用于农杆菌介导的丝状真菌遗传转化的剪膜器的制造方法 [0002]根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化是近年建立起来的一种新方法，该方法已经成为真菌菌种改良、新基因标记及目的基因筛选、分离和克隆的重要方法之一。与PEG、基因枪等真菌转化体系相比，该遗传转化技术具有方法简单、材料易得、转化效率高以及转化子中T-DNA单拷贝插入比例高等特点，同时，该方法获得的突变体遗传稳定，T-DNA插入位点克隆非常方便，解决了传统转化方法的瓶颈。目前，利用该方法已成功实现了多种真菌高通量突变体库的构建，且在各类真菌突变体库构建的基础上，开展了相关基因的筛选和功能基因的研宄。随着不同丝状真菌遗传研宄的进行，农杆菌介导的真菌转化会得到更加广泛的应用。 [0003]丝状真菌遗传转化一般要经过以下几个步骤:农杆菌活化及其诱导培养-农杆菌与丝状真菌二者共培养转化-转化子的筛选-转化子获得与鉴定。其中，转化子的筛选是获得转化子极其重要的一个环节，这一步骤的效率，直接影响着转化子的数量和质量，从而决定着下一步研宄。真菌属于微生物，在一张转化膜上转化效率从几个到上百个数量不等，由于转化过程中，T-DNA插入位点的多样性、T-DNA插入时间差异等，决定着突变体之间生长、发育和物质能量代谢的差异，同时，有些丝状真菌在营养生长的同时，进行着生殖作用，就会产生孢子等繁殖体，这些繁殖体具有稳定的抗性，因此，这一步骤的处理效率、处理质量决定着获得转化子的多少及其转化子的有效性。 [0004]目前，农杆菌介导的丝状真菌遗传转化和转化子的筛选一般是农杆菌与丝状真菌混合物均匀涂布在透性膜玻璃纸或硝酸纤维素膜(称为转化膜)上，共培养转化48h后，转化膜剪成条状，均匀地放置到含有相应抗生素筛选平板上。由于这个过程中，一般有两个人共同操作完成，其中一个人负责剪膜，另一个人负责辅助展开转化膜及其摆放膜条，而且需要用到剪刀、多个镊子，操作过程会出现多种问题，如下: [0005]1.农杆菌介导的丝状真菌遗传转化，转化效率非常高，一张大小约4cmX 5cm的膜上，出现几十个甚至上百个转化子，有的转化子还可能产生孢子等繁殖体，双人操作，且必须悬空操作，膜的震动性大，多个镊子剪刀，且较长时间接触转化膜，容易出现外源污染或交叉污染，导致转化子出现“双胞胎”和“多胞胎”现象； [0006]2.若是玻璃纸转化膜，由于其含水量较少，在超净工作台上，风速相对较大，操作时间较长，玻璃纸容易风干卷曲，风干卷曲的膜，不利于剪膜，同时，卷曲的膜条可能多处悬空不能够接触筛选培养基，导致因营养缺乏而转化子无法生长，这直接影响到转化子的获得，也给转化子的筛选带来很大的限制； [0007]3.在剪膜过程中，由双人操作完成，由于膜在悬空进行，稳定性差，且滞留时间较长，长时间操作容易疲劳，剪切膜条之间均匀性差，膜条宽窄不一，在筛选培养基上放置不均匀，不能有效利用筛选培养基；
[0008]4.费工费时，效率低下。目前进行农杆菌介导的丝状真菌遗传转化，共培养后进行转化子筛选，需要转移在转化膜到一新的筛选培养基上，在此过程中，通常转化膜需要剪切成条状，这需要双人合作才能完成，工作效率较低。
[0009]因此，探索一种在转化子筛选过程中，有效减少污染、操作方便、高效、有效利用培养皿空间，同时提高转化子收获的数量与质量的途径，是丝状真菌转化子筛选过程中的一种当务之急。



[0010]针对上述问题，本实用新型提供了一种用于农杆菌介导的丝状真菌遗传转化的剪膜器，该剪膜器可一人操作、剪切均匀、应用广泛。
[0011]本实用新型技术方案如下:
[0012]设计一种用于农杆菌介导的丝状真菌遗传转化的剪膜器，包括手持部和刀头，所述刀头包括一个由前边、后边和刀刃组成的三角形，且前边与刀刃的夹角为40?50°，后边与刀刃的夹角为25?35° ;所述手持部与所述刀头的后边连接，并与所述刀头的前边平行设置。
[0013]优选的，所述刀头还包括一个柄部，该柄部与后边固定连接，并与前边平行设置；所述手持部与该柄部活动连接。
[0014]更优选的，所述手持部的一端设置有夹持装置(便于更换刀头)，该夹持装置与所述柄部活动连接。
[0015]更优选的，所述夹持装置为与所述柄部匹配的螺栓紧固装置。
[0016]优选的，所述前边与刀刃的夹角为45°，后边与刀刃的夹角为30°。
[0017]优选的，所述手持部与所述刀头的前边对齐设置。
[0018]优选的，所述刀头为片状，所述手持部为柱状。
[0019]优选的，所述手持部上设置有橡胶或皮制防滑套。
[0020]优选的，所述刀头由不锈钢材料制成。
[0021]本实用新型具有积极有益的技术效果:
[0022](I)利用本实用新型剪膜，改变了传统的转化膜剪切方式，可进行单人操作，使用简单，剪膜效率高，时间短，在剪切过程中不需要剪刀、镊子等辅助工具，与外源物质接触少，无交叉污染和外源污染，克服了丝状真菌遗传转化过程中长期以来剪膜困难的技术难题。
[0023](2)应用本实用新型，可在培养基上直接切割转化膜，培养基起到支持作用，不用悬空操作，受力均匀，不宜疲劳，而常规的双人操作剪膜后必须立即放置，剪膜过程中不能够停止。应用本实用新型的单人剪膜操作不受这个限制，中间可以停止，放置转化膜时也可以中间休息，劳动强度大大降低。
[0024](3)应用本实用新型进行膜剪切能避免膜震动，转化膜剪切后平整均匀，能紧贴筛选培养基，使其得到有效利用，转化效率得到大大提高。
[0025](4)本实用新型结构简单，制作成本低廉，其应用广泛，使用范围在农杆菌介导的丝状真菌转化的整个过程中。




[0026]图1为本实用新型剪膜器结构示意图；
[0027]图2为本实用新型剪膜器的刀头结构示意图。
[0028]图中，I为手持部、2为刀头、3为夹持装置、4为防滑套、5为前边、6为后边，7为刀刃，8为柄部。


[0029]为了使本实用新型的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本实用新型进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本实用新型，并不用于限定本实用新型。
[0030]实施例1:一种用于农杆菌介导的丝状真菌遗传转化的剪膜器，参见图1、2，包括手持部和刀头(由不锈钢材料制成)，所述刀头包括一个由前边、后边和刀刃(长18mm)组成的三角形和一个柄部(宽2mm)，前边与刀刃的夹角为45°，后边与刀刃的夹角为30°，这两种角度参数的设置，便于在培养皿中利用刃尖灵活的进行切割，柄部与后边固定连接(在本实施例为一体结构)，并与前边平行并对齐设置。在所述手持部的一端设置有夹持装置，该夹持装置通过螺栓紧固方式与所述柄部活动连接。所述刀头为片状，所述手持部为柱状，手持部上设置有橡胶防滑套。农杆菌介导的丝状真菌遗传转化一般采用透性玻璃纸和硝酸纤维素膜作为转化膜，本实用新型剪膜器的使用方法如下:
[0031]1.剪膜器消毒:沾少许酒精，在酒精灯快速燃烧杀菌，确保剪膜器无菌化；
[0032]2.转化膜二分法剪切:农杆菌介导的丝状真菌转化，一般使用直径为9.0 cm的培养皿，在5cmX4cm的矩形转化膜实现共转化；共转化结束后，采用二分剪切法剪切转化膜，第一刀沿5cm边中线切开，依次再取中线切开，如此经3级切割，最后切成宽度约为0.6cm条膜；
[0033]3.膜条摆放:共转化膜剪切完成后，用无菌镊子轻轻放置膜条于另一个适当抗生素的筛选培养基上，膜条之间保持1.0cm的距离，且膜条均匀分布于筛选培养基上，为转化子的生长提供足够的空间，以利于转化子的挑选。