专利名称：超声波辅助花粉介导植物转基因方法转基因技术能够使优良基因跨物种交流，从而实现对农作物的品质和产量等性状 进行定向、精确的改良。转基因作物在产量、抗逆性和营养品质等方面较传统作物有显著改 进，还能大大降低生产成本，减少农业生产中的环境污染。但目前大面积应用到农业生产 中的转基因作物品种只有玉米、大豆、油菜、棉花、番茄等少数几种作物，对绝大多数植物而 言，转基因技术还只停留在实验室阶段。目前植物转基因研究主要采用的两种经典方法，一 是农杆菌介导法；二是基因枪轰击法。这两种方法都需要经过冗长繁琐的植物组培过程， 需要花费大量的人力、物力、财力和时间。一些植物种或品种的组织培养再生困难而使得这 两种方法具有很大基因型依赖性，因而受到很大的局限。同时由于植物组织培养过程中易 造成体细胞变异、再生苗移栽过程中夭亡等，使本已不高的转化率又大打折扣，这些缺陷都 大大限制了植物转基因技术的广泛应用。其他一些植物转基因方法，如，脂质体法、PEG法、 电激法、显微注射法、超声波法、离子束介导法、激光微束穿孔法、碳化硅纤维法等，虽然都 有成功的报道，但均因操作繁琐或效率较低等原因而很少有人使用；因此简化植物转化方 法是不少相关研究人员的努力方向。由周光宇提出的花粉管通道法已在我国得到了一定的 应用，并用该法培育出一些转基因株系或品种。该法的最大优点是不依赖组织培养和植株 再生过程，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。其主要缺点是 转化效率低，后期需要对大量的转化处理后代进行筛选。迄今，植物基因工程的“瓶颈”问 题仍然是植物转基因方法。孙毅等发明了一种“利用超声波处理花粉介导植物基因转化方 法”(中国专利号99121152. 9)，该发明使用超声波细胞粉碎仪以200—300W功率的超声波 处理花粉悬浮液，花粉为新鲜花粉，溶液为5—15 %蔗糖溶液加入不低于40 μ g/L外源DNA， 超声波每次处理5秒，间隔10秒，共处理5—8次，收集超声波处理后的花粉授于植物柱头 上，并从受体上收获种子，在后代中筛选转化植株。该方法不需经过冗长繁琐的组织培养过 程，具有简便、有效、快速和经济等特点，因此实用性强，能够与常规育种方法有机结合被广 大作物育种工作者直接应用。但该方法的主要缺点之一是授粉后结实率较低，这显然是由 于经过超声波处理的花粉大多数丧失了生活力，无法正常完成受精过程。因此，提高结实率 是使该方法具有更广泛应用前景的关键。
本发明目的是克服上述已有技术的不足，提供一种可显著提高超声波处理花粉授 粉后植株的结实率、进而提高每次处理获得的转化体数的超声波辅助花粉介导植物转基因 方法。实验发现，在经过通气和低温预处理的蔗糖溶液及整个处理花粉过程的冰浴操作 可以有更高比例的花粉粒保持活力，因而将处理花粉授到植物柱头(玉米花丝)上，可以获3得更高的结实率。而且采集新鲜花粉，低温(0—4°C)干燥条件下保存以及在2 48小时 之间使用均有利于保持花粉活力。本方法是以携带外源基因片段的农杆菌Ti质粒、大肠杆菌质粒或其它DNA载体为 基因供体，以植物的雄配子体花粉为受体，在植物传粉受精过程中通过超声波辅助处理花 粉介导基因转移。利用超声波的瞬间释放高能和空化作用，先将外源DNA导入植物花粉中， 之后再随着花粉管的生长进入到植物雌配子体胚囊中，并进而参与合子的形成，最终整合 到目标植物基因组中。取新鲜花粉在经过通气和低温处理的、5_50%的蔗糖溶液中与DNA 片段混合，通过超声波辅助作用使外源基因进入花粉中；然后将花粉悬浮液略微静置后倒 掉上清液，进而用细刷或毛笔将沉淀的处理花粉授到植物雌蕊柱头上，并在籽粒成熟时予 以收获。在随后的生长季将转化处理花粉授粉后收获的种子播种，通过对萌发种子和幼苗 的筛选、对成苗株样本DNA的PCR扩增及Southern杂交，进一步确定转化株。在加入花粉和外源DNA片段前，需要对蔗糖溶液进行通气和低温预处理，使用空 气泵给蔗糖溶液连续通气20分钟以上，使蔗糖溶液中的空气(氧)含量达到饱和状态，同时 将蔗糖溶液置于0—4°C冰浴或冰箱中预处理；加入花粉和外源DNA片段后，形成花粉悬浮 液？，并在以后的操作过程中始终将花粉悬浮液置于0—4°C冰浴中。对花粉悬浮液进行超 声波处理，需要在加入外源DNA前、后分别对花粉悬浮液进行超声波处理，处理功率强度为 50—500W,时间为5秒一2分钟。空气泵可以采用市售的小型水族箱用空气泵。新鲜花粉是在0—4°C保存5天以内的花粉。将处理花粉授到植物柱头上，并在籽 粒成熟时予以收获。在随后的生长季，将转化处理花粉授粉后得到的种子播种，并根据植物 转化载体上携带的筛选标记基因利用筛选剂对萌发种子及其长出的幼苗的进行初步筛选， 所用筛选剂可以是但不局限于为抗生素或除草剂。或者随后根据插入的外源DNA序列利用 PCR扩增或Southern杂交方法对成苗株样本DNA进行筛选，并在随后的世代中对筛选到的 转基因株系进行连续自交和筛选，直至获得稳定纯合的转基因品系。本发明是经过改良的超声波辅助花粉介导植物转基因方法，可以显著提高授粉植 株结实率，进而提高每次处理获得的转化体数。该方法可将外源基因直接转移到后代种子 基因组中，避开了繁冗、操作要求高的植物组织培养过程，大大缩短获得转化种子的周期 性。具有后代植株中基因转化效率高、重复性好、发生嵌合体几率少、超声波设备便宜和无 物种及基因型依赖性、适用范围广等特点，可以提高超声波辅助植物花粉介导转基因方法 的结实率，进而提高每次处理获得的转化体数，节省人力和物力，有利于生产实践的应用。花粉丧失活力的原因除超声波作用损伤不可避免外，花粉在悬浮液中也有一定比例的 损伤，其原因一是花粉破裂，二是大部分不破裂的花粉也丧失了萌发能力，因此从花粉的悬 浮条件入手提高花粉的生活力。悬浮液的三个主要因素为蔗糖浓度(渗透压)、温度和空气 (氧气)含量。针对以上因素，采用玉米品种郑58做了下列试验，结果见表1 表8 实施例1 玉米花粉在悬浮液中浸泡时间对花粉体外萌发有显著影响。表1玉米花粉在悬浮液中浸泡时间对花粉体外萌发的影响
一种改良的超声波辅助花粉介导植物转基因方法，目的目的是显著提高超声波处理花粉授粉后植株的结实率，进而提高每次处理获得的转化体数；本发明方法以携带外源基因片段的农杆菌Ti质粒、大肠杆菌质粒或其它DNA载体为基因供体，以植物花粉为受体，在经过通气和低温处理的5—50%的蔗糖溶液中使花粉与外源DNA混合，通过超声波辅助作用使外源基因转移到受体花粉中；然后将处理花粉授到植物柱头上，并在籽粒成熟时予以收获；在随后的生长季将转化处理花粉授粉后收获的种子播种，并通过对萌发种子和幼苗的筛选，对成苗株样本DNA的PCR扩增及Southern杂交，进一步确定转化株。本发明方法不需进行组织培养，没有物种及基因型依赖性，能缩短转基因育种年限并节省人力和物力。