专利名称：一种枯草芽胞杆菌及1万亿活芽胞每克枯草芽胞杆菌原粉的制备方法自20世纪50年代以来，抗生素作为疾病治疗剂和动物生长促进剂发挥了重大作 用。然而，由于抗生素负面效果越来越严重，世界卫生组织已禁止在饲料中使用任何抗菌药 物，一些发达国家对兽用抗生素的使用也有明确规定。饲料和养殖业以添加抗生素预防和 促进动物生长的饲养方式已经受到了很大冲击，抗生素替代品的使用和推广成为养殖业发 展的必然方向。芽胞杆菌益生菌具备抗生素预防疾病和促进生长的特点，成为抗生素的替 代品，将取得理想的应用效果，在养殖业中具有很大的开发潜力。益生菌又称微生态制剂，是指有益微生物经过特殊驯化和加工制成的活菌制剂， 益生菌可以改善动物肠道中微生物的菌群平衡，防治某些细菌性疾病的发生，能提高动物 的饲料利用率、提高机体免疫力，促进生长和改善生产性能，得到安全无药物残留的动物产 品。现已开发成商品制剂的益生菌有芽胞杆菌类、酵母、乳酸菌、双歧杆菌、链球菌、曲霉 等，枯草芽胞杆菌(Bacillus subtillus简称Bs)是最重要的品种。目前，国内芽胞杆菌益生菌制品的生成工艺主要有两种，即固体发酵法和液体深 层发酵法。固体发酵法是把益生菌接种到固体培养基上进行发酵培养，其优点是相对管理 比较粗放，具有生产工艺简单，投资少的特点，但同时具易受杂菌污染，菌体含量不易控制、 产品质量不稳定的缺点。目前我国大多数芽胞杆菌益生菌产品都是采用该生产方法。液体 深层发酵法是采用现代发酵技术，将益生菌菌种接种到反应器中进行通风培养，对整个发 酵过程都可以进行精细的过程控制，具有便于无菌操作，容易控制菌体含量，产品质量稳定 的特点，但技术水平要求较高，相对固体发酵投资要高，但更适合工业化生产。其一般工艺 流程为菌种接种培养一种子罐培养一发酵罐发酵培养一排放培养液一收集菌体一加入适 量载体和保护剂一干燥一粉碎一过筛一稀释混和一成品包装一质检一益生菌产品。国内通常采用的固体发酵方式生产的枯草杆菌制剂(有效活菌数一般在200亿 cfu/g左右)和部分厂家采用液体发酵生产的制剂(芽胞数一般为1000-2000亿cfu/ g)。该工艺安全、高效优质，方法易行，由该工艺生产的枯草芽胞杆菌原药中的活芽胞数达 1，000亿活芽胞每克；水份彡7%,pH 6. 0-8. 0,细度(150 μ m) ^95%,噬菌体含量彡40个 /10,000活芽胞。
本发明的目的是在于提供了一种枯草芽胞杆菌筛选和鉴定方法，该方法筛选的菌种具有来源安全和发酵水平高等优点。该菌株在饲料工业和水产养殖方面得到广泛应用， 并且在污染水体净化、水果保鲜、垃圾除臭等新领域也将会有广泛的应用。本发明的另一个目的是在于提供了一种枯草芽胞杆菌原粉的制备方法，具有安 全、高效优质、方法易行，由该工艺生产的枯草芽胞杆菌原药中的活芽胞数达10，000亿活 芽胞每克。安全的枯草芽孢杆菌益生菌的筛选；培养基优化及液体高密度补料发酵技术； 高效的芽胞提取回收工艺；产品活芽胞数高。为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施1. BsKN-48 菌种的筛选取一定量(约IOg)从全国各地不同土壤和水体中收集的样品，在已灭菌的研钵 内研磨均勻。称取Ig研磨好的土样装入无菌试管中，加入IOmL无菌水充分震荡30分钟， 制成1 10的土壤稀释液。从上述土壤稀释液中取出lmL，加入9mL无菌水充分震荡做成 1 IO2的稀释液，依此类推，制成1 IO3U IO4U IO5U IO6的土壤稀释液，用移液枪 吸取稀释液均勻涂布在分离培养基A1 (豆饼粉30g，淀粉8g，酵母粉10g，磷酸氢二钾0. 3g， 硫酸镁 0. 3g，硫酸锰 0. 05g，碳酸钙 0. lg，琼脂 15g，水 IOOOmL, pH 7. 5，121°C 灭菌 30min) 上，于29-31°C温控培养箱中培养3-5d后，挑出芽胞同步率高的菌株，经革兰氏染色后显微 镜检，选出有Bs形态特征的菌株转接到液体摇瓶发酵培养基B1 (大米粉30g，麦麸15g，硫 酸镁 0. 03g，硫酸亚铁 0. 002g，硫酸锌 0. 02g，碳酸钙 lg,7jC 1000mL，pH 7. 0-7. 5，121°C灭菌 30min)中，500mL摇瓶装量为25mL，摇床转速为200rpm，30°C摇瓶培养后，选出生长迅速的 菌种KN-48转接到试管斜面生长后于4°C保种。2. BsKN-48 菌种的鉴定对BsKN-48菌株进行了形态和生理生化特征研究，测定BsKN-48菌株的16SrDNA 共1244个有效碱基，根据枯草芽孢杆菌在Genebank中的16SrDNA序列进行分子鉴定，结合 分类资料(伯杰氏细菌手册)鉴定KN-48菌株为枯草芽胞杆菌。BsKN-48菌株于2009年 12月28日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC N0.M209317。3.高产Bs KN-48的培养基优化采用Box-Behken设计的响应面实验，首先从众多碳源(玉米淀粉、葡萄糖、乳 糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、大米粉、土豆淀粉或玉米粉)、氮源(水解植物复合氨基酸、棉 籽粉、豆粕、花生粕、蛋白胨、酵母粉、玉米浆粉、玉米浆、鱼粉、大豆蛋白、谷氨酸钠、天门冬 氨酸或硫酸铵)、无机离子{氯化钴(CoCl2)、碳酸钙(CaCO3)、硫酸镁(MgSO4)、磷酸二氢 钾(KH2PO4)、氯化钠(NaCl)、硫酸亚铁(FeSO4)、氯化锰(MnCl2)、硫酸铜(CuSO4)或硫酸锌 (ZnSO4)I中选择重要的部分因子筛选设计，利用合理的试验设计，考虑多个因素之间的协 同作用，用于寻找临近最大值的优化区域的最陡坡试验(Path of Steepest Ascent)和 用于优化响应面最大值的中心组合设计(Central Composite Design)来拟合因子与响应 值(芽孢数)之间的函数关系，通过对回归方程的分析，得到B-48发酵培养基(大米粉 28. 84g/L，玉米淀粉18. 21g/L，酵母粉27. 92g/L，玉米浆30. 05g/L,豆粕3. 88g/L，磷酸二氢 钾(KH2PO4) 0. 5g/L，硫酸镁(MgSO4)O. 06g/L，氯化钠(NaCl) 3g/L，碳酸钙(CaCO3) lg/L)。4.液体深层高密度补料发酵技术提高发酵生物量采用Box-Behken设计的响应面实验优化的发酵培养基进行分批发酵动力学研 究，以发酵前期(0-4小时)、对数期(4-15小时)和稳定期(15-24小时)的溶氧(》3ppm)、5PH(6. 5-7. 5)和放罐芽胞数(》140亿)为指标，确定各时期迟缓期、对数生长期和稳定期 最佳营养平衡(以C/N表示)，及与芽胞形成关系。在分批发酵研究基础上，优化高密度补 料发酵工艺。5.特殊、高效的芽胞提取与回收工艺芽胞提取与回收工艺发酵罐酸化2N稀盐酸，PH4. 2，升温35 °C，80目过滤，加 3. 18%。(质量比)硫酸锌(ZnSO4),搅拌3分钟，再加2. 27%。(质量比)黄血盐，搅拌1分 钟，静置15分钟，离心菌浆进行喷雾干燥，喷雾干燥进口风温200°C，出口风温85-87°C，原 粉活芽胞数达10，000亿/克。发明的目的在于对筛选的生长迅速、生物量高、产芽胞同步率高的枯草芽胞杆 菌菌株，采用培养基的优化和高密度发酵工艺、高效芽胞回收工艺，生产出活芽胞数达到 10，000亿/克的枯草芽胞杆菌安全原粉(原药)，远高于国内通常采用的固体发酵方式生 产的枯草杆菌制剂(有效活菌数一般在200亿cfu/g左右)和部分厂家采用液体发酵产品 (芽胞数一般为1000-2000亿cfu/g)。一种10，000亿活芽胞每克枯草芽胞杆菌原粉的制备方法，其步骤是1. BsKN-48 菌种的筛选从全国各地不同土壤和水体中收集富含芽孢杆菌芽胞的土样和水样，将样品用无 菌水稀释到100-200个芽胞/ml水，涂布在A1分离培养基上(豆饼粉30g，淀粉8g，酵母粉 10g，磷酸氢二钾0. 3g，硫酸镁(MgSO4)O. 3g，硫酸锰0. 05g，碳酸钙(CaCO3)O. lg，琼脂15g， 水IOOOmL, pH 7. 5，121°C灭菌30min)，于29_31°C温控培养箱中培养3_5d后，挑出芽胞同 步率高的菌株，经革兰氏染色后显微镜检，选出具有Bs形态特征的菌株转接到B1液体摇瓶 发酵培养基中(大米粉30g，麦麸15g，硫酸镁0. 03g,硫酸亚铁0. 002g,硫酸锌0. 02g,碳酸 钙lg，水lOOOmL，pH 7. 0-7. 5，121°C灭菌30min)，29_31°C摇瓶培养后，选出生长迅速(发 酵周期36小时以内)、生物量高(600nm可见光光密度0D_彡70)的菌种转接到试管斜面 生长后于4°C保种。2. BsKN-48 菌种的确认对BsKN-48菌株进行了形态和生理生化特征研究，测定BsKN-48菌株的16SrDNA 共1244个有效碱基，根据枯草芽孢杆菌在Genebank中的16SrDNA序列进行分子鉴定，结合 分类资料(伯杰氏细菌手册)鉴定KN-48菌株为枯草芽胞杆菌。BsKN-48菌株于2009年 12月28日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址中国.武汉.武汉大学，保藏号为 CCTCC NO. M209317，分类命名枯草芽胞杆菌 KN-48 (Bacillus subtilis KN-48) 3.高产BsKN-48的培养基优化采用Box-Behken设计的响应面实验，首先从众多因子中选择重要的部分因子筛 选设计，利用合理的试验设计，考虑碳源、氮源、无机离子等多个因素之间的协同作用，用于 寻找临近最大值的优化区域的最陡坡试验(Path of Ste印estascent)，和用于优化响应 面最大值的中心组合设计(Central Composite Design) 0来拟合因素与响应值之间的函 数关系，通过对回归方程的分析，设计优化B-48发酵培养基(大米粉28. 84g/L，玉米淀粉 18. 21g/L，酵母粉 27. 92g/L，玉米浆 30. 05g/L,豆粕 3. 88g/L，磷酸二氢钾(KH2PO4) 0. 5g/L， 硫酸镁(MgSO4) 0.06g/L，氯化钠(NaCl) 3g/L，碳酸钙(CaCO3) Ig)。4.液体深层高密度补料发酵技术提高发酵生物量采用Box-Behken设计的响应面实验优化的发酵培养基进行分批发酵动力学研 究，以发酵前期(0-4小时)、对数期(4-15小时)和稳定期(15-24小时)的溶氧(》3ppm)、 pH(6. 5-7. 5)和放罐芽胞数(》140亿)为指标，确定各时期迟缓期、对数生长期和稳定期 最佳营养平衡(以C/N表示)，及与芽胞形成关系。在分批发酵研究基础上，优化高密度补 料发酵工艺。5.特殊、高效的芽胞提取与回收工艺芽胞提取与回收工艺发酵罐酸化2N稀盐酸，？朋.2，升温351，80目过滤，加 3. 18%。(质量比)硫酸锌，搅拌3分钟，再加2. 27%。(质量比)黄血盐，搅拌1分钟，静置 15分钟，离心菌浆进行喷雾干燥，喷雾干燥进口风温200°C，出口风温85-87°C，枯草芽胞杆 菌原粉活芽胞数达10，000亿/克。6.活芽胞数检测称取0. 99g l.Olg试样到中性瓶中，加入IOOmL,浓度为0. 85% (质量比)水的 生理盐水，猛烈摇动混合均勻。再把混合瓶放在磁力搅拌器(CJJ-4上海君竺仪器制造有限 公司)平台上混合30min后，放入超声波水浴器(KQ-600B昆山市超声仪器有限公司)中超 声15min，然后再放在勻质器(Bagmixer 400W/P/VW)中混合lOmin。将处理好的试样溶液 依次稀释到10_8放入70°C水浴锅中水浴30min，然后稀释到10_9取0. ImL到每个营养琼脂 培养基平板中，用涂棒把试样溶液均勻涂布后，放在37°C恒温培养箱中培养16hr 20hr。 计平板上的菌落数，计算试样中枯草芽胞杆菌的芽胞数。本发明与现有技术相比具有以下优点和效果(1)处理方法能有效分散粉剂中粘结集聚的芽胞、杀灭热稳定性和生物活性不稳 定的无效芽胞，准确的检测出产品中有效活芽胞的数量；(2)重复性好；(3)检测过程不需要特殊昂贵的仪器；(4)成本低；(5)可以同时检测7-8个样品；(6)操作简单便于推广。该工艺安全、高效优质，方法易行，由该工艺生产的枯草芽胞杆菌原药中的活芽胞 数达10，000亿活芽胞每克，水份彡7%, pH:6. 0-9.0，细度(150 μ m)彡95%，噬菌体含量 <40个/10，000活芽胞。7特征的菌株转接到B1液体摇瓶发酵培养基(大米粉30g，麦麸15g，硫酸镁0. 03g,硫酸亚 铁 0. 002g，硫酸锌 0. 02g，碳酸钙 lg, 7jC IOOOmL, pH7. 0-7. 5，121°C灭菌 30min)中，500mL 摇 瓶装量为25mL，摇床转速为200rpm，30°C摇瓶培养后，选出生长迅速(发酵同期36小时以 内)、生物量高(600nm可见光光密度OD6tltl彡70)的菌种KN-48转接到试管斜面生长后于 4°C保种。2. BsKN-48 菌种的确认对KN-48菌株进行了形态和生理生化特征研究，根据该菌株的16SrDNA序列进行 分子分类。该菌株的16SrDNA共测定1244个有效碱基，系统发育资料及分类资料(伯杰氏 细菌手册)鉴定该菌株为枯草芽胞杆菌。该菌株于2009年12月28日在中国典型培养物 保藏中心保藏，保藏号为CCTCC N0.M209317。(1)菌种鉴定理化实验结果见下表

本发明公开了一种枯草芽胞杆菌及1万亿活芽胞每克枯草芽胞杆菌原粉的制备方法，枯草芽胞杆菌，CCTCCNO.M209317。其步骤A.Bs菌种的筛选，从土壤和水体中收集样品，加入无菌水，静置；B.Bs菌种的确认，该菌株的16SrDNA共测定1244个有效碱基；C.Bs培养基的筛选，采用Box-Behken设计的响应面实验，以芽胞数为筛选指标，从众多碳源、氮源和微量元素因子中确定最优因子；D.提高发酵生物量，以响应面法筛选的培养基进行分批发酵；E.芽胞提取与回收；F.活芽胞数检测，准确的检测出产品中有效活芽胞的数量；重复性好，成本低，同时检测7-8个样品，操作简单。生产的枯草芽胞杆菌原药清洁安全、回收率高、产品芽孢数稳定、活芽胞数达10,000亿活芽胞每克等优点。