一种防治土壤环境病原菌的芽胞杆菌制剂及制备方法和应用的制作方法[0002]近几年畜禽传染病的爆发越来越频繁，不仅危害畜禽类的健康，造成巨大的经济损失，而且还威胁人类的健康。其中，致病性大肠杆菌引发的大肠杆菌病是畜禽养殖业最常见的传染性疾病，主要表现为鸡大肠杆菌病、仔猪黄痢、仔猪白痢和猪水肿病等，这些病不仅发病率和死亡率高，且流行范围广、常年可发生。鸡大肠杆菌病具有易传染、易与其他疾病(如鸡慢性呼吸道病、新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊病、葡萄球菌病或球虫病等)并发的特点。仔猪黄痢易发病于7日龄内的仔猪，感染仔猪排黄色稀粪，且发病率和死亡率高。仔猪白痢易发病于10至30日龄的仔猪，感染仔猪排白色稀粪，该病发病率高、死亡率低，严重影响患畜的生长发育。猪水肿病常见于断奶前后的仔猪，其典型特征是仔猪全身水肿和神经症状、胃黏膜和结肠系膜水肿，该病发病率低、死亡率高(陈希文等，2007)。大肠杆菌病长期困扰着畜禽养殖业的发展，而近年大量使用的抗生素不仅污染了环境，而且造成了致病性大肠杆菌的多重耐药性，使得大肠杆菌病的防治更加困难。[0003]众所皆知，畜禽传染病会给人类带来巨大的经济损失，但人们往往忽视了它们造成的环境污染。受感染畜禽的排泄物等含有高浓度的病原菌和病毒，会加速疫情的蔓延。为了控制疫情人们一般大量使用化学消毒剂进行消毒，但消毒剂给土壤和水体又带来污染，影响了土壤的植被和微生物群落，给水体中动植物的生存也造成威胁。另外，为了防治畜禽传染病而大量使用的抗生素给人类带来的危害更是不可预计，它使得大量的微生物产生耐药性，现在畜禽传染病爆发的频率越来越高与抗生素的滥用关系莫大。由于微生物制剂对大肠杆菌病有较好的防治效果，既可以提高畜禽类的免疫能力，又可以分解环境中的污染物，抑制和拮抗环境中病原菌的生长繁殖，因此有着广阔的发展应用前景。[0004]目前微生物制剂研究的方向主要是水产养殖业、畜禽养殖业、种植业和肠道微生物平衡。其中畜禽养殖业中，主要研究的是饲用微生物制剂，利用微生物制剂替代抗生素，预防和治疗畜禽类肠道疾病、提高畜禽类的免疫力、促进生长。对于微生物制剂改善猪舍和鸡舍环境污染和防治环境中病原菌的相关研究较少，畜禽舍病原微生物的污染及有害气体对动物和人的健康构成了极大的威胁。不少微生态制剂(例如EM)还具有扶植正常微生物菌群、拮抗致病菌、减少粪便中氨和硫化氢等有害气体的排出、改善畜舍内空气质量的作用。同时还能减少苍蝇蚊虫的滋生，减少疾病的传播从而也可对环境起到保护作用。另外，某些有益微生物(如芽胞杆菌)可以减少蛋白质向刺激性较强的氨和胺的转化，减少血液和肠道中氨的浓度，减少向外界的排泄量，从而改善饲养环境(刘燕和王静惠，2002)。所以研究这一类降低环境污染的微生物制剂具有重要意义。[0005]微生态制剂采用的菌种主要有乳酸菌、芽胞杆菌、酵母菌等。例如常用的EM微生物制剂内含有光合细菌、酵母菌、乳酸菌、放线菌以及发酵型壁状真菌等五科10属80种微生物。美国FDA(1989)规定允许饲喂的微生物有43种，其中乳酸菌28种(包括乳酸杆菌12种、双歧杆菌6种、链球菌6种、片球菌3种、明串珠菌I种)，芽胞杆菌5种，拟杆菌4种，曲霉菌2种，酵母菌2种等。我国农业部2008年12月第1126号公告《饲料添加剂品种目录(2008)》中规定的可以直接饲喂动物的微生物共有16种:地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母、沼泽红假单胞菌、保加利亚乳杆菌。[0006]芽胞杆菌也是微生物制剂采用的主要菌种之一。目前广泛使用的有三类产芽胞的细菌，一是需氧芽胞杆菌，如枯草芽胞杆菌、纳豆芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、东洋芽胞杆菌、凝结芽胞杆菌等；二是芽胞乳杆菌，如菊糖芽胞乳杆菌；三是厌氧梭状芽胞杆菌，如丁酸梭菌(张璐，2008)。芽胞杆菌制成微生物制剂具有多方面的优点。首先，芽胞杆菌具有耐酸、耐碱、耐高温的优点，易于保存，制成微生物制剂稳定性好。其次，芽胞杆菌可以产生有机酸物质，有利于乳酸菌等优势菌群的生长繁殖，维持微生态平衡。再次，芽胞杆菌产生大量的酶类，有助于畜禽类对营养物质的吸收(冯亚强和薛恒平，1995)。最后，芽胞杆菌可以产生抗菌物质，抑制病原菌的生长。
[0007]本发明的目的是在于提供了一种防治土壤环境病原菌的芽胞杆菌制剂，该制剂包含两种解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和一种短小芽胞杆菌(Bacilluspumilus)，将三株菌的菌液等体积混合，制得一种防治土壤环境病原菌的芽胞杆菌制剂。由三株芽胞杆菌制成的微生物制剂具有便于存储、运输和稳定性强的特点；另外，解淀粉芽胞杆菌和短小芽胞杆菌是常用的益生菌，可以调节土壤的微生物群落结构，促进有益微生物的生长；最后，本发明的芽胞 杆菌微生物制剂可以抑制土壤中致病性大肠杆菌的生长，防治土壤中致病性大肠杆菌的污染。[0008]本发明的另一个目的在于提供了一种制备芽胞杆菌制剂的方法，本发明的微生物制剂的制备方法操作简单，便于大规模的生产。
[0009]本发明的再一个目的是提供了一种芽胞杆菌制剂在防治土壤环境的病原菌污染中的应用。该微生物制剂应用时只需将微生物制剂直接施用到土壤中混合，操作过程简单，另外该微生物制剂应用于处理致病性大肠杆菌污染土壤具有效果显著、见效快的特点。
[0010]为了实现上述目的，本发明采用如下技术措施:
[0011]一种防治土壤环境病原菌的芽胞杆菌制剂:由三种菌的菌液等体积混合而成，这三种菌均为发明人从湖北地区病原菌污染土壤中分离得到，包括一种短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus) D31 (本发明中简称为D31 )，一种解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) J3_l (本发明中简称为J3_l)和一种解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) D66 (本发明中简称为D66),这三种菌的分离方法是相同的。其分离过程是:[0012]A.制备双层平板:
[0013]I)接种致病性大肠杆菌(本发明中所用到的病原菌为大肠杆菌，该菌从猪场土壤中分离，利用小鼠进行了动物回归试验证实其为强致病性大肠杆菌。)至PA瓶中，370C，180rpm,振荡培养 12h ；
[0014]2)将大肠杆菌稀释至10_5，取500μ I大肠杆菌稀释液于温度冷却至50_60°C的250ml的LB固体培养基中，混合均匀；
[0015]3)向无菌平皿中倒入一层薄的含病原菌的培养基，静置凝固；
[0016]4)向上一步的平板中倒入一层薄的无菌LB培养基，静置凝固，即制成双层平板。
[0017]B.稀释涂平板筛选拮抗菌:
[0018]I)称取IOg的土壤样品至装有90ml无菌水并放有玻璃珠的250ml的三角瓶中，280C，180rpm,振荡培养 30min ；
[0019]2)静置5min，用Iml移液枪吸取Iml悬液于1.5ml的空离心管中，即成KT1稀释液；
[0020]3)再用200 μ L的移液枪吸取100 μ LKT1稀释液于装有900 μ L无菌水的离心管中，吹吸几次，让菌液混合均匀，即成10_2稀释液；
[0021]4)重复上述步 骤3的操作，吸取100 μ L10_2稀释液，加入装有900 μ L无菌水的离心管中，吹吸几次，让菌液混合均匀，即制成10_3稀释液，以此类推，制成10_4、IO-5等一系列稀释菌液；
[0022]5)取100 μ L的稀释液至相应双层平板中，再用无菌刮铲将菌液涂抹均匀；
[0023]6)将平板置于28 °C培养箱培养；
[0024]7)每天观察，挑取有拮抗能力的单菌落，划线纯化保存。
[0025]C.拮抗菌抑菌效果验证:
[0026]将纯化后的单菌落重新接种至双层平板中，将平板置于28°C培养箱培养，培养7d后观察，看是否产生抑菌效果。
[0027]D.菌种保存:
[0028]将验证后有抑菌效果的拮抗菌分别接种至含5ml LB的PA瓶中，28°C，180rpm,振荡培养至对数生长期，取500 μ L的菌液于含有500 μ L 50%灭菌甘油的冻存管中，混合均匀，置于-80°C冰箱中保存。
[0029]依据上述方法，分离获得一种短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus) D31, 申请人:于2012年4月20日送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号:CCTCCN0:M2012123，保藏地址:中国武汉武汉大学，分类命名:短小芽胞杆菌D31 Bacilluspumilus D31。
[0030]同样依据上述方法，分离获得了一种解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) D66, 申请人:于2012年4月20日送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号:CCTCC Ν0:Μ 2012124，保藏地址:中国武汉武汉大学，分类命名:解淀粉芽胞杆菌 D66 Bacillus amyloliquefaciens D66。
[0031]此外,还分离获得了一种解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) J3-1, 申请人:于2012年4月20日送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号=CCTCCN0:M2012125，保藏地址:中国武汉武汉大学，分类命名:解淀粉芽胞杆菌J3_l Bacillusamyloliquefaciens J3—1。
[0032]以下为分离获得的三种菌株的形态学特征、培养条件和遗传学特性:
[0033]I)菌落及细胞形态:A.菌株D31的单菌落形状为圆形，菌落微隆起，表面有皱褶，边缘为啮蚀状，白色至淡黄色的不透明菌落。D31为革兰氏阳性菌，细胞呈短杆状，芽胞中生，芽胞呈椭圆状。B.菌株D66的单菌落形状为圆形，菌落微隆起，表面有环状皱褶，边缘为啮蚀状，白色至淡黄色的不透明菌落。D66为革兰氏阳性菌，细胞呈杆状，芽胞端生，芽胞呈椭圆状。C.菌株J3-1的单菌落形状为圆形，菌落微隆起，表面有环状皱褶，边缘为啮蚀状，白色至淡黄色的不透明菌落。J3-1为革兰氏阳性菌，细胞呈杆状，芽胞次端生至端生，芽胞呈柱状。
[0034]2)培养条件:三株芽胞杆菌均为好氧菌，采用LB培养基(胰蛋白胨10g，酵母抽提物 5g，NaCl 10g, dH20 补至 IOOOmL ；pH 为 7.0-7.2)培养，培养温度 28°C -37°C，180rpm 振荡培养。
[0035]3)遗传学特性:经过16S rDNA基因的测序比对，鉴定D31为短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、 D66 和 J3-1 为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。短小芽胞杆菌D31的16S rDNA基因的序列为SEQ ID N0.1、解淀粉芽胞杆菌D66的16S rDNA基因的序列为SEQ ID N0.2、解淀粉芽胞杆菌J3-1的16S rDNA基因的序列为SEQ ID N0.3。
[0036]一种防治土壤病原菌的芽胞杆菌制剂的制备方法，其步骤是:
[0037]本发明的微生物制剂包含D31、D66、J3-1三种芽胞杆菌。发明人将短小芽胞杆菌D31、解淀粉芽胞杆菌D66、解淀粉芽胞杆菌J3-1的菌液等体积混合，然后添加草炭充分混合，即得到用于畜禽养殖区致病性大肠杆菌等病原菌的污染防控的土壤微生物制剂。微生物制剂的制备方法具体如下:
[0038]A、分别挑取单菌落，将短小芽胞杆菌D31、解淀粉芽胞杆菌D66、解淀粉芽胞杆菌J3-1接种至含5ml LB液体培养基的PA瓶中，37°C，180rpm，振荡培养12h。
[0039]B、以1%的接种量转接至新的含250ml LB培养液的500ml三角瓶中，37°C，180rpm振荡培养至90%以上形成芽胞；其中菌株解淀粉芽胞杆菌D66和解淀粉芽胞杆菌J3-1培养时间为72h，菌株短小芽胞杆菌D31培养时间为120h，此时菌种90%以上形成芽胞，耐受各种环境的能力较强。
[0040]C、将短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus) D31、解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) D66、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) J3-1 的发酵液以体积比1:1:1混合。
[0041]D、再将混合菌液通过8000rpm离心5min，去部分上清，将体积浓缩至原有体积的
三分之一。
[0042]E、以4:1 (体积:质量)比例加入灭菌草炭，混合均匀，28°C放置48h，即制成微生物制剂。
[0043]所述的草炭又名泥炭，亦叫作泥煤，是沼泽发育过程中的产物，形成于第四纪，由沼泽植物的残体，在多水的嫌气条件下，不能完全分解堆积而成。含有大量水分和未被彻底分解的植物残体、腐殖质以及一部分矿物质。有机质含量在30%以上(国外认为应超过50%)，质地松软易于散碎，比重0.7-1.05，多呈棕色或黑色，具有可燃性和吸气性，pH值一般为5.5-6.5，呈微酸性反应，呈层状分布，称为泥炭层。是沼泽发展速度和发育程度的重要标志。是一种宝贵的自然资源。草炭是煤化程度最低的煤(为煤最原始的状态)，乃有机物质。
[0044]一种防治土壤病原菌的芽胞杆菌制剂在防治土壤环境的病原菌污染中的应用，其应用过程是:
[0045]A、实验组:将上述120mL混合菌液制得的微生物制剂与500g的病原菌污染土壤混
合，置于28°C培养箱培养。
[0046]B、对照组:用相同体积的无菌水替代上述混合菌液，并用相同的方法制成水和草炭的混合物(阴性对照)，与500g的病原菌污染土壤混合，置于28°C培养箱培养。
[0047]C、实验组和对照组处理过程相同，分别于处理O、1、2、3、5、7、10天后取样，用麦康凯选择性平板计数土壤中存活的大肠杆菌数量。
[0048]D、实验结果如图2所示，本实验生防菌剂投放到实验室模拟的大肠杆菌污染土壤后，第I天杀菌率可达50%，7天后可达85%以上，这表明本发明所研制的微生物菌剂具有杀菌速度快、杀菌效果显著的特点，能够快速有效地治理病原菌污染土壤。
[0049]与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果:
[0050](I)目前畜禽养殖业用的微生物制剂主要是饲用微生物制剂，而用于防治、改善土壤环境病原菌污染的微生物制剂很少，而本发明的微生物制剂就是针对土壤环境病原菌污染的治理而发明的微生物制剂；
[0051 ] ( 2 )本发明的微生物制剂相比化学消毒剂和抗生素来说，具有无污染、不产生微生物耐药性的优势；
[0052](3)芽胞杆菌作为微生物制剂具有便于存储、运输和稳定性强的特点。解淀粉芽胞杆菌和短小芽胞杆菌是常用的益生菌，对动物无毒无害，且可以调节土壤的微生物群落结构，促进有益微生物的生长；
[0053](4)本发明的芽胞杆菌微生物制剂可以防治土壤中致病性大肠杆菌的污染，具有效果显著、见效快的特点。



[0054]图1为一种微生物制剂的液体拮抗实验结果示意图。
[0055]图中显示在液体实验条件下，实验组相对于对照组的大肠杆菌存活率。
[0056]图2为一种微生物制剂在实验室条件下应用于治理致病性大肠杆菌污染土壤的效果示意图。图中显示为实验组相对于对照组的大肠杆菌存活率。

[0057]本发明具体实例中所用到的病原菌为大肠杆菌，该菌从猪场土壤中分离得到，利用小鼠进行了动物回归试验证实其为强致病性大肠杆菌。发明人通过实验室条件下的平板拮抗实验、液体拮抗实验证实本发明的微生物制剂具有明显抑制和拮抗致病性大肠杆菌的能力；而微生物制剂应用于致病性大肠杆菌污染土壤的实验则表明:本发明的微生物制剂具有效果显著、见效快的特点。
[0058]实施例1:
[0059]一种防治土壤环境病原菌的芽胞杆菌制剂:由三种菌的菌液等体积混合而成，这三种菌均为发明人从湖北地区病原菌污染土壤中分离得到。三种菌分别为一种短小芽胞杆菌D31 (本发明中简称为D31)，一种解淀粉芽胞杆菌J3-1 (本发明中简称为J3-1)和一种解淀粉芽胞杆菌D66 (本发明中简称为D66)，它们的分离方法是相同的。其分离过程是:
[0060]A.制备双层平板:
[0061]I)接种大肠杆菌(本发明中所用到的病原菌为大肠杆菌，该菌从猪场土壤中分离，利用小鼠进行了动物回归试验证实其为强致病性大肠杆菌。)至PA瓶中，37°C，180rpm,振荡培养12h ；
[0062]2)将大肠杆菌稀释至10_5，取500 μ I大肠杆菌稀释液于温度冷却至50_60°C的250ml的LB固体培养基中，混合均匀；
[0063]3)向无菌平皿中倒入一层薄的含病原菌的培养基，静置凝固
[0064]4)向上述步骤3的平板中倒入一层薄的无菌LB培养基，静置凝固，即制成双层平板。
[0065]B.稀释涂平板筛选拮抗菌:
[0066]I)称取IOg的土壤样品至装有90ml无菌水并放有玻璃珠的250ml的三角瓶中，280C，180rpm,振荡培养 30min ；
[0067]2)静置5min，用Iml移液枪吸取Iml悬液于1.5ml的空离心管中，即成KT1稀释液；
[0068]3)再用200 μ L 的移液枪吸取100 μ LKT1稀释液于装有900 μ L无菌水的离心管中，吹吸几次，让菌液混合均匀，即成10_2稀释液；
[0069]4)吸取100 μ LlO-2稀释液重复上述步骤3，以此类推，制成10_4、10_5等一系列稀释菌液；
[0070]5)取100 μ L的稀释液至相应双层平板中，再用无菌刮铲将菌液涂抹均匀；
[0071]6)将平板置于28 °C培养箱培养；
[0072]7)每天观察，挑取有拮抗能力的单菌落，划线纯化保存。
[0073]C.拮抗菌抑菌效果验证:
[0074]将纯化后的单菌落重新接种至双层平板中，将平板置于28°C培养箱培养，培养7d后观察，看是否产生抑菌效果。
[0075]D.菌种保存:
[0076]将验证后有抑菌效果的拮抗菌分别接种至含5ml LB的PA瓶中，28°C，180rpm,振荡培养至对数生长期，取500 μ L的菌液于含有500 μ L 50%灭菌甘油的冻存管中，混合均匀，置于-80°C冰箱中保存。
[0077]由此分离获得了一种短小芽胞杆菌D31 Bacillus pumilus D31, 申请人:于2012年4月20日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为:CCTCC N0:M2012123。
[0078]由此还分离获得了一种解淀粉芽胞杆菌D66 Bacillus amyloliquefaciens D66, 申请人:于2012年4月20日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为:CCTCC NO:M 2012124。
[0079]依据同样方法还分离获得了一种解淀粉芽胞杆菌J3-1 Bacillusamyloliquefaciens J3_l, 申请人:于2012年4月20日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为:CCTCC N0:M2012125o
[0080]实施例2:
[0081]一种防治土壤病原菌的芽胞杆菌制剂的制备方法，其步骤是:
[0082]本发明的微生物制剂包含D31、D66、J3_1三种芽胞杆菌。发明人将D31、D66、J3-1的菌液等体积混合，然后添加草炭充分混合，即得到用于畜禽养殖区致病性大肠杆菌等病原菌的污染防控的土壤微生物制剂。微生物制剂的制备方法具体如下:
[0083]A、分别挑取单菌落，将D66、D31和J3-1接种至含5ml LB液体培养基的PA瓶中，37°C，180rpm，振荡培养 12h ；
[0084]B、以1%的接种量转接至新的含250ml LB培养液的500ml三角瓶中，37°C，180rpm振荡培养至90%以上形成芽胞；其中菌株D66和J3-1培养时间为72h，菌株D31培养时间为120h，此时菌种90% 以上形成芽胞，耐受各种环境的能力较强。
[0085]C、将上述的培养产物以体积比1:1:1混合。
[0086]D、再将混合菌液通过8000rpm离心5min，去部分上清，将体积浓缩至原有体积的
三分之一。
[0087]E、以浓缩混合菌液:灭菌草炭为4:1 (v/m)的比例加入灭菌草炭，混合均匀，28°C放置48h，即制成微生物制剂。
[0088]实施例3:
[0089]平板抑菌圈实验
[0090]I实验方法
[0091]I)挑取单菌落，将拮抗菌D31、D66、J3-1分别接种至含5ml LB的PA瓶中，28 0C，180rpm,振荡培养 48h ；
[0092]2)向平板中加入5ml的LB固体培养基，待凝固后放置牛津杯；
[0093]3)再向平板中加入5ml的LB固体培养基以固定牛津杯；
[0094]4)待凝固后，向牛津杯中加入200 μ I的拮抗菌菌液，28°C静置培养48h ；
[0095]5)将大肠杆菌接种至含5ml LB液体培养基的PA瓶中，37°C，180rpm，振荡培养12h ；
[0096]6)取50 μ I大肠杆菌培养物于温度冷却至50_60°C的250ml的LB软琼脂固体培养基(琼脂含量为0.5% (琼脂质量占培养基体积的百分比)中，混合均匀；
[0097]7)向步骤4的平板加入混有大肠杆菌的LB软琼脂固体培养基4ml，28°C静止培养3d，测定抑菌圈。
[0098]8)计算抑菌率，抑菌率为D/d，D为抑菌圈直径，d为拮抗菌菌落直径(即牛津杯直径)。
[0099]2实验结果
[0100]本发明实例中微生物制剂所含拮抗菌在固体平板上对致病性大肠杆菌抑菌圈实验的结果如表I所示。表I显示为拮抗菌的抑菌率及其标准差，抑菌率为D/d，D为抑菌圈直径，d为拮抗菌菌落直径(即牛津杯直径)。D66、D31和J3-1的抑菌率平均值分别为2.07、
3.72 和 3.28。
[0101]表I拮抗菌抑菌率