专利名称：一种发根农杆菌介导真空渗透辅助的大豆遗传转化方法大豆是重要的粮食作物和经济作物，但受各种病、虫害 及各种非生物逆境的影响，大豆的品质和产量难以满足人们的需求。大豆胞囊线虫病(soybean cyst nematode,简称SCN)，是由大豆胞囊线虫侵染引起的，是危害世界大豆生产最严重的病害之一，其特点是分布广、危害重、寄主范围广、传播途径多、休眠体(胞囊)存活时间长，是一种极难防治的土传病害。在我国东北和黄、淮、海大豆产区发生较普遍，一般可使大豆减产5% -10%，严重的可达30%以上，甚至绝产(刘维志，2000)。在生产上，目前对大豆胞囊线虫的防治主要是使用化学农药，但是这种单纯的使用化学防治会引发土壤微生物区系紊乱、使线虫的抗药性增强，因此使人们越来越关注化学农药的残留和对环境污染的问题。近年来，现代分子生物学的技术在对植物病虫害的防治中展现出了很好的发展前景。利用基因工程的方法对大豆进行抗病虫品种的培育是非常有必要的，同时对大豆遗传转化的条件进行进一步的优化也有利于遗传转化效率的提高，意义重大。Bt基因是最早应用于抗虫基因工程的抗虫基因。苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,简称Bt)是一种分布极其广泛的革兰氏阳性细菌,在芽孢形成的过程中可以形成伴胞晶体，此晶体具有杀线虫的作用，是目前世界上应用最为广泛的生物杀虫剂。1990年，Perlak等(1990)获得了转Bt基因的棉花。在此之后，转基因抗虫水稻也相继获得成功。Stewart等(1996)将合成的Bt基因利用基因枪轰击的方法来轰击悬浮培养体细胞胚，获得转基因大豆株系。后期，人们开始尝试用具有非竞争性结合关系的复合Bt基因或用Bt基因与其它抗虫基因构建的复合杀虫基因载体来转化大豆，得到相应的转基因植株。基因工程的方法能够使我们将有益目的基因定向地转移到农作物中，使农作物达到提高抗性和改良品质的目的。但是相对于水稻、烟草等作物来说，大豆的高效遗传转化一直是植物基因工程领域的难点之一，自Hinchee等(1988)和McCabe等(1988)分别用两种方法转化大豆成功得到转基因植株以来，虽然也相继有关于此方面的报告，但是突破性的进展却很少见到报告。具体来说最重要的一点就是转化效率没有显著提高。尽管目前转基因大豆已在全球大面积种植，但其遗传转化仍局限于根癌农杆菌介导的子叶节转化系统、基因枪介导的体细胞胚转化系统、胚悬浮培养转化系统等方法。这些转化系统普遍存在嵌合体频率高、受基因型限制、转化系统稳定性较差等问题，限制了转基因材料的批量创制和候选基因育种应用价值的快速评价。目前应用较为广泛的是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)两种。它们的寄主非常广泛,且为革兰氏阴性菌；在普通情况下，能通过原有的或后天制造的伤口来感染植物细胞，且分别能够形成冠瘿瘤和生出毛状根。根癌农杆菌中含有Ti质粒(Tumor-inducing plasmid),它与肿瘤诱导有关。这种Ti质粒可以使T-DNA转移到植物的细胞中并整合进植物的基因组中得以表达，从而导致冠瘿瘤的发生，而且这些整合进植物基因组的T-DNA片段又可以通过减数分裂的方式传递给子代(贾士荣等，1994)。发根农杆菌与根癌农杆菌不同的是它含有Ri质粒，该质粒上包括能够使发根瘤自主生长并且使冠瘿碱合成的基因。含有Ri质粒的T-DNA通过伤口侵入植物的茎基部，使不定根和侧根大量发生，进而使目的基因整合入植物的基因组中，从而稳定表达，出现毛状根(Chilton et al,1982)。与根癌农杆菌相比,发根农杆菌Ri质粒诱导形成的毛状根，生长速度快，生长条件可以人为控制且遗传上稳定，因而可以作为研究作物根部寄生的病虫害病理的良好材料，毛状根系统在研究与根系相关的理论 中也是理想的实验系统。因此，自从Ri质粒被人们发现并认识以来，发根农杆菌现已被广泛应用于植物基因工程、植物次生代谢产物生产、植物品种改良和植物栽培等领域，为人类生产作出了巨大贡献，具有极其重要的研究价值和广阔的应用前景(杜曼等，2005)。Ackermann(1973)首次利用发根农杆菌进行高等植物的转化，并获得了成功。发根农杆菌转化植物产生毛状根的方法很多，大体包括直接接种法、外植体共培养法和原生质体共培养法。直接接种法，将植物种子消毒后萌发长出无菌植株，在茎叶上划出伤口，将发根农杆菌通过注射或涂抹的方法直接接种在无菌植株伤口处，继续培养一段时间后，在植株接种部位诱导产生毛状根(王关林等，2002 ;王秀荣等，2009 ;张艳馥等，1997 ；)。该方法最简便，王莉等(2002)将菌液直接向何首乌无菌苗的茎杆、叶、叶柄处多次注射诱导得到毛状根。Van de Velde等(2003)和Rodriguez-Llorente等(2003)用新鲜菌液分别直接注射接种田菁和截型苜蓿无菌幼苗下胚轴，诱导出相应的毛状根。向太和等(2011)利用农杆菌直接侵染刺伤的黄瓜子叶节下方诱导形成毛状根，建立了一种植物根系相关功能基因研究模型的构建方法。涂抹法常用于毛状根无菌条件下的诱导，Boisson-Dernier等(2001)和Uhde-Stone等(2005)将萌发的截型苜蓿和豌豆的种子切除3mm的胚根，切口用发根农杆菌菌斑涂抹侵染得到相应的“复合植株”。在大豆的遗传转化研究中，Kereszt (2007)利用菌液直接针刺接种生长在基质中的大豆幼苗的下胚轴，得到了大豆的“复合植株”。王秀荣等(2009)首次将发根农杆菌介导的下胚轴涂抹转化方法应用于大豆，成功地进行了大豆根部毛状根转化。刘艳菊(2010)和王敏娟等(2011)利用发根农杆菌介导的子叶节转化体系，分别向大豆根系导入Bt基因和GmNHXl基因进行了大豆抗蛴螬和耐盐性的研究。尽管目前尚不能利用该系统获得可遗传的大豆转基因植株，但可批量获得转基因发状根和复合体转基因植株，用于基因功能的快速验证，评价其在大豆育种中的利用价值。自Bechtold等(1993)建立了整株原位真空渗入遗传转化方法后，该方法作为农杆菌介导遗传转化的一种辅助手段，在拟南芥、白菜、油菜等的遗传转化中应用广泛(Tjokrokusumo et al, 2000 ;曹传增等，2003 ;张燕红等，2008)。赵东利等(2002)在转化苦豆子时发现，采用真空渗透方法可有效提高发根农杆菌对苦豆子的转化频率。在大豆的遗传转化研究中，武天龙等(2002)采用发根农杆菌分别转化大豆腋芽分生组织区和茎尖的方式，在感染过程中采用真空渗透的方法，提高了大豆的遗传转化率。利用真空渗透辅助的发根农杆菌介导的抗线虫基因转化的方法则尚未见报道
本发明的目的在于克服现有大豆遗传转化效率较低的难点，提供一种发根农杆菌介导真空渗透辅助的抗线虫基因转化大豆的方法以及其应用。本发明公开了一种利用发根农杆菌介导的真空渗透辅助的抗线虫基因转化大豆的方法。本发明首次将发根农杆菌介导的真空渗透辅助的转化方法应用到大豆，并成功地进行了大豆根部毛状根转化。本发明先将大豆种子消毒后种植在无菌蛭石萌发，在下胚轴上端造成表皮分生细胞损伤，再进行真空条件下 发根农杆菌侵染，进行遗传转化，获得含有抗线虫BT基因的大豆转基因毛状根。本发明采用发根农杆菌介导Bt基因转化大豆下胚轴的方式，在大豆转化过程中辅助采用真空渗透法，在外植体上制造伤口，可充分提高农杆菌入侵的机会，可明显提高农杆菌的感染效率，并有效提高大豆的转化率。为实现这样的目的，本发明的技术方案中，采用发根农杆菌转化大豆下胚轴的方式，在大豆转化过程中辅助采用真空渗透法，来达到提高转化率的效果。本发明先将大豆种子消毒后种植在无菌蛭石里萌发5d，在下胚轴上端造成表皮分生细胞损伤，再进行真空条件下发根农杆菌侵染，进行遗传转化，获得含有抗线虫Bt基因的大豆转基因毛状根。本发明一种发根农杆菌介导真空渗透辅助的大豆遗传转化方法，包括下列步骤I.大豆种子的基因型选用、消毒和萌发，具体包括I. I大豆种子的基因型选用“吉豆2号”，且需挑选发育饱满无病害的；I. 2用常温氯气熏蒸法，其中氯气由100ml5. 24% NaCI0+3. 5mll2mol / L HCI产生，置于干燥器中熏蒸14h进行灭菌；I. 3在超净工作台中取出无菌大豆，接于无菌湿蛭石表面下方l-2cm处，用保鲜膜封盖;I. 4置于25°C暗培养室中进行诱芽的培养，5d后，以备进行发根农杆菌侵染；2.含有抗线虫Bt基因的发根农杆菌K599菌液的制备，具体包括2. I将包含植物双元表达载体pBI121_Bt06的发根农杆菌K599，在固体LB平板上划线，28°C倒置培养48h ;所述的包含植物双元表达载体pBI121-Bt06的发根农杆菌菌株K599是通过常规的农杆菌冻融法将pBI121-Bt06质粒转入发根农杆菌K599感受态细胞获得。2. 2挑取单菌落于5mL液体LB培养基中，220rpm、28°C振荡培养24h ；2. 3按I :10的比例将摇好的菌液加入到50mL液体LB培养基中，220rpm、28°C振荡培养3-6h，使菌液0D_达到I. 3 ；2. 43000rpm离心IOmin,弃上清，沉淀重悬浮于侵染液中MSB+100 y mol/L As,PH5. 4，使其0D_稀释至0. 5，备用；3.发根农杆菌介导的大豆转化，具体包括3. I在萌发的大豆种子的下胚轴的上端，用解剖刀划伤后放至制备好的农杆菌侵染液中，在0. 06-0. 08MPa真空压力条件下侵染10_20min，同时以无菌水作为对照；3. 2将侵染后的大豆移至花盆中，并用灭菌的混蛭石将其覆盖，25°C、12h光照，保持湿度在75%以上，温室培养2-3周，培养期间每天用无菌的B&D溶液浇灌植株，其中B&D溶液是由 500 u L SolutionA, 500 u L Solution B, 500 u L Solution C, 500 u L Solution D组成，其中包含0-2mmol/L硝酸钾作为氮源,Solution A为2mol/L 二水合氯化|丐，SolutionB 为 lmol/L 憐酸二氧钟，Solution C 为 20mmol/L 朽1 樣酸铁，Solution D 为 0. 5mol/L 硫酸镁、0. 5mol/L硫酸钾、2mmol/L硫酸猛、4mmol/L硼酸、lmmol/L硫酸锌、4mmol/L硫酸铜、0. 2mmol/L 硫酸钴、0. 2mmol/L 钥酸钠；3. 3当根长到5-lOcm时，将新发出的根以下Iem处的初生根切去，并将植株移到新的花盆中，用湿蛭石复盖后，置于温室继续培养；4.转基因根的组织化学染色分析4. I取侵染后新发出的大豆根部和对照 的根部，分别与X-Gluc染色液混合培养，避光37°C放置过夜；所述的X-Gluc染色液的配方为3mg/ml X-gluc、50mM PH=7. 0的磷酸钠缓冲溶液、IOmM EDTA、0. 5mM铁氰化钾、0. 5mM亚铁氰化钾、0. 1% TritonX_100、10 %甲醇；其中的X-gluc为5-溴-4-氯-3-吲哚-P -D-葡糖苷酸，其中的百分比为体积百分比。4. 2弃去染色液，用25%、50%、75%和100%酒精浸泡进行脱色，观察并拍照记录⑶S的表达情况，其中的百分比为体积百分比；5.转基因根的PCR检测5. I根据Kan序列对其设计引物如下上游序列5’ -TTGGGTGGAGAGGCTAITCG-3’下游序列5’ -TATCACGGGTAGCCAACGCT-3’5. 2用CTAB法提取生长旺盛的毛状根的DNA，以DNA为模板对Kan基因进行PCR扩增，若PCR扩增出预期大小为641bp的目的条带，与预计大小一致，测序验证为Kan基因序列，而野生型根未能扩增出任何条带，表明获得的毛状不定根为转基因不定根。本发明首次将发根农杆菌介导的真空渗透辅助的转化方法应用到大豆，并成功地进行了大豆根部毛状根转化；本发明先将大豆种子消毒后种植在无菌蛭石萌发，在下胚轴上端造成表皮分生细胞损伤，再进行真空条件下发根农杆菌侵染，进行遗传转化，获得含有抗线虫BT基因的大豆转基因毛状根。实施本发明能充分提高农杆菌入侵的机会，可明显提高农杆菌的感染效率，有效提高大豆的转化率。图I为发根农杆菌侵染大豆下胚轴诱导产生的毛状根照片图2为转基因毛状根的⑶S组织化学染色照片图I和图2中T为发根农杆菌侵染诱导产生的毛状根；CK为清水对照的毛状根图3为转基因毛状根的PCR检测照片其中1.野生型大豆；2和3.转基因毛状根；M. DNAMarker花盆中，用湿蛭石盖好后，置于温室继续培养。通过对大豆无菌苗的下胚轴进行侵染，培养2-3周后，侵染位点所发出的根均无明显的向地性，而且观察发现用带有目的片段菌液侵染的部位所发出的根要多于用无菌水侵染的植株所发出的根，侵染的外植体下胚轴基部膨大或者产生黄绿色疏松的愈伤组织，从组织中长出毛状根，而对照只在基部产生根(图I)，当植株新发出的根达到5-lOcm时，切去主根,继续培养。4.转基因根的组织化学染色分析取侵染后新发出的大豆根部和对照的根部，分别与X-Gluc染色液混合培养，避光37°C放置过夜。弃去染色液，用25%、50%、75%和100%酒精浸泡进行脱色，观察并拍照记录⑶S的表达情况。X-Gluc染色液的配方3mg/ml X-gluc (5_溴_4_氯_3_卩引哚-0 -D-葡糖苷酸)、50mM磷酸钠缓冲溶液(PH=7. 0)，IOmM EDTA，0. 5mM铁氰化钾、0. 5mM亚铁氰化钾、0. I %TritonX-100,10%甲醇，其中的百分比为体积百分比。对大豆下胚轴侵染培养后，将主根剪掉温室培养1-2个月，使新发出的根能足够支撑整个植株生长。将毛状根剪下，用⑶S染色液进行组织化学染色。结果发现，转化后的毛状根部有明显的蓝色，而用无菌水侵染的根部呈无色，所以可初步认为转化成功(图2)。5 转基因根的PCR检测根据Kan序列对其设计引物如下上游序列5’ -TTGGGTGGAGAGGCTAITCG-3’下游序列5’ -TATCACGGGTAGCCAACGCT-3’用CTAB法提取生长旺盛的毛状根的DNA，以DNA为模 板对Kan基因进行PCR扩增。由结果可知，PCR扩增出的条带约641bp (图3)，与预计的Kan基因大小相符，测序结果也与Kan基因相一致。而同时野生型并无该条带，因此可初步认定扩增出以上片段的毛状根为阳性。通过步骤4和5发现，本发明中由发根农杆菌感染的部位所产生的毛状根中，约有80%是转化根，仅有20%是正常根。


一种发根农杆菌介导真空渗透辅助的大豆遗传转化方法属分子生物学与基因工程技术领域，本发明包括的步骤大豆种子基因型选用、消毒和萌发；含有抗线虫Bt基因的发根农杆菌K599菌液制备；发根农杆菌介导的大豆转化；转基因根的组织化学染色分析；转基因根的PCR检测。本发明首次将发根农杆菌介导的真空渗透辅助转化方法应用到大豆，并成功进行了大豆根部毛状根转化；本发明先将大豆种子消毒后种植在无菌蛭石萌发，在下胚轴上端造成表皮分生细胞损伤，再进行真空条件下发根农杆菌侵染，进行遗传转化，获得含有抗线虫BT基因的大豆转基因毛状根，实施本发明能充分提高农杆菌入侵的机会，可明显提高农杆菌的感染效率，有效提高大豆的转化率。