一种用于防治作物镰刀菌病害的枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法[0002]镰刀菌(Fusarium)属 半知菌亚门真菌,是一类世界性分布的真菌,它不仅可以在土壤中越冬越夏，还可侵染多种植物(粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物)，引起植物的穗腐、根腐、茎腐、茎基腐、花腐等多种病害，寄主植物达100余种，侵染寄主植物维管束系统，破坏植物的输导组织维管束，并在生长发育代谢过程中产生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，影响产量和品质。其中以禾谷镰孢菌、尖孢镰孢菌引起的病害最为严重，给农业生产带来巨大的经济损失。[0003]禾谷键抱菌(Fusariumgraminearum Schw.),有性态为 Gibberella zeae Schw.petch.称玉蜀黍赤霉。该菌能引起田间小麦、大麦等禾本科作物的病害。由禾谷镰孢菌引起的小麦赤霉病菌不仅影响小麦产量，而且其产生的真菌毒素污染产品质量，严重威胁人畜健康。尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是一种世界性分布的土传病原真菌,寄主范围广泛，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种植物枯萎病的发生。镰刀菌引起的小麦赤霉病、爺科(番爺)、瓜类(西瓜)枯萎病，是生产上防治最艰难的重要病害之一。[0004]目前，农业生产中防治由镰刀菌引起的小麦赤霉病、番茄枯萎病、西瓜枯萎病主要以多菌灵、戊唑醇等化学杀菌剂为主。但是，随着多菌灵等杀菌剂的长期使用已导致使用次数和用药浓度增加，也提高了病原菌产生对杀菌剂的抗性的风险。同时，由于化学杀菌剂的广谱性，大量使用不但破坏了微生态环境，而且导致非靶标抗性。[0005]相对于化学杀菌剂，生物防治剂和天然产物的使用，尤其是微生物杀菌剂的使用具有更加诱人的前景。一方面微生物是地球上最庞大的生物类群，具有广泛的生物多样性，还可以通过生物工程技术大幅度提高目标物质的产量，易于实现工业化生产；另一方面，微生物杀菌剂较化学农药更加安全，易降解，合成成本较低。[0006]在种类繁多的微生物群体中芽孢杆菌是研究最多的生防菌候选菌，已证明芽孢杆菌属中的许多种都具有合成抗菌活性物质一抗菌多肽的能力，而且芽孢杆菌可以形成芽孢，细胞壁不含内毒素，除个别种外绝大多数对人畜无害，具有较强的抗逆性和良好的环境适应性及环境友好性，是最理想的微生物杀菌剂资源。[0007]虽然很多种芽孢杆菌都已被开发用于制备微生物杀菌剂，但由于芽孢杆菌种群即菌株的多样性，不同芽孢杆菌乃至同一芽孢杆菌的不同菌株均具有不同的抗菌谱、抗菌活性和抗菌特点，筛选具有不同作用对象的高效芽孢杆菌生防菌剂仍是现在乃至今后相对长一段时间内各国科研工作关注的课题。

[0008]本发明提供了一种枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌对由镰刀菌引起的小麦赤霉病的防治效果达60%以上。
[0009]—种枯草芽孢杆菌，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),株号为BS101,已于2013年6月18日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为=CGMCCN0.7727。
[0010]本发明还提供了一种含有所述枯草芽孢杆菌的生防菌剂。该生防菌剂中，所述枯草芽孢杆菌的浓度优选为I X IO9~10lclCFU/mL，更优选为I X 109CFU/mL。
[0011]本发明还提供了一种所述生防菌剂的制备方法，包括:
[0012](I)将所述枯草芽孢杆菌接种于培养液中培养至培养液OD6tltl为0.5~0.8，获得种子液；
[0013]所述培养液可选用LB液体培养基，其配方为:氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，调节pH值为7.0 ；
[0014](2)将种子液接种于发酵培养基中扩大培养，调节发酵液中枯草芽孢杆菌的浓度至I X IO9~101QCFU/mL，获得所述生防菌剂。
[0015]其中，所述种子液的接种量优选为I~2%;所述发酵培养基的配方为:葡萄糖，18 ~22g ;L-谷氨酸，2.4 ~2.6g ;L_ 天门冬酰胺，2.4 ~2.6g ;ΚΗ2Ρ04，0.8 ~1.2g ;MgSO4.7Η20，0.4 ~0.6g ；KC1,0.4 ~0.6g ;酵母粉，0.8 ~1.2g ;L_ 苯丙氨酸，2 ~3 X l(T3g ；MnSO4.H2O, 5 ~6 X l(T3g ；CuSO4.5H20,0.16 ~0.18 X l(T3g ；FeS04.7H20,0.15 ~
0.17X10_3g ;调节 pH 值为 7.0ο
[0016]作为进一步优选，所述发酵培养基的配方为:葡萄糖，20g;L-谷氨酸，2.5g;L-天门冬酰胺，2.5g ；KH2PO4, Ig ；MgS04.7Η20，0.5g ；KC1,0.5g ;酵母粉，Ig ；L-苯丙氨酸，
2X l(T3g ；MnSO4.H2O, 5 X l(T3g ；CuSO4.5H20,0.16 X l(T3g ；FeS04.7H20,0.15 X l(T3g ;调节 pH值为7.0。该发酵培养基由Landy培养基改良而来，更有利于本发明所述枯草芽孢杆菌的增殖。
[0017]本发明中，所述扩大培养是在200L发酵罐中进行的，扩大培养的温度为28~30°C，时间为36~48h ;发酵液pH值维持在7.0，溶氧量20%，通气量5-7m3/小时，转速240~260r/min，罐压0.05-0.1KPa0发酵液出罐后梯度稀释涂板检测并调节菌悬液浓度为IXlO9 ~1010CFU/mL。
[0018]本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌在拮抗镰刀菌中的应用。在平板拮抗试验中，BSlOl菌株对禾谷镰孢菌、尖孢镰刀菌的抑菌圈半径分别20mm、18mm。其中，BSlOl菌株对禾谷镰孢菌PH-1的EC50为10CFU/mL ；BS101菌株的发酵液上清能强烈抑制禾谷镰孢菌PH-1孢子的萌发，处理后的孢子不能形成芽管，出现明显的肿胀、消解等畸形。
[0019]本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌在防治`小麦赤霉病中的应用，包括:在小麦齐穗期或扬花初期(扬花约5-20%),将枯草芽孢杆菌菌悬液均匀喷施在小麦穗部；所述枯草芽孢杆菌菌悬液的浓度为IX IO8~109CFU/mL。
[0020]BSlOl菌株能够显著抑制禾谷镰孢菌PH-1在扬麦18和济麦22品种麦穗上的生长及致病性，防治效果分别可达91.96%，97.05%。经分析，BSlOl菌株在抑制禾谷镰孢菌PH-1生长的同时，能抑制禾谷镰孢菌真菌毒素DON (脱氧雪腐镰刀菌烯醇)的产生，与对照组相t匕，BSlOl菌株处理后DON毒素含量降低4.5倍，从而防止病害发生。[0021 ] 将BSIOI菌株应用于田间防治小麦赤霉病时，其防治效果稳定在60%以上，显示出较好的应用前景。
[0022]本发明的枯草芽孢杆菌或生防菌剂还可用于防治由镰刀菌侵染引起的茄科(如番茄)枯萎病、瓜类(如西瓜)枯萎病。在这方面应用时，将本发明的生防菌剂经兑水稀释后浇灌至番茄、西瓜等作物的根部，稀释后枯草芽孢杆菌的菌液浓度为IX IO8~109CFU/mL。
[0023]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
[0024]本发明的枯草芽孢杆菌对镰刀菌具有高效拮抗作用，能用于由镰刀菌侵染引起的小麦赤霉病、茄科枯萎病、瓜类枯萎病等的防治，田间防治的防治效率稳定在60%以上。



[0025]图1为生防菌BSlOl的菌落形态图；
[0026]图2a为生防菌BSlOl对禾谷镰孢菌PH-1的平板拮抗效果图；其中左侧为平板背面，右侧为平板正面；
[0027]图2b为生防菌BSlOl对尖孢镰刀菌的平板拮抗效果图；其中左侧为平板背面，右侧为平板正面；
[0028]图3a为不同含菌量的BSlOl和PY79平板对禾谷镰孢菌PH-1的抑制效果图；其中，箭头表示WA平板中BSlOl和PY79的含菌量(Log1(lCFU/mL)逐渐变大；“ΡΗ_1”表示PH-1直接接种在不含生防菌的WA平板上生长的菌落；
[0029]图3b为生防菌BSlOl对禾谷镰孢菌PH-1的EC50测定结果图；其中，折线为各生防菌浓度下对应PH-1菌落直径的点连线，直线为折线的趋势线；
[0030]图4生防菌BSlOl的发酵液上清抑制禾谷镰孢菌菌丝生长的活性测试图；
[0031]图5为H20、PY79发酵液上清和BSlOl发酵液上清处理后禾谷镰孢菌PH-1孢子的萌发示意图；
[0032]图6a为光照培养箱内H20、PY79、BSlOl和氰烯菌酯对济麦22的赤霉病防治效果图；
[0033]图6b为光照培养箱内H20、PY79、BSlOl和氰烯菌酯对扬麦18的赤霉病防治效果图；
[0034]图7a为H20、PY79、BSlOl和氰烯菌酯处理后麦粒的表面形态图；
[0035]图7b为H20、PY79、BSlOl和氰烯菌酯处理后麦粒上DON毒素的含量图。

[0036]实施例1含BSlOl菌株的生防菌剂的制备
[0037]1BS101菌株的获取
[0038]BSlOl菌株分离自江苏省海安县小麦麦穗上。取小麦麦穗磨碎，80°C水浴10分钟后涂布于LB平板上；次日挑取菌落进行纯化培养。菌株BSlOl在培养基上菌落表面粗糙、不透明，呈现皱缩、白色(见图1)，能够形成芽孢，能移动，需氧型。16S rDNA序列如SEQ IDN0.1所示，序列在NCBI中的比对结果显示与枯草芽孢杆菌的同源性最高。
[0039]2生防菌剂的制备
[0040](I)将BSlOl菌株接种到LB培养液中，于30°C下，180rpm振荡培养12~16小时后在超净工作台中分别取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零；
[0041]LB培养液的配方为:氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，调节pH值为
7.0 ；
[0042](2)当培养至OD6tltl值在0.5~0.8之间时，将种子菌液以1:100体积比加入装有发酵培养液的200L发酵罐中，30°C 250rpm振荡培养20~24小时，发酵液pH值维持在7.0，溶氧量20%，通气量5-7m3/小时，罐压0.05-0.1KPa0发酵液出罐后梯度稀释涂板检测并调节菌悬液浓度约为I X 109CFU/mL,获得生防菌剂。
[0043]发酵培养液的配方为:葡萄糖，20g;L_谷氨酸，2.5g;L_天门冬酰胺，2.5g;KH2PO4, Ig ；MgS04.7Η20，0.5g ；KC1,0.5g ;酵母粉，Ig ;L_ 苯丙氨酸，2X 10_3g ；MnSO4.H2O,5X 10_3g ；CuSO4.5Η20，0.16X 10_3g ；FeS04.7Η20，0.15X10、；调节 pH 值为 7.0。
[0044]实施例2BS101菌株对禾谷镰孢菌的拮抗活性
[0045]1BS101菌株对禾谷镰孢菌的平板拮抗活性测定
[0046]采用对峙培养法，将保存于4° C中的禾谷镰孢菌PH-1 (模式菌)接种到PDA平板上活化，待真菌长满平板后用灭菌的打孔器从菌落外边缘均匀的打成直径为6_的圆形菌块。将菌丝块接种在WA平板(WA培养基/L:蛋白胨5g，葡萄糖10g，肉汁浸膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，pH=7.0)的中心，在其四周距中心约25mm处分别接种BS101，试验以枯草芽孢杆菌模式菌株PY79、清水 及化学农药氰烯菌酯为对照组。25。C培养，待菌丝长满平板后记录抑菌圈的大小。
[0047]根据抑菌圈的大小对BSlOl拮抗禾谷镰孢菌PH-1、尖孢镰刀菌的活性进行评估:Omm无抑制作用；< 2mm有轻微的抑制作用；2_5mm中等抑制作用；> 5mm较强的抑制作用。抑制率根据式(I)进行计算:
[0048]抑制率=[(R「R2)/R1] X 100% (I)；
[0049]其中，R1为对照病原菌的菌落半径；R2为病原菌在细菌方向的菌落半径。
[0050]检测结果如图2a和2b所示。由图2a可见，BSlOl菌株对禾谷镰孢菌PH-1菌丝生长具有较强的抑制效果，抑菌圈半径为20mm，菌丝抑制率为80% ;由图2b可见，对尖孢镰孢菌菌丝生长具有较强的抑制效果，抑菌圈半径为18mm，菌丝抑制率为78% ;清水处理组无拮抗效果。
[0051]2BS101菌株抑制禾谷镰孢菌菌丝生长的EC50
[0052]向50°C的WA培养基中加入梯度稀释的BSlOl菌株，使BSlOl的终浓度依次为107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL,制备含生防菌 BSlOl 的 WA 平板。
[0053]在平板中央接种禾谷镰孢菌PH-1菌碟，25°C培养至无生防菌WA平板上菌丝长满平板时统计数据并进行分析(见图3a和图3b)，测量含各梯度生防菌平板中PH-1菌落的大小，计算半最大效应浓度(EC50 )。
[0054]由图3b可见，随着平板中含菌量的升高，对菌丝抑制率增加。统计结果显示，平板含菌量与抑制率呈现线性关系:
[0055]Υ=-0.25χ+1.975 (R2=0.9346) (2)；
[0056]其中，X为BSlOl菌株浓度Log1(lCFU/mL，Y为处理组中PH-1菌落直径；R2表示趋势线的估计值与对应的实际数据之间的拟合程度。
[0057]通过式(2)计算，当平板中BSlOl菌量约为10CFU/mL时，能抑制50%禾谷镰孢菌菌丝生长，即BSlOl对禾谷镰孢菌的EC50=10CFU/mL。
[0058]3生防菌剂无菌上清抑制禾谷镰孢菌菌丝生长的活性
[0059]将实施例1获得的生防菌BSlOl菌株发酵液，10，OOOrpm,离心IOmin后取无菌上
清。无菌上清经细菌滤器(0.22 μ m)过滤后待用。
[0060]向50°C WA培养基中加入禾谷镰孢菌PH-1的孢子，至孢子终浓度为IO5个/mL。将含PH-1孢子的WA培养基倒入9cm直径的平板中，每平板倒入20mL。待冷却凝固后，用7mm直径的打孔器在平板的对称位置打4个孔，每孔分别加入25 μ L制备的无菌上清，以培养液和氰烯菌酯为对照组。25°C静止培养后观察抑菌圈。检测结果如图4所示。由图4可见，该无菌上清能有有效抑制菌丝生长，抑制圈半径为5mm，10倍浓缩无菌上清的抑菌圈半径为 8mm η
[0061]4生防菌剂无菌上清抑制禾谷镰孢菌孢子萌发的活性
[0062]在含2%蔗糖的清水、ΡΥ79发酵液上清以及BSlOl发酵液上清中分别加入终浓度为IO4个/mL的禾谷镰孢菌PH-1的孢子，每个处理组各取IOyL孢子悬浮液置于载玻片上(作5次重复);玻片置于保湿盒中25°C静止培养，每隔I小时观察各处理组的孢子萌发情况，计算萌发率。
[0063]由图5可见，无菌上清能强烈抑制禾谷镰孢菌孢子的萌发，BSlOl发酵液上清处理的PH-1孢子不能形成芽管，出现明显的肿胀、消解等畸形。对孢子诱导萌发，6小时、10小时后分别统计各处理组的孢子萌发率，统计结果见表1。
[0064]表1各处理组的禾谷镰孢菌孢子萌发率
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