专利名称：南极芽胞杆菌和嗜冷杆菌及混合杀菌剂及其制备方法目前，农作物病害的防治仍以化学农药为主，造成环境 污染、土壤退化、农产品质量下降，病原抗药性增强等危害，已成为制约我国农产品在国际市场竞争力和危害人民健康水平与生活质量的主要因素。寻找新来源、高活性的天然生物活性物质开发生物农药，是发展无公害农业，生产绿色食品的必然趋势。近年来，微生物农药活性组分和活性菌株多来源于陆栖环境或近海环境。一方面，从常规环境中新发现的生物活性物质种类日益减少，且大多为已知化合物；另一方面越来越多的病原对传统抗生素产生抗药性，迫切需要寻找新来源、高活性的天然生物活性物质。极地环境具有独特的地理及气候特征，低温、高盐和强辐射等自然环境造就了极地微生物在基因组成、酶学特性以及代谢调控等方面独特的分子生物学机制与生理生化特性，是结构新颖、功能独特的化学物质的发源地。近几年我国学者从极地海洋环境，筛选获得对植物病原及害虫具有抑制或者触杀作用的微生物，说明极地微生物在生物农药应用上具有极大的潜力。目前关于南极生防菌株协同防治植物病害的研究和应用尚未见报道。芽孢杆菌产生多种抑制细菌、真菌和病毒的物质，如肽类、脂肽类、磷脂类、多烯类、氨基酸类、核酸类等。一些芽孢杆菌产生的3-1，3-葡聚糖酶和几丁质酶可降解植物病原细胞壁，还可产生抗植物病原的蛋白和苯乙酸类化合物等。目前，有待于进一步研究和开发芽胞杆菌生防制剂应用于植物病害的生物防治。从海冰或海泥中获取芽胞杆菌菌株，并利用其与嗜冷杆菌协同防治植物病害是生物农药技术的重大突破，也是研发和利用南极海冰资源的迫切需要。因此，从南极海冰或海泥中，获取芽胞杆菌菌株、进一步开发芽胞杆菌菌株系列生物农药产品，是目前人类整治生存环境、防止农作物污染，确保食品安全的迫切需要，对于南极微生物资源的开发利用具有重要的意义。
本发明的目的在于提供一种能消除上述缺点，具有方法简单、结构新颖、活性独特、性能稳定、功能奇特、成本低廉、杀菌率高、农用药效价值大，可促进生物生长、降解有毒物质等特点的一种南极芽孢杆菌生防菌株和嗜冷杆菌生防菌株及其混合制剂的制备方法。尤其是采用液体深层发酵，进行优化配比等科学的试验手段，实现了最大的作用和功效；首创性的从海冰或海泥中获得微生物一芽孢杆菌和嗜冷杆菌，进而研发出其保存和制备方法，开创了芽孢杆菌和嗜冷杆菌农药综合利用的新方法和途径，开发了南极海泥或海冰微生物的在农业上的药用价值和用途，实现了从南极海泥或海冰中获取芽孢杆菌和嗜冷杆菌后制备生防菌株的方法，有效地预防和抑制农作物等植物病虫害和病菌的发生，同时自然资源得到有效地开发和利用，降低了生产和使用成本，提高了社会和经济效益，从海泥或海冰的微生物中获得芽孢杆菌和嗜冷杆菌菌种是生物农药技术的重大突破，为开发研究以防止农作物污染、确保食品源安全为宗旨的农药产品奠定了基础，是理想的从南极海泥或海冰中获取芽孢杆菌和嗜冷杆菌生防菌株的制备方法。本发明的南极芽胞杆菌和嗜冷杆菌是分别从南极海冰或海泥中分离获得的海洋细菌，是两种南极生防菌株，分子鉴定分别确认为芽孢杆菌属(Bacillus)，命名为Baci I Iussp. 107 ;嗜冷杆菌属(Psychrobacter),命名为Psychrobacter sp.B-3。是用于植物病害生物防治的海洋细菌。所述的海洋细菌分别是南极芽孢杆菌和嗜冷杆菌，其生防菌株保存方法是采用试管斜面法，培养基蛋白胨3-5g，酵母粉0. 5-lg，琼脂粉15-17g，陈海水120-200毫升，自来水800-880毫升，pH值7. 0-7. 2 ;在试管斜面上划线接种生防菌株，于10-15°C，培养24-36小时后，于3-5°C保存。南极芽孢杆菌Bacillus sp. 107的培养温度为15_25°C，嗜冷杆菌Psychrobacter sp. B-3的培养温度10_15°C，培养24-36小时后，贮存于3_5°C。专用于南极芽孢杆菌生防菌株的生防制剂的制备方法，其保存的生防菌株制备发酵种子液，是将试管斜面保存的生防菌株接种于种子培养基中，该培养基的组分为蛋白胨3-5g，酵母粉0. 5-lg,陈海水120-200毫升，自来水800-880毫升，pH值7. 0-7. 2，于15-25。。，150转/分钟振荡培养24-48小时后，获得发酵种子液。其制备的发酵种子液进行深层发酵，是在培养基麸皮5-6g，酵母粉3g-4g，陈海水150毫升，自来水850毫升。100升发酵罐，装70升培养基，灭菌后PH值为7. 0-7. 2。按5 % -7 %质量百分数将Baci I Ius sp. 107种子液接种于发酵罐内的深层发酵培养基，通过空气压缩机向罐内通入压缩空气，以提供发酵过程中需要的氧气，罐内压力控制在0. 02Pa ;发酵温度保持在25±1°C ;加入300-350毫升灭菌的豆油作为消泡剂来消除在搅拌过程中产生的气泡。搅拌速度为220-250转/分，发酵96-120小时。由此可得到70升菌株数量为IO9个/毫升的发酵液。南极嗜冷杆菌保存的生防菌株制备发酵种子液，是将试管斜面保存的Psychrobacter sp. B_3生防菌株接种于种子培养基中，专用于南极嗜冷杆菌生防菌株种子培养基的组分为蔗糖20-22. 5g，豆粉8-10. 5g，K2HPO4 0. 1-0. 2g, Na2SO4 0. 05-0. lg, FeSO4 7H200. 005-0. Olg, CaCO3 l_2g，陈海水 120-200毫升，自来水800-880毫升，pH值7. 0-7. 2，于10-15。。，150转/分钟振荡培养24-48小时后，获得发酵种子液。其制备的发酵种子液进行深层发酵，是在培养基蔗糖40-45g，豆粉18-21g, K2HPO4 0. 1-0. 2g, Na2SO4 0. 05-0. lg, FeSO4 7H20 0. 005-0. Olg, CaCO3 l_3g，陈海水1000毫升，100升发酵罐的加料量为70升，灭菌后pH值7. 0-7. 2 ;按5% _7%质量百分数将Psychrobacter sp. B_3种子液接种于发酵罐内的深层发酵培养基,通过空气压缩机向罐内通入压缩空气，以提供发酵过程中需要的氧气，罐内压力控制在0. 02Pa ;发酵温度利用外接低温循环水控制，罐内温度保持在10±1°C ;加入300-350毫升灭菌的豆油作为消泡剂来消除在搅拌过程中产生的气泡。搅拌速度为220-250转/分，发酵120-144小时，胞外多糖产量可达4. 5g/升。南极芽胞杆菌和嗜冷杆菌的混合杀菌剂是其深层发酵的发酵液制备混合杀菌剂，是将南极芽孢杆菌Bacillus sp. 107菌株发酵液和嗜冷杆菌Psychrobactersp. B-3菌株的发酵液，按I : I比例配比后，添加生长营养元素后，制成混合杀菌剂，于常温保存，该生长营养元素包括硫酸铵I. 5-1. 9克，硫酸锌4-5. 4克，磷酸钙3-5. 9克，硝酸钾8. 2-9. 2克，过磷酸钙2-3. 3克，硫酸铁1-1. 2克；硼酸、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜分别为0. 006克；生防菌株发酵液1000毫升；菌株制剂外观为淡黄色液体，活菌数量达IO9个/毫升。所述的专制的南极芽孢杆菌和嗜冷杆菌生防菌株的混合杀菌剂的用法，所制备的生防制剂可抑制或预防尖镰孢菌、辣椒疫霉和大丽轮枝菌的植物病原真菌的产生。所制备的生防制剂稀释10-20倍后，用于大棚黄瓜白粉病的防治。本发明首先提供芽抱杆菌Bacillus sp. 107和嗜冷杆菌Psychrobacter sp. B-3为生防菌株，通过液体深层发酵制备，配比后添加营养元素后获得生防菌株制剂，并测定其生物活性，为其在农作物病害生物防治技术领域的应用奠定基础。本发明的技术方案如下(I)生防菌株的获得与鉴定两种生防菌株均来自中国第19次南极科学考察采集的海泥样品中，采用佐贝尔2216E培养基分离获得，经16S rDNA鉴定分别为芽孢杆菌属(Bacillus)，命名为Bacillussp. 107 ;嗜冷杆菌属(Psychrobacter),命名为 Psychrobacter sp.B-3。 (2)生防菌株的保存生防菌株Bacillus sp. 107 和 Psychrobacter sp. B-3,均米用试管斜面，于 3_5°C保存。试管斜面保存菌株的制作具体步骤如下培养基蛋白胨3_5g，酵母粉0.5-lg，琼脂粉15_17g，陈海水120-200毫升，自来水800-880毫升，pH值7. 0-7. 2。培养基灭菌后，在试管斜面上分别划线接种生防菌株，Bacillus sp. 107的培养温度为15_25°C，Psychrobacter sp. B-3的培养温度10_15°C，培养24-36小时后，贮存于3_5°C。(3)生防菌株发酵种子液的制备Bacillus sp. 107生防菌株的发酵和制备,首先是将菌株接种于种子培养基中，种子培养基组成蛋白胨3-5g，酵母粉0. 5-lg，陈海水120-200毫升，自来水800-880毫升，pH值7. 0-7. 2。培养基100-120°C灭菌30-50分钟，冷却后，将试管斜面保存的Bacillussp. 107生防菌株接种到500毫升三角瓶中(含300毫升培养基)，于15-25°C，150转速/分钟振荡培养24-48小时后，得发酵种子液。Psychrobacter sp. B_3生防菌株的发酵和制备,首先是将菌株接种于种子培养基中，种子培养基组成蔗糖 20-22. 5g，豆粉 8-10. 5g，K2HPO4 0. 1-0. 2g，Na2SO4 0. 05-0. lg,FeSO4 7H20 0. 005-0. Olg, CaCO3 l_2g，陈海水 120-200 毫升，自来水 800-880 毫升；pH 值7. 0-7. 2，培养基100-120°C灭菌20-30分钟，冷却后将斜面保存的Psychrobacter sp. B-3生防菌株接种到500毫升三角瓶中(含300毫升培养基)，于10-15°C，150转速/分钟振荡培养24-48小时后,得发酵种子液。(4)生防菌株深层发酵液的制备在获得Bacillus sp. 107发酵种子液的基础上，准备深层发酵培养基麸皮5_6g，酵母粉3g_4g，陈海水150毫升，自来水850毫升。100升发酵罐，装70升培养基，灭菌后pH值为7. 0-7. 2。按5%-7%质量百分数将Bacillus sp. 107种子液接种于发酵罐内的深层发酵培养基，通过空气压缩机向罐内通入压缩空气，以提供发酵过程中需要的氧气，罐内压力控制在0. 02Pa ;发酵温度保持在25± I°C;加入300-350毫升灭菌的豆油作为消泡剂来消除在搅拌过程中产生的气泡。搅拌速度为220-250转/分，发酵96-120小时。由此可得到70升菌株数量为IO9个/晕升的发酵液。在获得Psychrobacter sp. B_3发酵种子液的基础上,准备深层发酵培养基鹿糖40-45g，豆粉 18-21g, K2HPO4 0. 1-0. 2g, Na2SO4 0. 05-0. lg, FeSO4 7H200. 005-0. Olg, CaCO3l-3g，陈海水1000毫升，100升发酵罐的加料量为70升，灭菌后pH值7. 0-7. 2，。按5% -7%质量百分数将Psychrobacter sp. B-3种子液接种于发酵罐内的深层发酵培养基，通过空气压缩机向罐内通入压缩空气，以提供发酵过程中需要的氧气，罐内压力控制在0. 02Pa ;发酵温度利用外接低温循环水控制，罐内温度保持在10±1°C ;加入300-350毫升灭菌的豆油作为消泡剂来消除在搅拌过程中产生的气泡。搅拌速度为220-250转/分，发酵120-144小时，胞外多糖产量可达4. 5g/升。(5)混合杀菌制剂的配比和制备将南极芽胞杆菌Bacillus sp. 107和嗜冷杆菌Psychrobacter sp. B-3发酵液按照3 1,2 1,4 1,1 1,1 2,1 3等不同比例配置，适当添加植物生长营养元素后制成不同配比的混合杀菌制剂，并测定制剂对植物病原的抑制效果。制剂外观为淡黄色液体，活菌数量达IO9个/毫升。 (6)混合杀菌制剂对植物病原抑制作用的分析方法和应用效果植物病原以真菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)等常见病原菌为指示菌。将植物病原真菌接种于PDA固体培养基，25°C培养48小时后，取一块菌丝体，加至含无菌水的试管中充分振荡，用两层灭菌纱布过滤菌丝后，稀释获得植物病原真菌孢子悬浮液(IO5个/晕升)。采用平板扩散法测定杀菌制剂抑菌活性。将PDA培养基融化后冷却至45°C，以I 100(v/v)倒入各种植物病原真菌的孢子悬浮液，混匀后倾注到平皿中，每皿约20毫升。冷却后，用打孔器呈十字形打孔(直径7毫米)；再用冷却至适当温度的PDA培养基封底，将生防制剂以清水适当稀释后，每孔加入50微升，于22°C培养48小时后，测量抑菌圈大小。结果表明南极芽胞杆菌Bacillus sp. 107和嗜冷杆菌Psychrobacter sp. B-3发酵液I : I配比时，抑菌效果最佳。进一步分析发现，该混合制剂对几种常见的病原真菌均有抑制作用，其中对爺交链孢菌(Alterinaria solani)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、大I 轮枝菌(Verticillium dahliae)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)和瓜亡革菌(Thanatephorus cucumeris)为强抑制作用，对尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)为抑制作用。(7)混合杀菌制剂的应用将南极芽胞杆菌Bacillus sp. 107和嗜冷杆菌Psychrobacter sp. B-3发酵液I I配比的混合杀菌制剂，以清水适当稀释后，用喷雾器对农田或大棚栽培的果蔬施药，将药液均匀喷施于黄瓜植株全株，可获得86. 20%的防治效果。本发明的生防菌株是分离于南极海泥或海冰中，经分子鉴定分别确定为芽孢杆菌和嗜冷杆菌，是取自极地极端环境的南极菌株。芽孢杆菌生防菌株属于能产生多种抗菌物质的芽孢杆菌属。将两株生防菌株保存后进行深层发酵，并按比例混合后，可有效地对农作物病害进行生物防治，混合制制可用于防治农业果蔬植物病害的生防制剂具有广泛的应用前景。本发明的特点在于I.首次以南极芽胞杆菌属(Bacillus)和嗜冷杆菌属(Psychrobacter)作为果蔬病害的生防菌株，明确了菌株混合复配比例，并建立菌株的IOOL体积发酵罐的发酵工艺。2.提供了南极芽胞杆菌Bacillus sp. 107和嗜冷杆菌Psychrobacter sp. B-3的潜在用途抑菌实验表明，混合杀菌制剂对多种植物病原具有抑制作用；对大棚黄瓜黄瓜白粉病的防治效果达86. 20%，优于1%武夷菌素水剂500倍稀释液的防效。说明本发明中的菌株及混合杀菌制剂在植物病害的无公害生物防治中具有潜在的应用前景。(3)混合杀菌制剂的配比和制备上述南极芽胞杆菌Bacillus sp. 107和嗜冷杆菌Psychrobacter sp. B-3菌株发酵液按照3 1,2 1,4 1,1 1,1 2,1 3等不同比例配置后，适当添加植物生长营养元素后制成不同配比的混合杀菌制剂，于常温保存。制剂外观为淡黄色液体，活菌数量达IO9个/毫升。生长营养元素包括硫酸铵I. 5-1. 9克，硫酸锌4. 0-5. 4克，磷酸钙3. 0-5. 9克，硝酸钾8. 2-9. 2克，过磷酸钙2. 0-3. 3克，硫酸铁I. 0-1. 2克；硼酸、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜分别为0. 006克；生防菌株发酵液1000晕升。实施例3.混合杀菌制剂的配比比例上述不同配比的混合杀菌制剂，用以测定对植物病原的抑制效果。植物病原真菌以尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)等常见植物病原菌为指示菌。病原真菌接种于PDA固体培养基，25°C培养48小时后，取一块菌丝体，加至含无菌水的试管中充分振荡，用两层灭菌纱布过滤菌丝后，稀释获得植物病原真菌孢子悬浮液(IO5个/毫升)。采用平板扩散法测定菌株抑菌活性。将PDA培养基融化后冷却至45°C，以I 100 (v/v)倒入各种植物病原真菌的孢子悬浮液，混匀后倾注到平皿中，每皿约20毫升。冷却后，用打孔器呈十字形打孔(直径7毫米)；再用冷却至适当温度的PDA培养基封底，将生防菌株制剂适当稀释后，每孔加入50微升，22°C培养48小时后，测量抑菌圈大小。结果表明结果表明南极芽胞杆菌Bacillus sp. 107和嗜冷杆菌Psychrobacter sp. B-3发酵液I : I配比时，抑菌效果最佳。表I混合杀菌剂中芽孢杆菌和嗜冷杆菌发酵液的配比比例及抑菌效果
南极芽孢杆菌生防菌株和嗜冷杆菌生防菌株，是分别从南极海冰或海泥中分离获得的海洋细菌，分子鉴定分别为Bacillus属，命名为Bacillus sp.107；Psychrobacter属，命名为Psychrobacter sp.B-3。首创性的从海冰或海泥中获得芽孢杆菌生防菌株和嗜冷杆菌生防菌株，并进行协同防治使用，是生物农药技术的重大突破，实现了获取和保存芽孢杆菌生防菌株和嗜冷杆菌生防菌株的方法。采用液体深层发酵等科学的试验手段，并对两株菌株发酵液合理的配比，达到最佳防治效果，并获得混合杀菌制剂。开创了其生物农药综合利用，预防和抑制农作物病虫害，自然资源得到开发和利用，降低了成本，提高了效益。为研究开发防止农作物污染和确保食品源安全的农药产品奠定了基础。