葡萄糖/藻酸盐偶联物可通过共价相互作用与所述活性剂相连。在本发明纳米颗粒的一些实施方式中，葡萄糖/PAG偶联物(例如，葡萄糖/PEG偶联物)可以围绕包含活性剂的核心存在。在该葡萄糖/PAG偶联物中，葡萄糖和PAG可相连，例如通过化学共价键(例如，共价相互作用)。葡萄糖/PAG偶联物的PAG部分可通过共价相互作用连接于核心的活性剂。此外，在本发明的纳米颗粒的一些实施方式中，聚阳离子/PAG/葡萄糖偶联物可连同活性剂一起存在。在该偶联物中，葡萄糖或PAG可如上所述彼此相连，聚阳离子(例如，PEI)可例如通过化学共价键连接于葡萄糖/PAG偶联物的PAG(例如，PEG)。该偶联物的聚阳离子可通过静电力连接于活性剂。在本发明的纳米颗粒中，其中存在包含聚阳离子和活性剂的核心与围绕所述核心的葡萄糖/PAG偶联物一起存在，所述聚阳离子可通过静电力连接于活性剂，所述葡萄糖/PAG偶联物可通过共价键连接于所述核心的聚阳离子。此外，在本发明的纳米颗粒中，其中，包含聚阳离子和活性剂的核心与围绕所述核心的葡萄糖/藻酸盐偶联物一起存在，所述聚阳离子可通过静电力连接于活性剂，所述葡萄糖/藻酸盐偶联物可通过共价键连接于所述核心的聚阳离子。
在聚阳离子存在于纳米颗粒中的本发明的实施方式中，所述聚阳离子可以是但不限于聚乙烯亚胺、聚氮丙啶、聚(烯丙基负离子盐酸盐；PAH)、腐胺、尸胺、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚(三亚甲基亚胺)、聚(四亚甲基亚胺)、聚亚丙基亚胺(polypropylenimine)、氨基糖苷-聚胺、二脱氧-二氨基-b_环糊精、精胺、亚精胺、尸胺、聚(2-二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯、聚(组氨酸)、阳离子化明胶、枝状聚合物(dendrimer)、壳聚糖和它们的任何组合。在本发明纳米颗粒的某些实施方式中，所述聚阳离子是聚乙烯亚胺(PEI)。在本发明的各种实施方式中，聚阳离子(例如，PEI)可以与本发明的活性剂(例如，多核苷酸、寡核苷酸、阴离子蛋白质、阴离子药物、共价结合于多肽或蛋白质的多核苷酸或寡核苷酸、以及它们的任何组合)通过物理静电力(例如，其中活性剂中的负电荷与聚阳离子中的正电荷结合)复合。活性剂可以在聚阳离子偶联于GLU-PAG或GLU-藻酸盐之前和/或之后与聚阳离子复合。还期望，本发明的纳米颗粒的各种成分可通过交联彼此相连，例如利用交联剂和/或催化剂[例如，任何组合的I-乙基-(3-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐(EDC);N，N’ - 二环己基碳二亚胺(DCC) ；N, N’ - 二异丙基碳二亚胺(DIC)、京尼平(genipin)和本领域已知的任何其它交联剂和/或催化剂]。在一些实施方式中，可采用化学交联，例如光交联，其中具有光可固化基团的成分可以与纳米颗粒的光可固化成分共-交联。在其它实施方式中，纳米颗粒的成分可经连接分子相连。本发明的连接分子的例子包括但不限于肝素和硫酸肝素。在将肝素用作连接分子的实施方式中，可使用通过静电力或特异性结合与肝素结合的活性剂。例如，肝素与本领域熟知的TGF-^ I、IL-10、HGF、FGF和其它，具有特异性结合。此外，肝素带负电荷，可通过静电力结合带正电荷的聚阳离子。本发明的其它连接分子包括肝素类似物和改性的多糖，例如Frank等人ij. Biol. Chem.278(44): 43229-43235 (2003))中所述的。本发明纳米颗粒中存在的活性剂可以是但不限于多核苷酸、多核苷酸的片段、寡核苷酸、反义序列、核酶、编码核酶的核苷酸序列、干扰RNA (siRNA ; shRNA、dsRNA)、微小RNA (miRNA)、蛋白质、蛋白质的生物活性片段、多肽、化疗药物或试剂、细胞毒剂、放射性核素、可检测标记物、显像剂、和它们的任何组合。在一些实施方式中，本发明的多核苷酸可以是编码赋予疗效的功能蛋白或其它产物的质粒或核酸结构物。本发明的核酸结构物编码的蛋白质的非限制性例子包括本领域已知或以后被鉴定的p53、p53/p730D嵌合体、白介素-2(IL-2)、白介素-4 (IL-4)、白介素-6 (IL-6)、白介素-7 (IL-7)、白介素-12 (IL-12)、白介素-15 (IL-15)、白介素-18 (IL-18)、白介素-21 (IL-21)、白介素-27 (IL-27)、cesalin、CPT-Il、干扰素可诱导蛋白质-10 (IP-10)、干扰素Y诱导的单核因子(Mig;CXCL9)、肿瘤坏死因子 a (TNF-a)、Fas 配体、PTEN、ARF (pl4)、Fas、CDK 抑制蛋白(CIP) pl5、CIPp27、CIP p21、￠-联蛋白、血管内皮生长因子受体2 (msFlkl)、胸苷激酶、抗-血管生成因子、凋亡诱导因子(例如，BIK、BNIP、NOXA PUMA、BAD、BAX、EGL-1、CED13)等等。在纳米颗粒包含含有活性剂的核心的实施方式中，所述核心可包含以下成分、基本上由以下成分构成或由以下成分构成作为活性剂的多核苷酸/聚阳离子(例如，PEI)复合物。在一个具体的实施方式中，所述多核苷酸是编码p53的质粒或核酸结构物。在该实施方式中，本发明的纳米颗粒将编码P53的质粒选择性且直接地递送至肿瘤细胞。在转染的肿瘤细胞中产生P53蛋白，其中p53蛋白表现出其抗肿瘤作用。
如本文所用的，“核酸”、“核苷酸序列”和“多核苷酸”包括RNA和DNA，包括cDNA、基因组DNA、mRNA、合成的(例如，化学合成的)DNA或RNA以及RNA和DNA的嵌合体。术语“多核苷酸”或“核苷酸序列”指核苷酸链，而无论该链的长度。核酸可以是双链或单链的。如果是单链的，核酸可以是有义链或反义链。可利用寡核苷酸类似物或衍生物(例如，肌苷或硫代磷酸酯核苷酸)来合成核酸。此类寡核苷酸可用于，例如制备已改变碱基配对能力或对核酸酶的耐受性增加的核酸。本发明还提供本发明核酸或核苷酸序列的互补核酸(其可以是完全互补或部分互补)。“分离的多核苷酸”是这样一种核苷酸序列(例如，DNA或RNA)，其不与核苷酸序列直接邻接，在获得它的有机物的天然存在的基因组中，其与所述核苷酸序列直接邻接(一条在5’端，一条在3’端)。因此，在一个实施方式中，分离的核酸包含与编码序列直接邻接的一部分或全部5’-非编码(例如，启动子)序列。因此，该术语包括，例如并入载体、自复制质粒或病毒、或原核或真核生物的基因组DNA的重组蛋白，或者独立于其它序列的作为独立分子存在(例如，通过PCR或限制性核酸内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)的重组DNA。其还包括是编码额外多肽或多肽序列的杂交核酸的一部分的重组DNA。包含基因的分离的多核苷酸不是包含此基因的染色体的片段，而是包含与该基因相关的编码区和调控区，但没有该染色体上天然存在的其它基因。术语“分离的”可指基本上不含细胞物质、病毒物质和/或培养基(当通过重组DNA技术产生时)或化学前体或其它化学试剂(当化学合成时)的核酸、核苷酸序列或多肽。而且，“分离的片段”是天然不作为片段天然存在并且未以天然状态发现的核酸、核苷酸序列或多肽的片段。“分离的”不表示该制品在技术上是纯的(均质的)，而是足够纯，从而能提供处于可用于所需目的的形式的多肽或核酸。分离的细胞指与天然状态下与其通常相关的其它成分分离的细胞。例如，分离的细胞可以是培养基中的细胞(例如，体外)和/或在本发明的药学上可接受的运载体中的细胞。因此，可将分离的细胞递送至和/或引入对象。在一些实施方式中，分离的细胞可以是从对象中取出，离体操作后再送回该对象的细胞。当用于多核苷酸时，术语“片段”应理解为表示相对于参考核酸或核苷酸序列长度减小的核苷酸序列，并且包含、基本上由以下核苷酸序列构成或由以下核苷酸序列构成，与参考核酸或核苷酸序列相同或几乎相同(例如，90%、92%、95%、98%、99%相同)的邻接的核苷酸的核苷酸序列。如果合适，本发明的此类核酸片段可以包括在较大的多核苷酸中，本发明的此类核酸片段作为较大的多核苷酸的成分。在一些实施方式中，此类片段可包含以下寡核苷酸、基本上由所述寡核苷酸组成或由所述寡核苷酸组成所述寡核苷酸具有本发明的核酸或核苷酸序列的至少约 8、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200 或更多个连续的核苷酸的长度。当用于多肽的时，术语“片段”应理解为表示相对于参考多肽或氨基酸序列长度减小的氨基酸序列，且包含以下氨基酸序列、基本上由以下氨基酸序列构成或由以下氨基酸序列构成，与参考多肽或氨基酸序列相同或几乎相同(例如，90%、92%、95%、98%、99%相同)的邻接氨基酸的氨基酸序列，。如果合适，本发明的此类多肽片段可以包括在较大的多肽中，本发明的多肽片段作为较大的多肽的成分。在一些实施方式中，此类片段可包含以下多肽、基本上由以下多肽构成或由以下多肽组成所述多肽具有本发明的多肽或氨基酸序列的至少约 4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200 或更多个连续的氨基酸的长度。
如本文所用的，“功能”多肽或“功能蛋白”或多肽的“功能片段”或“生物学活性片段”基本上保留了与该多肽通常相关的至少一种生物学活性(例如，抗肿瘤活性、蛋白质结合、配体或受体结合)。在具体的实施方式中，“功能”多肽或蛋白质或“功能片段”基本上保留了未修饰的蛋白质具有的所有活性。“基本上保留”生物学活性，表示所述多肽或蛋白质或片段保留了天然多肽的至少约20%、30%、40%、50%、60%、75%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或更多的生物学活性(甚至可以比天然多肽具有更高水平的活性)。“非-功能”多肽表现出很少或基本上没有与该多肽通常相关的可检测生物活性(例如，最多仅是非显著的量，例如小于约10%或甚至5%)。可采用本领域熟知和本文描述的试验来测定生物学活性，例如蛋白质结合和抗肿瘤活性。关于包含编码序列的核酸，术语“表达(express、expressing或expression) ”表示该核酸经转录和任选翻译。按照本发明，本发明编码序列的表达通常导致本发明的多肽或其它产物的产生。完全表达的多肽或片段或其它产物还可在完整细胞中起作用而无需纯化。在本发明的一些实施方式中，活性剂可以是反义核苷酸序列或反义寡核苷酸。如本文所用的，术语“反义核苷酸序列”或“反义寡核苷酸”指与指定的目标核苷酸序列互补的核苷酸序列。可按照常规技术制备表达相同的反义寡核苷酸和核酸。参见，例如授予Tullis的美国专利第5，023，243号；授予Pederson等人的美国专利第5，149，797号。所述反义核苷酸序列可以与整个目标核苷酸序列或至少10、20、40、50、75、100、150、200、300或500个邻接的碱基的其一部分互补，并且降低由该目标核苷酸序列编码的蛋白质或产物的产生的水平。本领域技术人员应理解，反义核苷酸序列不必与目标核苷酸序列完全互补，只要序列相似程度足以使得反义核苷酸序列与其目标杂交并降低所编码的多肽或产物的产量。本领域已知的是，短反义核苷酸序列通常需要较高的序列相似程度，而较长反义核苷酸序列允许更大程度的错配碱基。例如，就反义核苷酸序列的目标核苷酸序列而言，可在降低的严格性、中等严格性或者甚至高严格性的条件下进行此类反义核苷酸序列的杂交(例如，分别是由35-40%甲酰胺与5 XDenhardt溶液、0. 5% SDS和I X SSPE，于37°C的洗涤严格性代表的条件；由40-45%甲酰胺与5XDenhardt溶液、0. 5% SDS和1XSSPE，42°C的洗涤严格性代表的条件；和/或50%甲酰胺与5XDenhardt溶液、0. 5% SDS和I X SSPE，42°C的洗涤严格性所代表的条件)。参见,例如Sambrook等人，《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning: ALaboratory Manual)第2版.(冷泉港，纽约，1989)。因此,在一些实施方式中，本发明的反义核苷酸序列与目标编码序列的互补序列有至少约70%、80%、90%、95%、97%、98%或更高的序列相似性且降低多肽产生的水平。反义核苷酸序列的长度(即，其中核苷酸的数量)不是至关重要的，只要其选择性地结合至预期的位置并降低靶序列的转录和/或翻译，该长度可按照常规程序来确定。反义核苷酸序列的长度通常约是8、10或12个核苷酸，最多约20、30、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450或500个核苷酸或更长。可通过本领域已知的方法，采用化学合成和酶连接反应构建反义核苷酸序列。例如，可利用天然存在的核苷酸或为增加分子的生物学稳定性或增加反义和有义核苷酸序列之间形成的双链体的物理稳定性而设计的各种修饰的核苷酸来化学合成反义核苷酸序列，例如可利用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核苷酸序列的修饰的 核苷酸的例子包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、^ -D-半乳糖基Q核苷(queosine)、肌苷、N6_异戊烯基腺嘌呤、I-甲基鸟嘌呤、I-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、P-D-甘露糖基Q核苷、5’ -甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿喃唳、2-甲基硫代-N6-异戍烯基腺嘌呤、尿卩密唳-5-氧代乙酸(V)、wybutoxosine、假尿喃啶(pseudouracil)、Q核苷、2_硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧代乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧代乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(&叩3) 和2，6-二氨基嘌呤。或者，可利用表达载体来产生反义核苷酸序列，在所述表达载体中以反义方向克隆了核酸(即，从插入的核酸转录的RNA是感兴趣的目标核酸的反义方向)。本发明的反义核苷酸序列还包含这样的核苷酸序列，其中至少一个或全部的核苷酸间桥连磷酸残基是修饰的磷酸酯，例如膦酸甲酯、硫代膦酸甲酯、偶磷吗啉酸(phosphoromorpholidates)、偶憐哌嗪酸(phosphoropiperazidates)和氨基憐酸酯。例如，每隔一个核苷酸间桥连磷酸残基可如所述地进行修饰。在另一非限制性例子中，反义核苷酸序列是这样的核苷酸序列，其中一个或全部的核苷酸含有2’低级烷基部分(例如，C1-C4、直链或支链、饱和或不饱和的烷基，例如甲基、乙基、乙烯基、丙基、I-丙烯基、2-丙烯基和异丙基)。例如，每隔一个核苷酸可如所述地进行修饰。还可参见Furdon等人.，Nucleic Acids Res. 17:9193 (1989) ;Agrawal 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA87:1401 (1990) ;Baker 等人 ，Nucleic Acids Res. 18:3537 (1990) ;Sproat 等人 ，Nucleic Acids Res. 17:3373 (1989) ;Walder 和 Walder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:5011 (1988)，这些文献中关于制备反义分子的方法的教导，包括含有修饰的核苷酸碱基的那些的全部内容通过引用纳入本文。在本发明的各种实施方式中，活性剂可以是干扰RNA，例如小干扰RNA (siRNA)，短发夹RNA (shRNA)，双链RNA (dsRNA)或微小RNA (miRNA)。这些干扰RNA可以直接针对肿瘤细胞内的靶核苷酸序列，从而调控核苷酸序列的表达，随后调控该靶核苷酸序列编码的蛋白质或产物的产量。使用干扰RNA方法被靶向的肿瘤细胞或癌细胞内的核苷酸序列的非限制性例子包括 Bcl-2、Bcl-XL, Akt、HIF_a、MMP, Ras 和 MDM2。siRNA是转录后基因沉默的机制，其中将对应于靶编码序列的双链RNA (dsRNA)引入细胞或有机物，从而导致相应的mRNA的降解。以下文献总结了 siRNA实现基因沉默的机制Sharp 等人，Genes Dev. 15:485 (2001);和 Hammond 等人 ，Nature Rev. Gen. 2:110 (2001)。siRNA效应持续多轮细胞分裂，然后基因重获表达。已在人细胞(包括人胚胎肾脏和HeLa细胞)中证实siRNA是成功的(参见，例如Elbashir等人 ，Nature 411: 494(2001))。在一个实施方式中，可通过强迫RNA发夹(shRNA)的内源性表达在哺乳动物细胞中诱导沉默(参见 Paddison 等人 ，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 1443 (2002))。在另一个实施方式中，小(21-23 nt) dsRNA的转染特异性抑制核酸表达(Caplen, TrendsBiotechnol. 20:49 (2002)中进行了综述)。
siRNA技术采用标准的分子生物学方法。可通过标准方法制备对应于待灭活的全部或部分靶编码序列的dsRNA，例如用17 RNA聚合酶同时转录模板DNA (对应于靶序列)的两条链。用于siRNA的制备dsRNA的试剂盒可市售购得，例如购自新英格兰生物实验室(New England Biolabs, Inc)。转染dsRNA或设计成制备dsRNA的质粒的方法是本领域的惯常方法。微小RNA (miRNA)是长约21_23个核苷酸的单链RNA分子，其可以类似于siRNA的方式用于调控基因表达(参见美国专利第7，217，807号)。已在转染了 mRNA-cDNA杂交结构物的哺乳动物细胞中报道了类似于siRNA所产生的那些效应的沉默效应(Lin等人 ，Biochem. Biophys. Res. Commun. 281:639(2001))，从而为使感兴趣的编码序列沉默提供另一策略。在一些实施方式中，本发明的活性剂还可以是核酶以及编码核酶的核酸。核酶是以位点特异性方式切割核酸的RNA-蛋白质复合物。核酶具有特异性催化结构域，所述结构域具有内切核酸酶活性(Kim 等人，Proc. Natl. Acad, Sci. USA 84:8788 (1987)；Gerlach 等人 ，Nature 328:802 (1987) ;Forster 和 Symons, Cell 49:211 (1987))。例如，许多核酶高度特异性地加速磷酸酯转移反应，常只切割寡核苷酸底物中几个磷酸酯之一(Michel和Westhof, J Mol. Biol. 216:585 (1990) ;ReinhoId-Hurek和Shub, Nature357: 173 (1992))。该特异性归已因于在化学反应之前底物需要通过特异性碱基配对相互作用结合于核酶的内部指导序列(“IGS”)。观察到核酶催化主要作为涉及核酸的序列特异性切割/连接反应的一部分(Joyce, Nature 338:211 (1989))。例如，美国专利第5，354，855号描述了某些核酶可用作序列特异性高于已知核糖核酸酶、接近DNA限制酶的内切核酸酶。因此,序列特异性核酶-介导的基因表达的抑制特别适用于治疗应用(Scanlon等人.，Proc. Natl. Acad.Sci USA 88:10591 (1991) ;Sarver 等人，Science 247:1222 (1990) ;Sioud 等人 ，J.Mol Biol. 223:831 (1992))。在一些实施方式中，本发明的活性剂可以是化疗药物或试剂。化疗药物或试剂的非限制性例子包括I)长春花属生物碱(例如，长春花碱、长春新碱)；2)表鬼白毒素(例如，依托泊苷和替尼泊苷)；3)抗生素(例如，更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素(道诺霉素；红比霉素)、阿霉素、博莱霉素、普卡霉素(光辉霉素)和丝裂霉素(丝裂霉素C);4)酶(例如，L-天冬酰胺酶)；5)生物反应修饰剂(例如，干扰素-a) ；6)钼配位复合物(例如，顺钼和卡钼)；7)蒽二酮类(例如，米托蒽醌)；8)取代的脲(例如，羟基脲)；9)甲基肼衍生物(例如，丙卡巴肼(N-甲基肼;MIH)) ; 10)肾上腺皮质抑制剂(例如，米托坦(o，p’_DDD)和氨鲁米特)；11)肾上腺皮质类固醇类(例如，泼尼松)；12)孕酮(例如，己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮)；13)雌激素类(例如，己烯雌酚和乙炔雌二醇)；14)抗雌激素类(例如，他莫昔芬)；15)雄激素类(例如，丙酸睾酮和氟甲睾酮)；16)抗雄激素类(例如，氟他胺) ；和17)促性腺激素-释放激素类似物(例如，亮丙瑞林)。本发明化疗剂的其它例子包括氨甲蝶呤、表柔比星、氟尿嘧啶、维拉帕米、环磷酰胺、阿糖胞苷、氨基喋呤、博来霉素、秋水仙胺(democolcine)、依托泊苷、光辉霉素、瘤可宁、美法仑、道诺红霉素、阿霉素、他莫昔芬、紫杉醇、喜树碱、基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂(例如，马立马司他(Marimastat)、托卡特(Trocade)、强力霉素、米诺环素和通过引用纳入的美国专利第5，872，152号中所述的)和阿糖胞苷。在本发明的另一个实施方式中，活性剂可以是放射性核素。如本文中所述的，“放射性核素”可以是适合将治疗剂量的辅射递送至肿瘤或癌细胞的任何放射性核素，包括但不限于227Ac,211At,131Ba,77Br,109Cd,51Cr,67Cu,165Dy,155Eu,153Gd,198Au,166Ho,113mIn,115mIn,123I,1251 , 131 1 , 189Ir, 191Ir, 192Ir, 194Ir,52Fe,55Fe,59Fe, 177Lu, 109Pd,32P, 226Ra, 186Re, 188Re, 153Sm,46Sc,47Sc,72Se,75Se, 105Ag,89Sr,35S,177Ta, 117mSn,121Sn, 166Yb, 169Yb,90Y,212Bi,119Sb, 197Hg,97Ru,100Pd,lolmRh 和 212Pb。在本发明另一实施方式中，活性剂可以是或可包含可检测标记物或标记。可检测标记物或标记的非限制性例子包括本领域熟知的放射性核素(35S、125I、131I、99Te、64CU，等等)、酶、荧光试剂、化学发光试剂和生色剂以及底物、辅因子、抑制剂、磁粉等。本发明的活性剂还可以是细胞毒剂。如本文所用的，“细胞毒剂”包括但不限蓖麻蛋白(例如，蓖麻蛋白A链)、阿克拉霉素、白喉毒素、莫能星、疣孢菌素A、相思豆毒蛋白、长春花属生物碱、单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)和假单胞菌外毒素A。此外，本发明的活性剂可以是显像剂。例如，异硫氰酸荧光素(FITC)可以是用于荧光成像的显像剂，超顺磁性铁氧化物可以是用于磁共振成像(MRI)的显像剂且/或放射性核素可以是用于放射线照相成像的显像剂。应该理解，本发明纳米颗粒的任何元素可存在于上述本发明纳米颗粒的各种实施方式中，本发明纳米颗粒中也可不包含任何此类元素或将其从中排除，这些元素的此类排除或缺失可定义为本发明的负限制(例如，通过负限定附带从所述实施方式中排除)。作为另一个方面，本发明提供药物制剂和给予所述药物制剂以便获得疗效和/或以供诊断的方法，如本文中所述的。所述药物制剂可在药学上可接受的载体中包含本文所述的任何纳米颗粒。“药学上可接受的载体”是组合物的组分，例如盐、载体、赋形剂或稀释剂，该组分
(i)与组合物中的其它成分相容，从而使其能与本发明的组合物混合(combine)而不使得该组合物不适于所需目的，和(ii)适用于本文提供的对象而没有过度的不利的副作用(例如毒性、刺激性和过敏反应)。当副作用的风险超出组合物提供的益处，则副作用是“过度的”。药学上可接受的组分的非限制性例子包括但不限于任何标准药物载体，例如磷酸缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水乳液)、微乳液和各类润湿剂。具体地，期望药学上可接受的载体是经配制以给予或递送入本发明的对象的无菌载体。此外，药学上可接受的载体是联邦或州政府的管理机构批准的或在美国药典或其它公认的用于动物(更具体地人)的药典中列出的任何载体分子。此类载体可采取溶液、混悬液、乳液、片剂、丸剂、小粒、胶囊、含液体的胶囊、散剂、缓释制剂、栓剂、乳液、气溶胶、喷雾剂、混悬液的形式或适用的任何其它形式。本领域技术人熟知合适的药物载体的例子(参见，例如《雷明顿药学科学与实践》(Remington: The Science and Practice of Pharmacy),第 21 版(2005),Lffff 公司(Lippincott Williams & Wilkins),费城，宾夕法尼亚州)。而且，在制备包含与配制组合物所需组分相混合的一种或更多种活性成分的此类药物组合物中，可掺入其它常规药学上可接受的添加剂，包括例如赋形剂、稳定剂、防腐剂、润湿剂、乳化剂、润滑剂、甜味剂、着色剂、调味剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂等。作为添加剂，可提到的是例如淀粉、蔗糖、果糖、右旋糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖醇、沉淀碳酸 钙、结晶纤维素、羧甲基纤维素、糊精、明胶、阿拉伯胶、EDTA、硬脂酸镁、滑石、羟丙基甲基纤维素、焦亚硫酸钠等。本发明的制剂可任选地包含医学试剂、药学试剂、载体、佐剂、分散剂、稀释剂等。可根据已知技术在药物载体中配制本发明的纳米颗粒以供给药。参见例如《雷明顿药学科学与实践》，第21版(2005) ,Lffff公司，费城，宾夕法尼亚州。在制备本发明的药物制剂中，化合物(包括其生理学上可接受的盐)通常与尤其是可接受的载体混合。所述载体可以是固体或液体或二者兼具，优选地将载体与化合物配制成单位剂量制剂(例如片剂)，其可以含有0. 01或0. 5重量％到95重量％或99重量％的化合物。可将一种或更多种化合物掺入本发明的制剂，其可通过药学上熟知的技术来制备。本发明的另一方面是体内治疗对象的方法，包括给予对象在药学上可接受的载体中包含本发明的纳米颗粒的药物组合物，其中以治疗有效量给予所述药物组合物。本发明的组合物给予有此需要的人类对象或动物可通过本领域已知的用于给予此类组合物的任何方式进行。本发明的制剂包括适合于以下给药方式的那些口服、直肠、局部、口腔含化(例如，舌下)、阴道、胃肠外(例如，皮下、肌肉内(包括骨骼肌、心肌、隔膜肌和平滑肌)、真皮内、静脉内、腹膜内)、局部(即，皮肤和粘膜表面，包括气道表面)、鼻内、眼内、内脏内、视网膜内、经皮的、关节内、鞘内和吸入给药，通过门静脉内递送(intraportal delivery)给药至肝脏以及直接器官注射(例如，注射入肝脏、注射入大脑以递送至中枢神经系统、注射入胰脏、注射入肿瘤或围绕肿瘤的组织)。在任何给出的情况中，最合适的途径取决于所治疗病症的性质和严重程度以及所用具体化合物的性质。对于注射，载体通常是液体，例如无菌无热原水、无热原磷酸盐缓冲盐水溶液、抑菌水或Cremophor EL[R](新泽西州帕斯帕尼的巴斯夫公司(BASF, Parsippany, N.J.))。对于其它给药方法，载体可以是固体或液体。对于口服给药，可以固体剂型给予组合物，例如胶囊、片剂和散剂，或以液体剂型给予，例如酏剂、糖浆剂和混悬剂。可将组合物与无活性成分和粉末化的载体，例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、淀粉、纤维素或纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石粉、碳酸镁等一起包封在明胶胶囊中。可加入以提供所需颜色、味道、稳定性、缓冲能力、分散性或其它已知所需特征的附加的无活性成分的例子是氧化铁红、硅胶、月桂基硫酸钠、二氧化钛、可食用白色墨水(edible white ink)等。可使用类似的稀释剂制备压缩片剂。片剂和胶囊均可制成缓释产品以便在数小时期间持续释放药物。压缩片剂可以是糖包衣或薄膜包衣以遮蔽任何不愉快的味道并保护片剂以隔离大气，或是肠包衣以便在胃肠道中选择性崩解。口服的液体剂型可含有着色剂和调味剂以增加患者接受度。适合口腔含化(舌下)给药的制剂包括在调味基料(base)中包含组合物的锭剂，所述调味基料通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶；和在惰性基料中包含组合物的软锭剂，所述惰性基料是例如明胶和固有或蔗糖和阿拉伯胶。 适合胃肠外给药的本发明制剂包括组合物的无菌水性和非水性注射溶液，该制品优选与预定的接受者的血液是等渗的。这些制品可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得制剂与预定的接受者的血液等渗的溶质。水性和非水性无菌混悬剂可包括悬浮剂和增稠剂。所述制剂可提供于单位剂量或多剂量容器中，例如密封安瓿和管形瓶，可储存在冷冻干燥(冻干)条件下，只需在使用前直接加入无菌液体载体例如盐水或注射用水。可从上述类型的无菌散剂、颗粒和片剂制备临时的注射溶液和混悬液。例如，本发明一个方面提供包含本发明的纳米颗粒的可注射、稳定无菌组合物，该组合物为处于密封容器中的单位剂型。组合物以冻干物(Iyophilizate)的形式提供,所述冻干物能用合适的药学上可接受的载体重建以形成适合将其注射入对象的液体组合物。当所述组合物基本上是水不溶性的时，可以足够的量采用足够量的药学上可接受的乳化剂以便在水性载体中乳化该组合物。一种此类有用的乳化剂是磷脂酰胆碱。适合直肠给药的制剂优选地作为单位剂量栓剂来提供。可将组合物与一种或更多种常规固体载体(例如可可脂混合)、然后使得到的混合物成形来制备这些栓剂。适合局部施用于皮肤的制剂优选采取软膏、乳膏、洗液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气溶胶或油的形式。可利用的载体包括石油膏、羊毛脂、聚乙二醇、醇类、经皮增强剂和它们中两种或更多种的组合。适合经皮给药的制剂可以作为适于与接受者的表皮保持长期密切接触的离散的贴剂来提供。适合透皮给药的制剂还可通过离子电渗疗法来递送(参见，例如Tyle，Pharm. Res. 3:318 (1986))，且通常采取任选地含缓冲剂的组合物的水溶液的形式。合适的制剂包含柠檬酸盐或bis/tris缓冲剂(pH 6)或乙醇/水。或者，可将化合物配制成用于通过任何合适的方式鼻部给药或以其它方式给予对象的肺，例如通过包含纳米颗粒的可呼吸颗粒的气溶胶混悬液来给药，该气溶胶混悬液被对象吸入。可呼吸颗粒可以是液体或固体。术语“气溶胶”包括能吸入支气管或鼻通道的任何运载气体的悬浮相。具体地，气溶胶包括运载气体的液滴混悬液，其可在计量剂量的吸入器或雾化器或喷雾器中产生。气溶胶还包括悬浮在空气或其它载气中的干粉料组合物，例如，其可通过可从吸入器装置吹入来递送。参见，Ganderton和Jones,《向呼吸道进行药物递送》Wrug Deli very to the Respiratory Tract), Ellis Horwood (1987)；Gonda (1990) Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 6:273-313 ;和Raeburn 等人，J. Pharmacol. Toxicol. Meth. 27:143 (1992)。可通过本领域技术人员已知的任何合适的方式产生包含纳米颗粒的液体颗粒的气溶胶，例如压力驱动的气溶胶雾化器或超声波雾化器。参见例如美国专利第4，501，729号。可通过药学领域已知的技术，利用任何固体颗粒药物气溶胶发生器来类似地产生包含纳米颗粒的固体颗粒的气溶胶。或者，可局部给予(例如，直接给予到肿瘤内和/或肿瘤附近)本发明的纳米颗粒而非全身性给予，例如以贮存库(depot)或缓释制剂的形式。可任选地与其它治疗剂和/或疗法组合递送本发明的纳米颗粒。额外的治疗剂和/或疗法可以在本发明纳米颗粒之前、之后和/或同步递送。如本文所用的，单词“同步”表示时间上足够接近，从而产生组合效应(即，同步可以是同时，或者可以是在彼此前后的短时间内发生的两个或更多个事件)。在一个实施方式中，可与以下试剂组合给予本发明的纳米颗粒抗癌试剂(例如，本文所述的化疗药物或试剂)和/或抗血管生成试剂(其非限制性的例子包括VEGF的抗体(例如，贝伐单抗(AVASTIN)、兰尼单抗(LUCENTIS))和血管生成的其它促进剂(例如，bFGF、促血管生成素-I))、a-v/0-3血管整联蛋白的抗体(例如， VITAXIN)、血管他丁、内皮他丁、达肝素(dalt印arin)、ABT-510、CNGRC多肽TNFa偶联物、环磷酰胺、康普瑞汀A4磷酸酯、二甲基咕吨酮乙酸(dimethylxanthenone acetic acid)、多西他赛、来那度胺、恩扎啕林、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定的纳米颗粒制剂(Abraxane)、大豆异黄酮(三羟异黄酮)、柠檬酸他莫昔芬、沙利度胺、ADH-I (EXHERIN)、AG-013736、AMG-706、AZD2171、甲苯磺酸索拉菲尼(sorafenib tosylate)、BMS-582664、CHIR-265、帕唑帕尼(pazopanib)、PI-88、伐他拉尼、依维莫司、苏拉明、苹果酸舒尼替尼(sunitinibmalate)、XL184、ZD6474、ATN-161、西仑吉肽和塞来考昔。此外，如本领域已知的，本发明的对象可接受与递送纳米颗粒组合的辐射治疗和/或外科治疗，还可接受化疗药物、细胞因子、激素和/或抗-血管生成试剂。在具体的实施方式中，将治疗有效量的纳米颗粒给予对象，该术语如本文限定的。可通过本领域已知的方法决定药学活性化合物的剂量，参见例如《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences,马克出版公司(Maack Publishing Co.),伊斯顿，宾夕法尼亚州)。任何特定纳米颗粒组合物的治疗有效剂量在一定程度上视具体的组合物和对象而有所不同，取决于对象的病症、特定纳米颗粒的组成和/或递送途径和/或频率。为给予/递送包含核酸的纳米颗粒，可采用为约IO9到约IO12个纳米颗粒/cm2 (例如，Iovcm2UO1Vcm2UO1Vcm2, IO1Vcm2纳米颗粒)的剂量范围。通过分光光度法分析或通过本领域已知的用于定量测定颗粒的任何其它方法来确定给定体积的载体或运载体(例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS);水凝胶等)中的纳米颗粒的数量。为给予/递送包含治疗药物的纳米颗粒，剂量范围可为约5 mg/m2到约200 mg/m2的纳米颗粒，或更具体地，约10 mg/m2到约100 mg/m2的纳米颗粒(例如，5 mg/m2、6 mg/m2、7 mg/m2、8 mg/m2、9 mg/m2、10 mg/m2、11 mg/m2、12 mg/m2、13 mg/m2、14 mg/m2、15 mg/m2、16 mg/m2、17 mg/m2、18 mg/m2、5 mg/m2、19 mg/m2、20 mg/m2、25 mg/m2、30 mg/m2、35 mg/m2、40 mg/m2、45 mg/m2、50 mg/m2、55 mg/m2、60 mg/m2、65 mg/m2、70 mg/m2、75 mg/m2、80 mg/m2、85 mg/m2、90 mg/m2、95 mg/m2、100 mg/m2> 125 mg/m2> 150 mg/m2> 175 mg/m2、200 mg/m2 的纳米颗粒)，这取决于所用的药物并可通过本领域标准方法来确定。用于给予/递送纳米颗粒的示范性剂量范围(使用mg/kg计)包括约2 mg/kg到约20 mg/kg的纳米颗粒，以及约5 mg/kg到约10 mg/kg的纳米颗粒的范围(例如,2 mg/kg、3 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、6 mg/kg、7 mg/kg、8 mg/kg、9 mg/kg、10 mg/kg、11 mg/kg、12 mg/kg、13 mg/kg、14 mg/kg、15 mg/kg、16 mg/kg、17 mg/kg、18 mg/kg、19 mg/kg、20 mg/kg的纳米颗粒)。为给予/递送本发明的p53嵌合体(例如，p53/p730D),示范性的剂量范围可以是约 1.0 mg DNA/kg 到约 10. 0 mg DNA/kg (例如，I. O、I. 5、2. 0、2. 5、3. 0、3. 5、4. 0、4. 5、5. O、
5.5、6. 0、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0、8. 5、9. 0、9. 5 或 10. 0 mg DNA/kg)。在本发明的
中，在各种时间间隔中可采用(例如，每小时、每天、每周、每月、每年等等)多于一次给药(例如，两次、三次、四次或更多次给药)以实现疗效和/或用于诊断目的。因此，在具体的实施方式中，本发明提供利用本发明纳米颗粒的各种方法。具体地，本文提供将纳米颗粒递送至细胞的方法，包括在一定条件下使所述细胞与本发明纳米颗粒接触，借此，纳米颗粒结合到细胞表面的葡萄糖转运蛋白并被细胞内在化。细胞可以是在体内(即，在对象内的细胞)，或者细胞可以在体外或离体。此外，本发明的细胞可以是癌细胞、癌前期细胞或肿瘤细胞。 本文还提供将活性剂递送至有此需要的对象中的肿瘤细胞的方法，包括将本发明的纳米颗粒递送至所述对象，借此，所述纳米颗粒结合肿瘤细胞表面的葡萄糖转运蛋白并被该肿瘤细胞内在化，从而将活性剂递送至肿瘤细胞。此外，本发明提供减小有此需要的对象中肿瘤的大小的方法，包括将有效量的本发明的纳米颗粒递送至所述对象，从而减小所述对象中肿瘤的大小。本文中还提供在有此需要的对象中诱导肿瘤消退的方法，包括将有效量的本发明的纳米颗粒递送至所述对象，从而诱导所述对象中的肿瘤消退。肿瘤消退可例如在非实体瘤癌症的癌症(例如白血病)和本领域熟知的其它“液体癌症”中测定。本发明还提供治疗对象(例如，有此需要的对象)中癌症的方法，包括将有效量的本发明的纳米颗粒递送至所述对象，从而治疗所述对象中的癌症。本发明还提供治疗对象(例如，有此需要的对象)中过度增生性疾病(例如，其中过度增生性细胞在细胞表面过度表达葡萄糖转运蛋白)的方法，包括将有效量的本发明的纳米颗粒递送至所述对象，从而治疗所述对象中的过度增生性疾病。如本文所用的，术语“癌症”指细胞的任何良性或恶性异常生长。本发明的癌症可以是原发性癌症和/或转移性癌症。例子包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、皮肤癌、胰腺癌、结肠癌、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、卵巢癌、脑癌(brain cancer)、原发性脑癌、头脖癌(brain-neck cancer)、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、肝癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、头或颈癌、乳粟、卵巢癌、肺癌、小细胞肺癌、维尔姆斯氏瘤、宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、泌尿生殖癌、甲状腺癌、食道癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、肾上腺癌、肾细胞癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、恶性胰胰岛素瘤、恶性类癌瘤、恶性合胞体瘤、蕈样肉芽肿病、恶性高钙血症、宫颈增生、白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、毛细胞白血病、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤、真性红细胞增多、原发性血小板增多症(essential thrombocytosis)、霍奇金病、非-霍奇金淋巴瘤、软组织肉瘤、成骨肉瘤、原发性巨球蛋白血症和视网膜母细胞瘤。本文还提供本领域已知的与突变型P53表型相关的任何癌症。如本文所用的，术语“对象”包括其中可实施本发明方法的任何对象。可按照本发明的方法向其递送本发明的纳米颗粒的对象包括出于医学目的(例如，治疗和/或诊断)的人对象和用于兽医学和药物筛选及开发目的的动物对象。在一些实施方式中，所述对象可以是禽类对象或哺乳动物对象(例如，狗、猫、马、牛、绵羊、山羊、灵长类动物、大鼠、小鼠、兔形动物、兔子、豚鼠、仓鼠等)，在具体的实施方式中，所述对象是人对象(包括男性和女性对象，还包括新生儿、婴儿、少年、青少年、成人和老年人，还包括怀孕对象)。在其它实施方式中，所述对象是癌症、肿瘤生长和/或其它过度增生性疾病的动物模型。“有此需要”的对象包括但不限于诊断有癌症或其它增生性疾病的对象，怀疑有癌症的对象、具有肿瘤的对象、怀疑有肿瘤的对象、患癌症或其它增生性疾病风险升高的对 象、可能患癌症的对象、可能具有肿瘤的对象等等。因此，此类对象是出于治疗和/或诊断的目的而需要和/或会受益于和/或希望对其给予或递送本发明的纳米颗粒的对象。如本文所用的，术语“治疗有效量”或“有效量”指赋予受某种状况(例如，失调、疾病、综合征、病症、损伤、创伤性和/或外科性伤口)折磨的对象调控作用的本发明的纳米颗粒和/或包含本发明的纳米颗粒的组合物的量，所述调控作用可以是例如有益作用，包括对象的状况(例如，一种或多种症状)的改善、该状况的进展的延迟或减慢、该状况的发作的防止或延迟、和/或某疾病或病症的临床参数、状态或分类的改变等等，如本领域熟知的。例如，治疗有效量或有效量可以指将对象中某状况改善(例如，