专利名称：一种通过发根农杆菌介导提高枣树对枣疯病抗性的方法率疯病(Jujubewitches’ broom disease, JWB)是由植原体(Phytoplasma)引起的毁灭性检疫病害。枣疯病在整个植株上表现为丛枝、黄化和花、叶、根的畸变。病枝症状表现为丛生、纤细、节间缩短，丛枝是由于患病后芽的异常萌发和花器返祖所致。枣疯病发病时，一般从花期开始先在局部枝条上表现症状，然后逐步扩展至全株。枣树发病后很快失去结果能力，大部分3年左右即整株枯死。全国毎年因枣疯病死树逾千万株，年直接经济损失高达数亿元。枣疯病已成为危及枣产业发展的重大问题，迫切需要解決。 枣疯病的防治可以采取选育抗病品种、刨除病树、手术治疗、药物治疗、防治传病 昆虫、热处理茎尖组织培养脱毒等多种措施。其中，选育抗病品种是防治枣疯病最经济有效的措施。然而，枣花小、人工去雄难、坐果率低且胚败育现象严重，开展传统的杂交育种困难重重。随着生物技术的不断发展，基因工程日益成为现代植物改良育种的有效手段。农杆菌介导法是目前使用最多、机理最清楚、技术最成熟、成功实例最多的ー种遗传转化系统，也是植物基因工程中最重要的一种转化系统。前期研究表明，感染枣疯病的病树和病枝中生长素(IAA)含量明显少于健树和健枝，细胞分裂素(CK)的含量显著高于健树和健枝，提出CK/IAA比值高低与枣疯病发病程度密切相关，CK/IAA比值小时枣树表现正常，过大则表现疯长，人为改变CK/IAA比值可以使枣疯病症状表现出“康复”现象。而发根农杆菌的农杆碱型め·质粒TR-DNA上有生长素合成基因tmsl和iffis么指导生长素IAA的合成。本专利巧妙利用发根农杆菌侵染感染枣疯病的枣树组培苗(以下简称疯组培苗)，使得疯组培苗自身可以更多的产生IAA，从而降低疯组培苗体内的CK/IAA，最终转为正常苗。
本发明建立了ー种通过发根农杆菌介导提高枣树对枣疯病抗性的方法。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是以感染疯组培苗的茎段为材料，用发根农杆菌进行侵染，在再生出的组培苗中筛选转健组培苗，然后继续培养脱菌，对转健组培苗进行分子检测确定转化苗，利用微嫁接技术对转化苗的抗病性进行检测验证，最終得到对枣疯病抗病性显著提高的枣树抗性苗。本发明的具体内容，即通过发根农杆菌介导提高枣疯病抗性的具体方法如下 ⑴发根农杆菌侵染疯组培苗将疯组培苗嫩茎剪成长约Icm的茎段，用0D_为O. 6-1. O的发根农杆菌侵染5-15min，然后转入共培养基MS+5. 5g/L琼脂+30g/L蔗糖+200 μ Mこ酰丁香酮(ム5)( !1值5.8)中共培养3-7(1，再转入培养基1^+5· 5g/L琼脂+30g/L蔗糖+100mg/L头孢曲松钠(CRO) (pH值5. 8)中，在25±2°C，光照/黑暗为14/10h的条件下培养60d，筛选出枣疯病症状消失的转健苗； ⑵转健苗的脱菌继代将转健苗转入添加CRO 50-100mg/L的MS+5. 5g/L琼脂+30g/L蔗糖+0. 2mg/L BA+0. lmg/L IBA (pH值5. 8)培养基中继续培养，每20d换一次培养基，并逐渐降低CRO的浓度，直到最后转健苗完全脱除发根农杆菌，获得脱菌转健苗； ⑶脱菌转健苗的分子检测提取脱菌转健苗的基因组DNA进行rWC、rolD、tms基因PCR检测和枣疯病病原体的检测，筛选出携带发根农杆菌tms基因而不携带枣疯病病原体的发根农杆菌转化苗； ⑷发根农杆菌转化苗对枣疯病的抗性鉴定采用组培反向劈接微嫁接方法，即在超净工作台上，将待鉴定转化苗茎段的下端劈开，插入作为砧木的疯组培苗中，使砧木和接穗的形成层贴合，嫁接口外部绑缚灭过菌的铝箔，使之固定，随后将嫁接苗转入嫁接培养基上进行培养，嫁接苗培养基为MS+30g/L蔗糖+8g/L琼脂(pH值5. 8)，观察嫁接苗生长和发病情况，不发病的转化苗说明其抗性得到了提高，即为抗性苗。本发明专利的有益效果是，通过发根农杆菌的侵染，最終获得了抗病性提高的枣组培苗。方法简单并且容易操作，可在几个月内就获得抗病性提高的枣组培苗，和大田育种需要多年才能获得抗病性植株相比，试验不受环境条件的影响，可控性强，省时省力。


图I冬枣疯组培苗
图2冬枣疯组培苗茎段的再生疯苗(作为对照)
图3冬枣疯组培苗的茎段经过发根农杆菌侵染后再生出的转健苗 图4分子检测后得到的不携带枣疯病病原体的转化冬枣苗 图5以冬枣健康苗为接穗、冬枣疯组培苗为砧木的微嫁接验证(作为对照)
图6对照在微嫁接45d后表现疯症，丛枝、茎变细弱、叶片变黄图7以不携带枣疯病病原体的冬枣转化苗为接穗、冬枣疯组培苗为砧木，进行微嫁接验证其抗病性
图8微嫁接45d后，作为接穗的不携带枣疯病病原体的冬枣转化苗仍保持健康苗状态。



一种通过发根农杆菌介导提高枣树对枣疯病抗性的方法，以感染枣疯病的枣树组培苗的茎段为材料，用发根农杆菌进行侵染，在再生出的组培苗中筛选转健组培苗，然后继续培养脱菌，对转健组培苗进行分子检测确定不携带枣疯病病原体的转化苗，利用微嫁接技术对转化苗的抗病性进行检测验证，最终得到对枣疯病抗病性显著提高的枣树抗性苗。该方法简单易行，可在几个月内就获得对枣疯病抗性显著提高的枣组培苗。