专利名称：一种枯草芽孢杆菌及其制剂和制备方法以及应用的制作方法随着人们对于食品安全和环境保护的日益关注，“有机农业”已成为农业的发展方向，而开发出低毒、高效、低残留的纯天然生物农药已经成为近来农药研究的新方向。但由于生物农药的局限性，其通常药效较低，作用缓慢，价格高，所以难于被农民接受。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，对人畜无毒无害，不污染环境，具有显著的抗菌活性和极强的抗逆能力。枯草芽孢杆菌菌体生长过程中会产生枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。同时枯草芽孢杆菌还能分泌大量几丁质酶，几丁质酶可分解病原真菌的细胞壁而抑制真菌病害。枯草芽孢杆菌生长快、营养简单，能产生耐热、抗逆的芽孢，其芽孢具有抗逆性强、 利于保藏的特点，又能忍受极端的外部环境而长期存活，可以制成粉剂、可湿性粉剂等各种剂型或与化学农药混用而不失活。因此有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中的存活、定殖与繁殖，而且批量生产工艺简单，成本也较低，施用方便，储存期长，是一种理想的生防微生物。国内外学者在枯草芽孢杆菌防治植物病害方面进行了大量研究。一些枯草芽孢杆菌优势菌株已经作为生物农药投入到植物病害应用中。目前，该菌已在黄瓜、 辣椒、水稻、小麦、玉米、棉花等农作物上应用并显现出很好的病害防治效果。如申请号为 200910148250. 9的中国发明专利，公开了一种枯草芽孢杆菌微生物菌剂和复合微生物菌剂，该微生物菌剂和该复合微生物菌剂可以抑制茄子菌核菌和番茄灰霉菌等病原菌，克服现有技术中化学农药环保性差、易产生抗药性和安全性差等缺陷，以实现环保性好、不易产生抗药性和安全性好的优点。该微生物菌剂和复合微生物菌剂的抗菌谱较广，但是抗菌效果并不是很好，尤其是针对作物霉菌特别是霜霉菌的杀灭或抑制效果有待提高。
本发明的目的是为解决上述技术问题提供一种枯草芽孢杆菌。一种枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌的菌株已于2012年12月沈日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址北京市朝阳区人屯路，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 5652。该枯草芽孢杆菌的生物学命名为feciB^s subtilis。本发明的另一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌制剂，它是由所述的枯草芽孢杆菌菌株经过发酵制成，包含有枯草芽孢杆菌菌体及其次生代谢产物。作为上述技术方案的优选，所述制剂为可湿性粉剂。本发明的再一个目的是，提供所述的一种枯草芽孢杆菌制剂的制备方法。一种枯草芽孢杆菌制剂的制备方法，包括以下步骤①将取出的菌株进行转接活化培养，培养基选择为LB或PSA；②挑选活化的单菌落，再进行培养；③将培养好的液体菌种，按0.5 4%的接种量，接种到液体培养基中；④20 30°C培养1 3天；
所述液体培养基配方为以重量百分比计，麦芽糖0. 0.4%，玉米粉0. 5% 0. 8%，黄豆粉0. 4% 0. 9%，胰蛋白胨0. 5% 1. 0%, CaCl2 0. 02% 0. 08%,MnSO4 0. 05% 0. 08%, K2HPO4 0. 1% 0. 6%，余下为水。作为上述技术方案的优选，它还包括以下步骤
⑤将经过步骤④发酵培养所得发酵液通过干燥制得母粉，然后按比例加入载体填料、 助剂、稳定剂和保护剂经粉碎制得所述制剂；
所述比例为按质量百分比计，发酵液60 70%，助剂5 15%，稳定剂1 5%，保护剂 0. 05 0. 2%，载体填料补足100% ；
所述助剂为缩聚萘磺酸盐、木质素磺酸钠、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、聚乙二醇、烷基萘磺酸盐、烷基萘磺酸缩聚物钠盐、SDS、DBS中的一种或多种；
所述稳定剂为CaC03、K2HP04、K3PO4、羧甲基纤维素钠、CaCl2、NaCl中的一种或多种； 所述保护剂为玉米淀粉、大米粉、维生素C、羧甲基纤维素、糊精、荧光增白剂中的一种或多种；
所述载体填料为硅藻土、轻质碳酸钙、白炭黑、膨润土、滑石粉、高岭土中的一种或多种。作为上述技术方案的优选，所述液体培养基的pH为6. 0 8. 0。作为上述技术方案的优选，步骤②中，在挑选出活化的单菌落后，在新的LB或PSA 液体培养基中，在观 35°C，培养15 48小时。本发明的再一个目的是提供所述的菌种在制备防治作物霉菌病害的制剂方面的应用。本发明的再一个目的是提供所述制剂在防治作物霉菌病害方面的应用。本发明的还有一个目的是提供所述制剂在防治作物霜霉菌病害方面的应用。本发明具有以下有益效果
本发明所述枯草芽孢杆菌制剂主要来自枯草芽孢杆菌发酵，将发酵产物经适当处理后得到枯草芽孢杆菌制剂产品。通过体外植物活体试验表明，本发明所述的枯草芽孢杆菌制剂对防治作物霉菌病害方面具有一定的作用；尤其是对农作物的霜霉菌病具有显著的防治作用。

一种可湿性粉剂，它是通过以下方法制备的 1、液体发酵培养①菌种活化
菌株自-70°C冰箱取出后，经3次转接活化培养，培养基为液体种子培养基PSA ；
②种子菌液制备
挑取单菌落，在新的液体种子培养基PSA中，28°C，ISOrpm，培养15小时；
③将培养好的液体菌种，按0.5%的接种量，接种到液体培养基中；
④200rpm，20°C培养 3 天；
⑤将经过步骤④发酵培养所得发酵液通过干燥制得母粉，然后按比例加入载体填料、 助剂、稳定剂和保护剂，经粉碎制得所述制剂；
所述液体培养基配方为以重量百分比计，麦芽糖0. 2% ；玉米粉，0. 5% ；黄豆粉，0. 4% ； 胰蛋白胨，0. 5% ；CaCl2,0. 02% ；MnSO4,0. 05% ;Κ2ΗΡ04，0· 1% ；余下为水；所述液体培养基的ρΗ 为 7.0 ；
所述比例为按质量百分比计，发酵液60%，助剂5%，稳定剂1%，保护剂0. 05%,载体填料补足100% ；
所述助剂为缩聚萘磺酸盐、木质素磺酸钠、羧甲基纤维素钠三种； 所述稳定剂为羧甲基纤维素钠； 所述保护剂为糊精和荧光增白剂两种； 所述载体填料为硅藻土和轻质碳酸钙。实施例二
一种可湿性粉剂，它是通过以下方法制备的 1、液体发酵培养
①菌种活化
菌株自-70°C冰箱取出后，经3次转接活化培养，培养基为液体种子培养基LB ；
②种子菌液制备
挑取单菌落，在新的液体种子培养基LB中，30°C，200rpm，培养18小时；
③将培养好的液体菌种，按的接种量，接种到液体培养基中；
④230rpm，25°C 培养 2 天；
⑤将经过步骤④发酵培养所得发酵液通过干燥制得母粉，然后按比例加入载体填料、 助剂、稳定剂和保护剂经粉碎制得所述制剂；
所述液体培养基配方为以重量百分比计，麦芽糖0. 3% ；玉米粉，0. 6% ；黄豆粉，0. 6% ； 胰蛋白胨，0. 8% ；CaCl2,0. 05% ；MnSO4,0. 06% ;Κ2ΗΡ04，0· 4% ；余下为水；所述液体培养基的ρΗ 为 6.5 ；
所述比例为按质量百分比计，发酵液65%，助剂10%，稳定剂3%，保护剂0. 1%，载体填料补足100% ；
所述助剂为聚乙烯醇、聚乙二醇两种； 所述稳定剂为CaC03、CaCl2^NaCl三种； 所述保护剂为大米粉； 所述载体填料为白炭黑。实施例三
一种可湿性粉剂，它是通过以下方法制备的1、液体发酵培养
①菌种活化
菌株自-70°C冰箱取出后，经3次转接活化培养，培养基为液体种子培养基PSA ；
②种子菌液制备
挑取单菌落，在新的液体种子培养基PSA中，35°C，220rpm，培养20小时；
③将培养好的液体菌种，按4%的接种量，接种到液体培养基中；
④250rpm，30°C培养 1 天；
⑤将经过步骤④发酵培养所得发酵液通过干燥制得母粉，然后按比例加入载体填料、 助剂、稳定剂和保护剂经粉碎制得所述制剂；
所述液体培养基配方为以重量百分比计，麦芽糖0. 4% ；玉米粉，0. 8% ；黄豆粉，0. 9% ； 胰蛋白胨，1. 0% ；CaCl2,0. 08% ；MnSO4,0. 08% ;Κ2ΗΡ04，0· 6% ；余下为水；所述液体培养基的ρΗ 为 7.5 ；
所述比例为按质量百分比计，发酵液70%，助剂15%，稳定剂5%，保护剂0. 2%，载体填料补足100% ；
所述助剂为烷基萘磺酸盐、烷基萘磺酸缩聚物钠盐两种； 所述稳定剂为Κ2ΗΡ04、K3PO4两种； 所述保护剂为玉米淀粉、维生素C两种； 所述载体填料为膨润土和滑石粉。使用上述制剂对作物霜霉病进行测试，方法如下 称取0. 5g干粉菌剂溶于IOOml水中，搅拌均勻得菌悬液。选择一株真叶期长势一致盆栽植株，用油性记号笔写上标签编号，按序排放，供实验用。分别将实验组和阳性对照(嘧菌脂500倍液)的药液喷在植株真叶上，空白照组将清水喷在植株真叶上，以刚好不滴下液滴为准。喷雾处理后将试材在通风处阴干。孢子液制备，将叶片背面的孢子洗下后，观察，一个视野在100倍镜下大约有10 50个孢子左右即可使用。将孢子液均勻地喷到试材上，放在黑暗处处理M小时，之后正常的开关灯。培养温度25 °C左右，湿度80%左右。一般发病5 10天，可以查病。结果统计分级 0级无病；
1级病斑面积占整片叶面积的5%以下； 3级病斑面积占整片叶面积的6-10% ； 5级病斑面积占整片叶面积的11-20% ； 7级病斑面积占整片叶面积的21-40% ； 9级病斑面积占整片叶面积的40%以上。结果如下表


本发明涉及一种枯草芽孢杆菌菌种、利用所述菌种制成的制剂、所述制剂的制备方法、所述菌种在制备防治作物霉菌病害的制剂方面的应用和所述制剂在防治作物霉菌病害方面的应用，属于生物农药技术领域。本发明所述枯草芽孢杆菌的生物学命名为Bacillussubtilis，已于2012年12月26日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址:北京市朝阳区人屯路，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo.5652。通过体外植物活体试验表明，本发明所述的枯草芽孢杆菌制剂对防治作物霉菌病害方面具有一定的作用；尤其是对农作物的霜霉菌病具有显著的防治作用。