专利名称：一种应用环介导等温扩增技术快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒及检测方法 无乳链球菌(义agalactiae)也称B群链球菌(GBS)，是ー类广泛存在于自然界的革兰氏阳性菌，宿主范围广，对哺乳类、爬行类、两栖类及鱼类均可造成危害。自1958年日本在虹鳟{Oncorhychus mikiss)中首次获得链球菌病原后，鱼类链球菌病相继在多个国家流行。近年来在我国多发于养殖的罗非鱼，其感染性强，死亡率高，而且治疗困难，导致我国南方各地养殖罗非鱼爆发性死亡，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。目前已经建立的有关细菌病原检测的技术较多，如常规的生化检测方法，主要建立在生物化学中的快速专有酶反应和细菌代谢产物的检测技术；以免疫学为基础的检测方法如免疫学中的放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、荧光免疫分析(FIA)、时间分辨荧光免疫分析(TrFIA)、化学发光免疫分析(CIA)、生物发光免疫分析(BIA)等，足以检出临床标本中痕量的微生物抗原；以及以分子生物学为基础的核酸探针和聚合酶链式反应(PCR)分析。但这些方法或耗时长，或敏感性差、或特异性不强。GBS的PCR检测法，虽然在实验室条件下能对GBS进行相对快速、准确的检测，但由于常规PCR检测需要昂贵的PCR仪，凝胶电泳和成像系统等，这大大限制了 PCR检测方法在生产实际中的推广应用。因此开发简便快速、准确灵敏的检测GBS的新技术，加强苗种和不同规格鱼种的检疫以及养殖水体的检测，对预报预测，预防疫情感染，切断病原传播，保障我国罗非鱼产业链的健康持续发展具有重要意义。
本发明目的是，提供ー种罗非鱼无乳链球菌环介导等温扩增检测技术，以实现对罗非鱼无乳链球菌病的快速、灵敏、特异、简便的快速检测。环介导等温扩增法(LAMP)是ー种新型的核酸扩增方法，该方法对病原保守基因上的八个区域设计六条特异性引物，利用Bst DNA聚合酶在60-65°C进行恒温扩增30_60min，通过观察反应物浊度或结合染料颜色变化判定结果，该方法灵敏、快速、准确、简便，不需要昂贵仪器，成本低，可用于样品野外实地快速检测。本发明具体包括三个部分1.将法医分子鉴定用的chelex-100树脂结合水煮法用于快速提取罗非鱼无乳链球菌基因组DNA，大大简化并缩短操作时间的同时，保证了所提取DNA的质量；2.提供两对用于无乳链球菌LAMP快速检测的引物序列，依次命名为GBS-F3 ;GBS-B3 ;GBS-FIP ;GBS-BIP，长度分别为 21bp，18 bp，51bp，50 bp ；3.提供ー种罗非鱼无乳链球菌的LAMP快速检测方法，首先是快速简便的制备反应模版，并配置LAMP反应体系，然后通过LAMP反应程序对反应模版进行扩增，最后根据反应混合物显示的顔色对检测结果进行判读，如反应物显示绿色则表示该样品的GBS检测结果为阳性，若显示橙黄色、则表示该样品的GBS检测为阴性。上述两对LAMP引物序列(GBS-F3 ;GBS_B3 ；GBS-FIP ；GBS-BIP)分别与罗非鱼无乳链球菌促溶血因子基因上相应位置的核苷酸序列相同或互补，其序列如下GBS-F3: 5， -AGTAATAGCCTCATTAACCGG-3，;GBS-B3: 5’ -CTAGTGGCTGGTGCATTG-3’ ;GBS-FIP:5’ -GCTCAAAAGCTTGATCAAGATAGCTTTTCTGTTCCCTGAACATTATCTTTG-3’ ;GBS-BIP:
5’ - TTACTTGATTTACCACTTGTGGAGTTTTTTTCACCAGCTGTATTAGAAGT-3’ ;
本发明的无乳链球菌LAMP快速检测试剂盒由提取无乳链球菌基因组试剂和LAMP反应试剂组成
所述提取无乳链球菌基因组试剂组成chelex-100, Tris, EDTA, Tritonx-100 ； 所述LAMP反应液由反应液A和反应液B组成反应液A含有10XLAMP Buffer (200mMTris-Hcl, pH8. 8 ； 100 mM 氯化钾；100 mM 硫酸铵；20mM 硫酸镁和 l%TritonX_100)、BstDNA 聚合酶、dNTP、内外引物(GBS-FIP; GBS-BIP; GBS-F3; GBS-B3)、甜菜碱、超纯水。GBS-F3: AGTAATAGCCTCATTAACCGG;
GBS-B3: CTAGTGGCTGGTGCATTG;
GBS-FIP: GCTCAAAAGCTTGATCAAGATAGCTTTTCTGTTCCCTGAACATTATCTTTG;
GBS-BIP: TTACTTGATTTACCACTTGTGGAGTTTTTTTCACCAGCTGTATTAGAAGT;
反应液B为荧光染料。上述提取无乳链球菌基因组试剂5%chelex_100 CpH=IO. 4)包括5%chelex_100，10mmol/L Tris (ΡΗ=8· O), I mmol/L EDTA,1% Tritonx-IOO0上述LAMP反应试剂中Bst DNA聚合酶浓度为8U/ μ L、dNTP浓度为2. 5 mM、内引物(GBS-FIP; GBS-BIP )浓度均为20 μ M、外引物(GBS-F3; GBS-B3 )浓度均为20 μ Μ、甜菜碱浓度为5Μ。所述荧光染料为1000X SYBR Green I。本发明的试剂盒检测无乳链球菌的方法包括如下步骤
(1)取Iml无乳链球菌菌液，IOOOOrpm离心5min后弃上清，再用无菌水稀释至50μ L ;
(2)加入5%chelex-100复合液至总体积200ul，56°C孵育15_30min，剧烈震荡IOs ；
(3)转入100°C沸水中孵育8-10min，再剧烈震荡IOs；
(4)冰浴2η η,4· 条件下，12000rpm离心3min,吸取上清液作为模板备用；
(5)往两个装有23μ L的LAMP反应试剂的反应管中分别加入2 μ L上述模板和阳性对照核酸；
(6)将上述反应管置于65°C保温60min，然后置于80°C保温IOmin进行LAMP反应；
(7)结束后，在每个反应管中加入ZyLlOOOXSYBRGreen I，然后肉眼观察被测样品的LAMP反应产物，如反应物显示绿色则表示该样品的GBS检测结果为阳性，若显示橙黄色则表示该样品的GBS检测为阴性。本发明所提供的检测方法具有如下优点
(I)检测时间短1. 5-2h即可获得检测結果，比现有最快的PCR检测方法节省4_6h ；
(2)操作简单、结果明显整个检测过程不涉及复杂昂贵的仪器或设备，只需ー个水浴锅即可完成检测，检测结果可直接用肉眼观察；
(3)灵敏度高对罗非鱼无乳链球菌的检测极限可低至9个细菌，比普通PCR灵敏度高10倍以上。(4) 特异性强所用的特异性引物是根据罗非鱼无乳链球菌的促溶血因子基因中6个不同区域设计，特异性超过常规PCR。(5) 安全检测过程不涉及有毒试剂，不会对人和环境造成危害。总之，该方法解决了现有技术中检测无乳链球菌的方法所需周期长、灵敏度较低、操作复杂、现场应用困难等缺陷，可广泛用于兽医、水产、出入境检疫等领域。具体实施方法
实施案例
按下列配方制作无乳链球菌的环介导等温扩增检测试剂盒
I.配置无乳链球菌基因组提取试剂
(1)TEX (10mmol/L Tris [pH=8. O],lmmol/L EDTA,l%TritonX-100)
(2)利用TEX 配制 5% 的 chelex-100 (pH=10. 4)。提取无乳链球菌基因组
(1)取Iml无乳链球菌菌液，IOOOOrpm离心5min后弃上清，再用无菌水稀释至50μ L ;
(2)加入5%chelex-100复合液至总体积200μ L，56°C孵育15_30min，剧烈震荡IOs ；
(3)转入100°C沸水中孵育8-10min，再剧烈震荡IOs；
(4)冰浴2η η,4· 条件下，12000rpm离心3min,吸取上清液作为模板备用；
3.配置LAMP反应试剂
(1)反应液A: 2. 5μ L 10 X LAMP BufferU. 5μ L Bst DNA聚合酶(8U/μ L)、4 μ L dNTP(2.5 mM)、0. lyL*$_GBS-F3 (20μΜ)，0· lyL*$_GBS_B3 (20μΜ),0. 8μ L 内引物GBS-FIP (20μΜ)，0· 8μ L 内引物 GBS-BIP (20 μ Μ)、2· 5 μ L 甜菜碱(5Μ)、10· 7 μ L 超纯水。本发明两对LAMP引物序列(GBS-F3;GBS-B3;GBS-FIP;GBS-BIP)分别与罗非鱼无乳链球菌促溶血因子基因上相应位置的核苷酸序列相同或互补，其序列如下
GBS-F3:5， -AGTAATAGCCTCATTAACCGG-3， (2Ibp)
GBS-B3:5 ’ -CTAGTGGCTGGTGCATTG-3’( 18bp)
GBS-FIP:
5’ -GCTCAAAAGCTTGATCAAGATAGCTTTTCTGTTCCCTGAACATTATCTTTG-3’ ，
(51bp)
GBS-BIP:
5，-TTACTTGATTTACCACTTGTGGAGTTTTTTTCACCAGCTGTATTAGAAGT-3，
(50bp)
(2)反应液B:1000XSYBR Green I。无乳链球菌的环介导等温扩增及显色反应
(I)往两个装有23 μ L的LAMP反应试剂的反应管中分别加入2 μ L上述模板和阳性对照核酸；、(2)将上述反应管置于65°C保温60min，然后置于80°C保温IOmin进行LAMP反应；
(3)结束后，在每个反应管中加入2μL 1000 X SYBR Green I，然后肉眼观察被测样品的LAMP反应产物，如反应物显示绿色则表示该样品的GBS检测结果为阳性，即含有无乳链球菌，若显示橙黄色则表示该样品的GBS检测为阴性，即不含无乳链球菌。实施例I :本发明试剂盒在检测无乳链球菌中的应用效果之敏感性
(I) 样品罗非鱼无乳链球菌(原始浓度为9. IXlO8 cfu/mL )。(2)样品处理提取罗非鱼无乳链球菌DNA (原始浓度为27. O μ g/mL)，并将其做KT1-KT8的倍比稀释。(3)无乳链球菌LAMP检测试剂盒反应液A配制如下2· 5 μ L IOXLAMP Buffer、
I.5μ L Bst DNA 聚合酶(8υ/μ υ、4μ L dNTP (2.5 mM)、0. I μ L 外引物 GBS-F3 (20 μ Μ)，
O.lyL*$_GBS-B3 (20μΜ),0. 8μ L 内引物 GBS-FIP (20μΜ),0. 8μ L 内引物 GBS-BIP(20μΜ)、2· 5μ L甜菜碱(5Μ)、10· 7μ L超纯水
(4)无乳链球菌的环介导扩增反应
往两个装有23 μ L的LAMP反应试剂的反应管中分别加入2 μ L上述模板和阳性对照核 酸，将上述反应管置于65°C保温60min，然后置于80°C保温IOmin进行LAMP反应；
(5)扩增产物的显色反应
结束后，在每个反应管中加入2μ L 1000XSYBR Green I，然后肉眼观察被测样品的LAMP反应产物，如反应物显示绿色则表示该样品的GBS检测结果为阳性，若显示橙黄色则表示该样品的GBS检测为阴性。敏感性结果
试验结果表明采用本发明试剂盒最低能检测9个细菌/管，表明本检测方法具有很高的敏感性。实施例2:临床检测
(I)样品罗非鱼发病现场采集的罗非鱼无乳链球菌阳性样品5株和阴性样品12株(包括患病罗非鱼体分离的其他病原菌如海豚链球菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、浅绿气球菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌、乳酸杆菌、点状气单胞菌等)。利用5% chelex-100水煮法提取各样品的DNA
①取Iml无乳链球菌菌液，IOOOOrpm离心5min后弃上清，再用无菌水稀释至50μ L ;
②加入5%chelex-100复合液至总体积200μ L，56°C孵育15_30min，剧烈震荡IOs ；
③转入100°C沸水中孵育8-10min，再剧烈震荡IOs；
④冰浴2min,4°C条件下，12000 rpm离心3min,吸取上清液作为模板备用；
(3)对各样品进行LAMP反应及显色检测具体步骤如下
①往装有23μ L的LAMP反应A试剂的反应管中分别加入2 μ L上述各样品模板和阳性对照核酸；
②将上述反应管置于65°C保温60min，然后置于80°C保温IOmin进行LAMP反应；
③结束后，在每个反应管中加入2μ L反应液B即1000X SYBR Green I，然后肉眼观察被测样品的LAMP反应产物，如反应物显示绿色则表示该样品的GBS检测结果为阳性，即含有无乳链球菌，若显示橙黄色则表示该样品的GBS检测为阴性，即不含无乳链球菌。实验结果表明以上经过LAMP检测显示为阳性，均可通过其他生理生化及分子生物学方法检测无乳链球菌的存在；经过LAMP检测为阴性的，通过生理生化及分子生物学方法检测确认均不含无乳链球菌。以上结果表明本检测方法特异性強，检测结果准确可靠。

本发明涉及一种利用环介导等温扩增技术快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒及检测方法，可用于鱼类养殖场的病原检测。它公开了用于无乳链球菌LAMP检测的两对特异性引物，以及所述用途检测的试剂盒，所述试剂包括无乳链球菌基因组提取试剂，LAMP反应液，该反应液包括10×LAMPBuffer(200mMTris-Hcl，pH8.8;100mM氯化钾；100mM硫酸铵；20mM硫酸镁和1%TritonX-100)、BstDNA聚合酶、dNTP、内引物GBS-F3及GBS-B3，外引物GBS-FIP及GBS-BIP、甜菜碱、超纯水，荧光染料。本发明具有检测时间短、操作简单、结果明显、灵敏度高、特异性强、对人和环境安全等特点。